專利名稱：甜瓜抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的兩個(gè)CAPs標(biāo)記與使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩個(gè)位于甜瓜抗白粉病基因Pm-AN兩側(cè)，并與Pm-AN緊密連鎖的兩個(gè)共顯性CAPs分子標(biāo)記及使用方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記僅是指DNA標(biāo)記，是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映，一般所稱的分子標(biāo)記概念即被界定在這個(gè)范疇之內(nèi)。生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的可遺傳變異，都是由于DNA堿基序列變異所 致。同一物種內(nèi)存在極為豐富的DNA堿基序列變異，為開(kāi)發(fā)和利用分子標(biāo)記奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。DNA分子標(biāo)記是指生物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增或兩者結(jié)合等措施處理后電泳，檢測(cè)到的反映基因組某種變異特征的特異性DNA片段。分子標(biāo)記與其他遺傳標(biāo)記相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受發(fā)育時(shí)期、組織器官、環(huán)境條件的影響；(2)數(shù)量極多，幾乎遍及整個(gè)基因組；(3)分子標(biāo)記的等位位點(diǎn)變異水平比表型標(biāo)記豐富得多，即多態(tài)性很高，以致無(wú)須專門(mén)創(chuàng)造特殊的遺傳材料；(4)分子標(biāo)記對(duì)生物體通常沒(méi)有不良影響，也不影響生物性狀的表現(xiàn)，即表現(xiàn)為“中性”；(5)許多分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，能鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息；(6)信息量大，分析效率高；(7)穩(wěn)定遺傳，可靠性強(qiáng)，重現(xiàn)性好；⑶速度快，操作簡(jiǎn)便。分子標(biāo)記的這些優(yōu)點(diǎn)，使它在生命科學(xué)的理論和應(yīng)用研究中具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，分子生物學(xué)發(fā)展異常迅速，與作物遺傳育種密切相關(guān)的分子標(biāo)記更是令人矚目，使得植物育種中的“間接選擇”已經(jīng)成為可能，大大地提高了遺傳分析的準(zhǔn)確性和選育品種的有效性，在遺傳育種領(lǐng)域愈來(lái)愈受到重視，將二者有機(jī)結(jié)合是今后育種工作的趨勢(shì)。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有 RFLP、RAPD, AFLP, SSR、SNP、SCAR、SRAP, STS、EST 等。CAPs (cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites) CAPs 技術(shù)又稱為PCR-RFLP。是用特異設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)材料時(shí)，由于特定位點(diǎn)的堿基突變、插入或缺失數(shù)很少，以至無(wú)多態(tài)出現(xiàn)，往往需要對(duì)相應(yīng)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切處理，以檢測(cè)其多態(tài)性。CAPs標(biāo)記在二倍體植物研究中可發(fā)揮巨大的作用。該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)首先是共顯性從而可以區(qū)分純合體與雜合體基因型，其次是很高的穩(wěn)定性與可靠性。甜瓜白粉病是甜瓜主要病害之一，培育抗白粉病甜瓜品種是甜瓜抗病育種的重要目標(biāo)。新疆是厚皮甜瓜的次生起源中心，以哈密瓜為代表的我國(guó)厚皮甜瓜品種大多易感白粉病。傳統(tǒng)育種的方法難以區(qū)分純合與雜合基因型，難以實(shí)現(xiàn)不同抗白粉病基因的聚合，更無(wú)法選擇在抗病基因附近發(fā)生重組的個(gè)體。本發(fā)明提供了引進(jìn)抗病品種安農(nóng)二號(hào)抗白粉病基因Pm-AN兩側(cè)各一個(gè)CAPs分子標(biāo)記，通過(guò)這兩個(gè)與抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的標(biāo)記進(jìn)行輔助育種克服了上述困難，可以大大提高甜瓜抗白粉病新品種的育種效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種甜瓜抗白粉病基因連鎖的共顯性分子標(biāo)記及使用方法，通過(guò)本發(fā)明中的分子標(biāo)記可以判斷出甜瓜個(gè)體抗病或感病兩種基因型，因此提高甜瓜抗白粉病個(gè)體的選擇目的性與選擇效率。用于甜瓜抗白粉病分子標(biāo)記輔助育種。為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案與抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的兩個(gè)CAPs分子標(biāo)記，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO :1 8所述的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 1是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記RPW的上游引物RPWl的序列。 序列表中SEQ ID NO 2是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記RPW的下游弓丨物RPW2的序列。序列表中SEQ ID NO 3是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記RPW在抗病品種中的特異擴(kuò)增片段的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 4是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記RPW在感病品種中的特異擴(kuò)增片段的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 5是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記MRGH63B的上游弓I物MRGH63BI的序列。序列表中SEQ ID NO 6是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記MRGH63B的上游引物MRGH63B2的序列。序列表中SEQ ID NO 7是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記MRGH63B在抗病品種中的特異擴(kuò)增片段的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 8是抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的CAPs標(biāo)記MRGH63B在感病品種中的特異擴(kuò)增片段的DNA序列。與抗白粉病基因Pm-AN緊密連鎖的兩個(gè)CAPs分子標(biāo)記，其使用方法包括以下步驟取甜瓜抗病與感病雜交分離后代個(gè)體組織材料，提取甜瓜基因組DNA，使用RPW和MRGH63B特異性擴(kuò)增引物對(duì)甜瓜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，抗病品種和感病品種中兩個(gè)CAPs標(biāo)記擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序得到基因序列分別如序列表SEQ ID NO :3 4和SEQ ID N0:7 8所示，使用限制性內(nèi)切酶Alu I和Msp I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到如附圖I和附圖2所示的高低不同的DNA條帶。上述基因組DNA提取方法、PCR反應(yīng)體系與條件,酶切反應(yīng)體系與條件同實(shí)施例所述?？共√禺惼斡捎诒粌?nèi)切酶切開(kāi)，因此出現(xiàn)兩條較小條帶。感病特異片段不能被內(nèi)切酶切開(kāi)，因此出現(xiàn)一條較大條帶。根據(jù)該結(jié)果可以判斷甜瓜個(gè)體的感病或抗病基因型基因型，也可以判斷出在抗病基因與CAPs標(biāo)記RPW和MRGH63B之間是否發(fā)生重組。從而進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受田間白粉病發(fā)病的影響。2.分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，能鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息。3.應(yīng)用該標(biāo)記輔助選擇甜瓜抗白粉病品種可大大提高選擇效率。4.可用該標(biāo)記實(shí)現(xiàn)不同抗白粉病基因分子聚合。5.通過(guò)選擇抗白粉病基因Pm-AN與兩個(gè)緊密連鎖的分子標(biāo)記之間發(fā)生重組的個(gè)體，可以打破抗白粉病基因與不利基因的連鎖，避免連鎖累贅。6.通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，無(wú)需操作復(fù)雜的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。


圖I是標(biāo)記PRW在兩個(gè)親本和F2不同個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中箭頭所指為電泳條帶大小。圖2是標(biāo)記MRGH63B在兩個(gè)親本和F2不同個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中箭頭所指為電泳條帶大小。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例通過(guò)甜瓜抗白粉病基因Pm-AN連鎖的分子標(biāo)記選擇純合抗病株系I.實(shí)驗(yàn)材料甜瓜作圖親本材料安農(nóng)二號(hào)和哈密瓜K413由新疆國(guó)家瓜類工程技術(shù)研究中心提供。安農(nóng)二號(hào)由林德佩教授于1986年從日本引進(jìn),優(yōu)質(zhì)高產(chǎn),抗白粉病、蔓割病、病毒病、霜霉病和枯萎病等多種病害，果實(shí)呈圓形，白皮白肉有網(wǎng)紋，小果型厚皮甜瓜(15CmX12Cm)。K413為典型的哈密瓜類型甜瓜植株抗病性差，果實(shí)橢圓形，黃皮黃肉，口感脆，瓜型大(30cmX 16cm)。2.實(shí)驗(yàn)方法2. I新疆甜瓜基因組DNA的提取(I)取50mg左右新鮮甜瓜葉片于EP管中，加入0. 4ml的2 X CTAB緩沖液，用研磨研磨，65°C水浴0. 5h，期間輕輕搖勻I次；
(2)取出離心管冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24 I)，輕緩顛倒混勻；(3)室溫下 12000r/min 離心 IOmin ；(4)將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻；(5) 12000r/min 離心 IOmin,棄上清；(6)將沉淀溶于20 U I雙蒸水中，-20°C保存。2. 2DNA模板的PCR擴(kuò)增RPff標(biāo)記和的MRGH63B標(biāo)記弓丨物序列RPffl (引物 I) GCATTGGGTGTTCCGTTTARPW2 (引物 2) CAGTTGGGTAATCGGGAGMRGH63B1 (引物 I) GAACATCTCATCCCTCAAGTTMRGH63B2(引物 2) GGAAGAACAGAGCCAAAGAA反應(yīng)總體積20 U I,體系如下。PCRBuffer(IOX)2|il
dNTP Mixture (各 IOmM)0.4卩1
引物 1(50_)0.2(^1
引物 2(50pM)0.2^1
酶(5U/V1)0.2^1
模板DNA1^1
ddH2011卩1預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序如下
Step I94 °C2min
Step 294 °C30s
Step 356 °C30s
Step 472 °Clmin
Step 5Goto Step 230 Cycles
Step 672 °C7min
Step 74°CooPCR反應(yīng)結(jié)束后，取6 U I預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增效果。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ddH20稀釋后作為下面選擇性擴(kuò)增的模板。2. 3樣品DNA的酶切分別用種限制性內(nèi)切酶Alul，Msp I對(duì)RPW標(biāo)記和的MRGH63B標(biāo)記的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，反應(yīng)體積為10 U 1，混勻后37°C水浴4h。
PCR產(chǎn)物5pl
10 X Buffer'2卩1
內(nèi)切酶0.15nl
ddH202.85^1反應(yīng)結(jié)束后，I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切是否完全。3.結(jié)果記錄與分析含抗白粉病基因Pm-AN的安農(nóng)二號(hào)的基因組DNA用RPWl和RPW2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)AluI酶切產(chǎn)生265bp和380bp的條帶，而感病品種K413基因組PCR產(chǎn)物經(jīng)AluI酶切后產(chǎn)生645bp的條帶。含抗白粉病基因Pm-AN的安農(nóng)二號(hào)的基因組DNA用MRGH63B1和MRGH63B2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Msp I酶切產(chǎn)生139bp和103bp的條帶，而K413基因組PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切后產(chǎn)生242bp的條帶。在安農(nóng)二號(hào)和K413雜交143個(gè)F2個(gè)體中，發(fā)現(xiàn)2株在RPW標(biāo)記與白粉病基因位點(diǎn)之間發(fā)生重組，一株RPW標(biāo)記僅有645bp條帶，即表現(xiàn)純合感病親本的基因型，植株為抗病，因此該植株具有抗白粉病基因，而且在抗白粉病基因一側(cè)很近的距離內(nèi)發(fā)生了重組，可以用于打破不利基因的連鎖累贅；另一株表現(xiàn)RPW標(biāo)記表現(xiàn)為雜合體基因型，植株表現(xiàn)出感病。其余141株RPW標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與抗病性表現(xiàn)一致。在安農(nóng)二號(hào)和K413雜交143個(gè)F2個(gè)體中，發(fā)現(xiàn)2株在RPW標(biāo)記與白粉病基因位點(diǎn)之間發(fā)生重組，一株RPW標(biāo)記僅有240bp條帶，即表現(xiàn)純合感病親本的基因型，植株為抗病，因此該植株具有抗白粉病基因，而且在抗白粉病基因一側(cè)很近的距離內(nèi)發(fā)生了重組，可以用于打破不利基因的連鎖累贅；另一株表現(xiàn)RPW標(biāo)記表現(xiàn)為雜合體基因型，植株表現(xiàn)出感病。其余141株RPW標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與抗病性表現(xiàn)一致。
該區(qū)域經(jīng)遺傳連鎖作圖分析表明，RPW標(biāo)記和MRGH63B標(biāo)記分別位于抗白粉病基因Pm-AN兩側(cè)I. 4cM和2cM。同時(shí)使用兩個(gè)標(biāo)記對(duì)分離后代基因型進(jìn)行判斷準(zhǔn)確率為100%。安農(nóng)二號(hào)和K413雜交143個(gè)F2個(gè)體中，使用兩個(gè)共顯性標(biāo)記鑒別出純合抗病個(gè)體共36株，自交后代不發(fā)生抗病分離，這些個(gè)體用于選育抗白粉病新種質(zhì)和新品種。
權(quán)利要求
1.甜瓜抗白粉病的共顯性CAPs分子標(biāo)記RPW，其特征在于使用序列表中SEQID NO:I 2所述的DNA引物序列可擴(kuò)增獲得，包含SEQ ID NO :3 4的基因序列。
2.甜瓜抗白粉病的共顯性CAPs分子標(biāo)記MRGH63B，其特征在于使用序列表中SEQIDNO :5 6所述的DNA引物序列可擴(kuò)增獲得，包含SEQ ID NO :7 8的基因序列。
3.如權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記，其特征在于通過(guò)引物SEQID NO :1 2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，經(jīng)Alu I酶切在抗白粉病材料和感白粉材料產(chǎn)生多態(tài)。
4.如權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記，其特征在于通過(guò)引物SEQID NO :5 6進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，經(jīng)MspI酶切在抗白粉病材料和感白粉材料產(chǎn)生多態(tài)。
5.如權(quán)利要求I和權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記的使用方法，其特征在于通過(guò)提取甜瓜組織DNA，用SEQID NO :1 2和SEQ ID NO :5 6的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶Alu I及Msp I酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判斷植株是否含有抗白粉病基因Pm-AN，基因型是否純合，以及該基因兩側(cè)的兩個(gè)甜瓜CAPs分子標(biāo)記之間是否發(fā)生重組。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩個(gè)位于甜瓜抗白粉病基因Pm-AN兩側(cè)，并與Pm-AN緊密連鎖的兩個(gè)共顯性CAPs分子標(biāo)記及使用方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將該標(biāo)記用于甜瓜抗白粉病分子標(biāo)記輔助育種，可大大提高甜瓜抗白粉病育種目的性與育種效率。該標(biāo)記的適用不受田間發(fā)病因素影響，可以有效選擇出純合抗病基因型和雜合抗病基因型個(gè)體、在抗白粉病基因兩側(cè)發(fā)生重組的基因型個(gè)體，該標(biāo)記可以用于抗病分子聚合育種，且不涉及轉(zhuǎn)基因安全性問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747070SQ20111010150
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者寧雪飛, 李冠, 王賢磊, 馬東建, 高興旺 申請(qǐng)人:新疆大學(xué)