專(zhuān)利名稱(chēng)：雙溫快循環(huán)熒光定量pcr端粒酶活性的檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR端粒酶活性的檢測(cè)方法和試劑盒。該方法應(yīng)用錨定發(fā)夾引物(Anchored hairpin structural primer, ΑΗΡ)及復(fù)合式蝎形引物 (Duplex scorpion primer，DS)，在熒光定量PCR儀上，采用雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件，進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)。即為用DS/AHP-TRAP(錨定發(fā)夾引物及復(fù)合式蝎形引物-端粒重復(fù)序列擴(kuò)增分析法)檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒。
背景技術(shù)：
端粒酶(Telomerase)是廣譜腫瘤標(biāo)志物，它在近90 %的癌癥中都有高頻率的表達(dá)，而良性、癌前病變以及癌周?chē)慕M織中，一般無(wú)表達(dá)。端粒酶活性的測(cè)定具有直接性、高敏感性和強(qiáng)特異性，可作為一個(gè)獨(dú)立的惡性腫瘤早期診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷的指標(biāo)。而且作為分子診斷手段，端粒酶活性檢測(cè)明顯優(yōu)于腫瘤臨床病理分期、組織學(xué)分型或細(xì)胞分化程度等現(xiàn)有細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)。它尤其對(duì)篩查或診斷無(wú)癥狀的早期癌癥，具有特殊的價(jià)值； 對(duì)于那些形態(tài)學(xué)上良惡性難以鑒別的腫瘤，是判斷腫瘤惡性程度有用的指標(biāo)；作為肝細(xì)胞癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，可預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。另一方面，端粒酶也是腫瘤治療的最佳靶點(diǎn)之一，由于端粒酶在腫瘤細(xì)胞與正常體細(xì)胞之間的差別，端粒酶抑制劑可減少對(duì)機(jī)體的毒副作用。因此，抗端粒酶療法已成為腫瘤治療的一種新方法。圍繞端粒酶抑制劑的研究也在如火如荼地進(jìn)行著，而端粒酶活性測(cè)定則是評(píng)價(jià)藥物的重要指標(biāo)。總之，端粒酶活性的測(cè)定可用于癌癥早期診斷、癌癥預(yù)后、癌癥的基因治療和抗癌藥物研發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域。因此，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究開(kāi)發(fā)端粒酶活性檢測(cè)的新方法，為腫瘤防治提供技術(shù)上的保障，加速臨床應(yīng)用的進(jìn)程，是十分必要的。檢測(cè)端粒酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法是端粒重復(fù)序列擴(kuò)增分析法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP, Kim N. W. , Piatyszek Μ. Α. , Prowse K. R. , Harley C. B., West Μ. D. ,Ho P. L. C.，Coviello G. Μ. ,Wright W. Ε. ,Weinrich S. L.，Shay J. W. ,Science, 1994，266，2011-2015)。該法主要分為三個(gè)步驟1)延伸階段，底物在端粒酶的作用下延伸，其3'-端加入若干TTAGGG的重復(fù)序列；2) PCR擴(kuò)增階段，端粒酶延伸產(chǎn)物擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍以上；3)產(chǎn)物的檢測(cè)階段。TRAP法巧妙地將PCR技術(shù)應(yīng)用于端粒酶活性檢測(cè)中，極大地提高了檢測(cè)的靈敏度，與常規(guī)的PCR擴(kuò)增不同，TRAP方法檢測(cè)的不是樣本中核酸的量，而是端粒酶活性。 因此在PCR擴(kuò)增之前，端粒酶首先對(duì)底物進(jìn)行延伸，產(chǎn)生端粒酶延伸產(chǎn)物，隨后通過(guò)對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增，達(dá)到檢測(cè)端粒酶活性的目的。TRAP法的模板分子——端粒酶延伸產(chǎn)物序列很特殊，由底物序列和多個(gè)不等的端粒重復(fù)序列組成。因此，在以底物序列為正向引物的TRAP法中，反向引物CX設(shè)計(jì)為有三個(gè)錯(cuò)配堿基的端粒重復(fù)序列的互補(bǔ)序列。然而由于端粒酶延伸產(chǎn)物含有多個(gè)端粒重復(fù)序列，因此，在PCR反應(yīng)的每一輪循環(huán)時(shí)，它仍可結(jié)合在端粒重復(fù)序列的任意部位，甚至在同一時(shí)間同一條模板分子上都可能會(huì)有多于一個(gè)的CX 引物開(kāi)始延伸。這導(dǎo)致了 TRAP法得到的PCR產(chǎn)物的個(gè)數(shù)與端粒酶延伸產(chǎn)物不完全一致。從而干擾檢測(cè)結(jié)果。改進(jìn)PCR反向引物的新方法，如CX-ext、CXa弓丨物、錨定引物ACX、發(fā)夾型引物以及雙反向引物-TRAP法等，均極大地減少了副產(chǎn)物的生成。其中錨定引物在5'-末端加入了一段與端粒序列無(wú)關(guān)的錨定序列，使得PCR產(chǎn)物5'-末端被非端粒序列封閉，阻止端粒酶產(chǎn)物在此端的延伸。從而避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，因而得到廣泛的應(yīng)用。但是該方法在不進(jìn)行熱啟動(dòng)時(shí)，會(huì)有非特異性產(chǎn)物生成。除此之外，TRAP法尚有許多常規(guī)PCR的不足之處，如終點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果，因此，勞動(dòng)強(qiáng)度大、定量不準(zhǔn)確、重現(xiàn)性差；同時(shí)，在測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物前須打開(kāi)反應(yīng)管，易造成污染。因此，難以滿足臨床應(yīng)用的要求。熒光定量PCR技術(shù)巧妙地將PCR擴(kuò)增、熒光探針雜交和光學(xué)檢測(cè)結(jié)合于一體，通過(guò)微機(jī)控制，對(duì)PCR每一輪循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并自動(dòng)報(bào)告分析結(jié)果。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、安全、 自動(dòng)化程度高。不需要PCR后處理，從而從根本上解決了產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題。而且特異性、靈敏度和重現(xiàn)性顯著提高。同時(shí)，由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期(原始模板以相對(duì)固定的指數(shù)形式增長(zhǎng))進(jìn)行定量檢測(cè)，從而真正在技術(shù)上實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。目前，Intergen公司已推出能量轉(zhuǎn)移引物實(shí)時(shí)定量檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒 (TRAPeze XL)。但該法無(wú)法消除反向引物不確定退火帶來(lái)的影響，因此，特異性和有效性受到質(zhì)疑。且試劑盒價(jià)格昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高。另外，有報(bào)道將DNA嵌插試劑SYBR Green和 TRAP法結(jié)合，用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè)端粒酶活性。然而，非特異性以及所用試劑的昂貴也是阻礙其走向臨床應(yīng)用的最大絆腳石。本申請(qǐng)人在TRAP法基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了復(fù)合式蝎形引物，該引物由兩條單標(biāo)記的寡核苷酸鏈組成，其中一條為探針引物鏈(Probe-Primer，PP)，該鏈在引物序列與探針序列之間用PCR阻斷劑(PCR-blocker)連接，以阻止PCR產(chǎn)物沿探針序列延伸；另一條為猝滅探針鏈 (Quencher Probe, QP)，由標(biāo)記有猝滅基團(tuán)的探針互補(bǔ)序列組成，用于猝滅探針引物發(fā)出的熒光。復(fù)合式蝎形引物具有引物和探針的雙重功能。它通過(guò)在檢測(cè)步驟中形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致探針引物鏈與猝滅探針鏈徹底分離，發(fā)出熒光從而實(shí)現(xiàn)端粒酶活性的定量分析 (黃艷萍，孔德明，張曉濱，沈含熙，宓懷風(fēng)，復(fù)合式蝎形引物實(shí)時(shí)定量檢測(cè)端粒酶延伸產(chǎn)物， 化學(xué)學(xué)報(bào)，2004，62，274-278)。 TRAP由于采用石蠟覆蓋的熱啟動(dòng)方法，要在PCR反應(yīng)前進(jìn)行繁瑣的加熱和冷卻過(guò)程，且石蠟層兩側(cè)液體的混合在實(shí)際操作中也存在著一定的困難，往往達(dá)不到預(yù)定的效果。 為此本申請(qǐng)人設(shè)計(jì)出了一類(lèi)新的發(fā)夾型引物(Hairpin structural primer，HP)。該引物 5'-末端具有與3'-端的堿基互補(bǔ)的序列，可在TRAP法開(kāi)始階段，處于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，無(wú)法行使引物延伸功能。因此實(shí)現(xiàn)了 TRAP檢測(cè)中PCR熱啟動(dòng)的自動(dòng)化，增加了檢測(cè)的專(zhuān)一性(黃艷萍，孔德明，柴鼎賡，沈含熙，宓懷風(fēng)，用凝膠電泳研究發(fā)夾型引物基因檢測(cè)惡性腫瘤預(yù)警標(biāo)志物端粒酶活性，現(xiàn)代儀器，2004，10 41-3)。然而由于TRAP法中PCR的擴(kuò)增的模板序列為底物序列及多個(gè)不等長(zhǎng)的端粒重復(fù)序列，因此PCR反應(yīng)不可避免引入非特異性產(chǎn)物，干擾檢測(cè)結(jié)果。因此本申請(qǐng)?jiān)谝延泄ぷ鞯幕A(chǔ)上對(duì)HP引物進(jìn)行了再次的改進(jìn)，以降低實(shí)時(shí)檢測(cè)的背景熒光，增加了 PCR反應(yīng)的特異性。同時(shí)，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N以絕對(duì)值來(lái)表示端粒酶活性的方法(Kim N. W.，Wu F.，Nucleic Acids Res.，1997，25，2595-2597)，從而進(jìn)一步確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法和試劑盒，以消除復(fù)雜的PCR反應(yīng)后的檢測(cè)過(guò)程，減少非特異性產(chǎn)物生成，提高檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，并可進(jìn)行大批量樣品的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明提供的一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法包括如下步驟(1)永生化細(xì)胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物定量標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備；(2)在熒光定量PCR儀上，將錨式發(fā)夾型引物(AHP)與復(fù)合式蝎形引物(DS)結(jié)合， 組成一個(gè)新的DS/AHP-TRAP體系，在雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件下，完成對(duì)細(xì)胞樣品中端粒酶活性及標(biāo)準(zhǔn)溶液中端粒酶延伸產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)；(3)根據(jù)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，得到兩組定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，從檢測(cè)端粒酶活性定量曲線及端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線的吻合圖上，得到以人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物的總量，即TPG值表示細(xì)胞中端粒酶活性的定量方法。所述的錨定發(fā)夾型引物為5' -GCGCGGTTAGGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3’其中，下劃線部分為發(fā)夾的莖部，中間未劃線部分為與靶序列互補(bǔ)的引物序列， 5' _端的未劃線部分為錨定序列(見(jiàn)附

圖1)。發(fā)夾型結(jié)構(gòu)在引物分子內(nèi)部能形成獨(dú)特的莖環(huán)狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)夾型結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn) PCR反應(yīng)的自動(dòng)熱啟動(dòng)，增加了 PCR反應(yīng)的專(zhuān)一性，減少了非特異性產(chǎn)物的生成；錨定結(jié)構(gòu)是在5'-末端加入了一段與延伸無(wú)關(guān)的錨定序列，使得PCR產(chǎn)物5'-末端被非端粒序列封閉，阻止端粒酶產(chǎn)物在此端的延伸。選擇的復(fù)合式蝎形引物為引物探針，包括探針引物(probe-primer，PP)和猝滅探針(quencher probe, QP)兩部分，序列分別為PP :FAM-5' -「CCCTAAL-阻斷劑-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘(阻斷劑為三個(gè)碳原子的碳鏈，帶下劃線的為探針序列)Qp 5' -IttagggIs-S‘ -DABCYL所述的雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件為95°C 0s,45°C 3s，引物延伸在溫度轉(zhuǎn)換過(guò)程中進(jìn)行，在30個(gè)循環(huán)數(shù)內(nèi)完成對(duì)樣品中端粒酶活性的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。所述的人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6為含有6個(gè)端粒重復(fù)序列的端粒酶延伸產(chǎn)物， 即5' -AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG] 6-3 ‘TPG (total product generated，總生成產(chǎn)物)值代表端粒酶活性反應(yīng)產(chǎn)生的端粒酶延伸產(chǎn)物的總量。在細(xì)胞樣品定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的吻合圖上，假設(shè)1個(gè)TPG相當(dāng)于1個(gè)永生化細(xì)胞拷貝數(shù)，得到一個(gè)TPG為0. 0058amol 的寡核苷酸R6。本發(fā)明提供的雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法的檢測(cè)步驟如下1.樣品的制備1)永生化細(xì)胞蛋白提取液l，10，102，103，104/yL的永生化細(xì)胞樣品；2)陰性對(duì)照樣品；3)人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6標(biāo)準(zhǔn)溶液3300，330，33，3. 3，0. 33，0. 033amol/y L 的 R6(1_6)標(biāo)準(zhǔn)溶液。2. DS/AHP-TRAP法反應(yīng)前的準(zhǔn)備1)反應(yīng)混合液1 X TRAP緩沖液，1. 5mmol/ LMgCl2,各 50 μ mol/L 的 dATP，dTTP, dCTP, dGTP, 0. 21 μ mol/L 的 ΑΗΡ, 2U TaqDNA 聚合酶， 0. 5 μ mol/L的PP鏈及1. 0 μ mol/L的QP鏈，2 μ L樣品溶液。反應(yīng)液總體積為25 μ L ;2) DS/ AHP-TRAP法反應(yīng)條件采用30°C下30min進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng)，隨后采用94°C Os, 45°C 3s 的雙溫快循環(huán)的方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。3. DS/AHP-TRAP法的測(cè)定1)永生化細(xì)胞蛋白提取液實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的測(cè)定；2)DS/ AHP-TRAP試劑盒定量工作曲線的確定將人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6(1_e)標(biāo)準(zhǔn)溶液及一系列細(xì)胞樣品及按以上條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到兩組擴(kuò)增曲線。4.數(shù)據(jù)處理1)永生化細(xì)胞蛋白提取液工作曲線在細(xì)胞樣品擴(kuò)增曲線上設(shè)定熒光閾值，得到不同樣品的Ct值。繪制細(xì)胞拷貝數(shù)IO4 10的范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)DS/ AHP-TRAP試劑盒定量工作曲線及TPG值的確定同法繪制定量標(biāo)準(zhǔn)品R6的工作曲線，并與永生化細(xì)胞定量標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。從端粒酶活性定量曲線及端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線的吻合圖上，得到以TPG值表示細(xì)胞中端粒酶的活性的定量方法。即根據(jù)假設(shè)1個(gè)TPG為1個(gè)拷貝數(shù)，確定TPG代表的定量標(biāo)準(zhǔn)物R6的量，從而可用TPG值表示細(xì)胞中端粒酶的活性。本發(fā)明提供的一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒包括
權(quán)利要求
1.一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于它包括如下步驟1)永生化細(xì)胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物定量標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備；2)在熒光定量PCR儀上，將新型錨式發(fā)夾型引物與復(fù)合式蝎形引物結(jié)合，組成一個(gè)新的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增分析法體系，在雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件下，完成對(duì)細(xì)胞樣品中端粒酶活性及標(biāo)準(zhǔn)溶液中端粒酶延伸產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)；3)根據(jù)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，得到兩組定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即檢測(cè)端粒酶活性定量曲線和端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線，在這兩組定量標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合圖上，得到以人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物的總量，即TPG值表示細(xì)胞中端粒酶活性的定量方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的錨定發(fā)夾型引物為5' -GCGC GGTTAGGG CTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3’其中，下劃線部分為發(fā)夾的莖部，中間未劃線部分為與靶序列互補(bǔ)的引物序列， 5'-端的未劃線部分為錨定序列；復(fù)合式蝎形引物為引物探針，包括探針引物和猝滅探針兩部分，序列分別為PP :FAM-5 ‘ -rCCCTAAl,-阻斷劑-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘；阻斷劑為三個(gè)碳原子的碳鏈，帶下劃線的為探針序列QP 5' ITTAGGGlr3' —DABCYL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件為 94°C0s，45°C 3s，樣品中端粒酶活性的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)可在30個(gè)循環(huán)數(shù)內(nèi)完成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物為含有6 個(gè)端粒重復(fù)序列的端粒酶延伸產(chǎn)物R6，即5 ‘ -AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]6_3 ‘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的用TPG值表示細(xì)胞中端粒酶的活性， 是根據(jù)假設(shè)1個(gè)TPG為1個(gè)永生化細(xì)胞產(chǎn)生的端粒酶延伸產(chǎn)物，確定TPG代表的定量標(biāo)準(zhǔn)物R6的量，即一個(gè)TPG為0. 0058amol的R6時(shí)，一個(gè)TPG相當(dāng)于一個(gè)永生化細(xì)胞。
6.一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟1)樣品的制備a)永生化細(xì)胞蛋白提取液10，102，103，104/yL的永生化細(xì)胞樣品； b)陰性對(duì)照樣品；c)人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6標(biāo)準(zhǔn)溶液3300，330，33，3. 3，0. 33， 0. 033amol/μ L 的 R6(1_6)標(biāo)準(zhǔn)溶液；2)反應(yīng)液的制備1XTRAP緩沖液，1. 5mmol/L MgCl2，各 50 μ mol/L 的 dATP，dTTP， dCTP, dGTP, 0. 21 μ mol/L 的 ΑΗΡ, 2U Taq DNA 聚合酶，0. 5 μ mol/L 的 PP 鏈及 1. 0 μ mol/L 的 QP鏈，2 μ L樣品溶液，反應(yīng)液總體積為25 μ L ；反應(yīng)條件采用30°C下30min進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng)，隨后采用94°C 0s,45°C 3s的雙溫快循環(huán)的方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)測(cè)定a)永生化細(xì)胞蛋白提取液實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的測(cè)定；b)試劑盒定量工作曲線的確定將人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6(1_6)標(biāo)準(zhǔn)溶液及一系列細(xì)胞樣品及按以上條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到兩組擴(kuò)增曲線；4)數(shù)據(jù)處理a)永生化細(xì)胞蛋白提取液工作曲線在細(xì)胞樣品擴(kuò)增曲線上設(shè)定熒光閾值，得到不同樣品的Ct值；繪制細(xì)胞拷貝數(shù)IO4 10的范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；b)試劑盒定量工作曲線及TPG值的確定同法繪制定量標(biāo)準(zhǔn)品R6的工作曲線，并與永生化細(xì)胞定量標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。從端粒酶活性定量曲線及端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線的吻合圖上，得到以TPG 值表示細(xì)胞中端粒酶的活性的定量方法。
7. —種權(quán)利要求1所述的雙溫快循環(huán)熒光定量PCR檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒，其特征在于它包括洗液H印es-KOH 10mmol/L pH 7. 5, MgCl2 1. 5mmol/L, KCl 10mmol/L, DTT lmmol/L ； 細(xì)胞裂解液Tris-HCl 10mmol/L pH 7. 5, EGTA lmmol/L, MgCl2 lmmol/L, β-巰基乙醇 5mmol/L，甘油 10%，CHAPS 0. 5%, PMSF 0. lmmol/L ；10XTRAP 緩沖液Tris-HCl 200mmol/L pH = 8. 3, lOmmol/L EGTA, 630mmol/L KCl, 0. 05% Tween-20, lmg/mL BSA ；復(fù)合式蝎形引物 PP :FAM"5‘ -rCCCTAAl,-阻斷劑-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3‘ PP+QP 阻斷劑為三個(gè)碳原子的碳鏈，帶下劃線的為探針序列， QP 5' ITTAGGGlr3' "DABCYL ；定量標(biāo)準(zhǔn)物 R6 5 ‘ -AATCCGTCGAGCAGAGTTAG [GGTTAG] 6_3 ‘； AHP 5' -GCGC GGTTAGGG CTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3'；附25mmol/L MgCl2,2. 5mmol/L dNTP 含 dATP，dTTP, dCTP, dGTP 各 2. 5mmol/L,5U/ul Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR端粒酶活性的檢測(cè)方法和試劑盒。引物-錨定發(fā)夾引物(AHP)與復(fù)合式蝎形引物(DS)結(jié)合組成DS/AHP-TRAP體系，在雙溫快循環(huán)PCR條件下完成對(duì)永生化細(xì)胞蛋白提取液中端粒酶活性的檢測(cè)。它是以含6個(gè)端粒重復(fù)序列的端粒酶延伸產(chǎn)物R6為定量標(biāo)準(zhǔn)物，繪制檢測(cè)端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線。通過(guò)比較永生化細(xì)胞樣品及R6的兩組定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到檢測(cè)端粒酶活性定量曲線及端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線的吻合圖。假設(shè)1個(gè)TPG值為1個(gè)永生化細(xì)胞產(chǎn)生的端粒酶延伸產(chǎn)物，確定TPG值代表R6的量。本發(fā)明的試劑盒可在熒光定量PCR儀上，更簡(jiǎn)便、更快捷、大批量地完成端粒酶活性的實(shí)時(shí)檢測(cè)。在惡性腫瘤早期診斷及抗癌藥物篩選方面具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK102220418SQ20111010139
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者劉照勝, 湯華, 黃艷萍 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)