專(zhuān)利名稱(chēng)：一種瘧疾通用型及其分型的巢式pcr檢測(cè)及熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種瘧疾通用型及其分型的巢式PCR 檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒可檢測(cè)瘧原蟲(chóng)屬特異性和惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、 三日瘧等四種瘧原蟲(chóng)種特異性。
背景技術(shù)：
瘧疾診斷金標(biāo)準(zhǔn)是鏡檢，它不但需要操作者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且當(dāng)原蟲(chóng)密度較低時(shí)，鏡檢容易出現(xiàn)漏診；即使是有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)鏡檢員檢測(cè)原蟲(chóng)低密度樣本，鏡檢的敏感性和特異性也會(huì)顯著下降。對(duì)于國(guó)內(nèi)少見(jiàn)的卵形瘧和三日瘧，容易發(fā)生錯(cuò)判。傳統(tǒng)鏡檢法的局限性以及熟練鏡檢人員的缺乏導(dǎo)致瘧疾病例的確診與鑒別診斷困難，成為瘧疾監(jiān)測(cè)中新的挑戰(zhàn)。而且發(fā)生瘧原蟲(chóng)混合感染時(shí)，鏡檢不易將惡性瘧的環(huán)狀體或早期滋養(yǎng)體與間日瘧的環(huán)狀體區(qū)分開(kāi)，特別是用藥后蟲(chóng)體形態(tài)發(fā)生變化，蟲(chóng)種鑒別較難，容易出現(xiàn)誤診，這樣影響了瘧原蟲(chóng)感染后的治療。因此，使用傳統(tǒng)的鏡檢法作“金”標(biāo)準(zhǔn)已難于評(píng)價(jià)效率較高的診斷方法。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外將巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于瘧疾的快速檢測(cè)和分型，它能準(zhǔn)確判斷疑似病例是否感染瘧疾或攜帶瘧原蟲(chóng)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)和采取必要的防控措施， 防止該傳染病在國(guó)境口岸的傳入和傳出。但是，目前還缺乏可以檢測(cè)瘧原蟲(chóng)屬特異性和惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、三日瘧等四種瘧原蟲(chóng)分型的方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種瘧疾通用型及其分型的巢式PCR及熒光PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能檢測(cè)瘧原蟲(chóng)屬特異性和惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、三日瘧等四種瘧原蟲(chóng)分型，用該試劑盒檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了一例國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)的輸入性卵形瘧疾病例。本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明的瘧疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR 緩沖液和Taq DNA聚合酶混合物，還包括如表1所列的引物及探針(如SEQ ID N0:l_26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表堿基A或C，R代表堿基A或G。所述分型包括惡性瘧、間日瘧、卵形瘧和三日瘧四種型別。所述核酸序列如SEQ ID N0:l-3所示的弓丨物及探針用于瘧疾通用型熒光PCR檢測(cè)。所述核酸序列如SEQ ID N0:4-6所示的引物及探針用于惡性瘧的熒光PCR檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ ID NO: 7-9所示的引物及探針用于間日瘧的熒光PCR檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ ID N0:10-ll所示的引物用于卵形瘧的熒光PCR 檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ IDNO :12-14所示的引物及探針用于三日瘧的熒光PCR檢測(cè)。所述核酸序列如SEQ ID NO :15-18所示的引物用于瘧疾通用型巢式PCR檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ ID NO 15-16及19-20所示的引物用于惡性瘧巢式PCR檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ ID NO :15-16及21-22所示的引物用于間日瘧巢式PCR檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ ID NO:
315-16及23-24所示的引物用于卵形瘧巢式PCR檢測(cè)，所述核酸序列如SEQ IDNO :15_16及 25-26所示的引物用于三日瘧巢式PCR檢測(cè)。通用型巢式PCR 檢測(cè)用 rPLUout-FP、rPLUout-RP、rPLUin-FP、rPLUin-RP 引物；分型巢式PCR檢測(cè)用rPLUout-FP、rPLUout-RP及檢測(cè)惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、三日瘧的特異性引物；熒光PCR檢測(cè)分別用通用型或惡性瘧、間日瘧、三日瘧特異性的引物及熒光標(biāo)記探針；卵形瘧熒光檢測(cè)用OVA-FP和OVA-RP引物。各引物探針序列(為5’ -3’ )如下表1所示，表1是瘧原蟲(chóng)巢式PCR及熒光PCR檢測(cè)的弓I物和探針。表 1
wwcwwsssscssssscM ； I ggggggggggggsgggggggggggwgggggggggsa'i'i'i'i Ι ' 'i'i'iiwwwww I ； Ksssscsssssfflw^w^^maaaaaa^iwwffffwmff^gggggwgggwwccwwmw^^^w^wwm·—.................................................................................................................................... ； ) imgmwwffff sggggg ggg6-u----j------gggggsgggggeMssasM
引物和探針名稱(chēng)序列(5’ -3’ )備注
Plas-FPAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA擴(kuò)增長(zhǎng)度 73bP
Plas-RPTCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT
Plas-ProFAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB
FAL-FPCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA
FAL-RPTATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA FAL- Pro FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1
VIV-FPACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT
VIV-RPACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC VIV- Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQ1
OVA-FPATTAATGTGTCCTTTTCCCTATTCT
OVA-RPGCTTTACAATCAAACGAATACATTC
MAL-FPCCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAA
MAL-RPAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
MAL-ProFAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGB
rPLUout-FPTCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA
rPLUout-RPCCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC
rPLUin-FP rPLUin-RP rFAL-FP rFAL-RP rVIV-FP rVIV-RP rOVA-FP rOVA-RP rMAL-FP
rMAL-RP
惡性瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)度 99bp
間日瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)度122bP
卵形瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)度 88bp
三日瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)度108bp
第一次擴(kuò)增
AAGGATAACTACGGAAAAGCTGT TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC TTAAACTGGTTTGGGAAAAC ACAATGAACTCAATCATGACTACC CTTCTAGCTTAATCCACATAACTG ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC CGGGGAAATTTCTTAGATTGC GAGAAAC.AGC.ATGAATTGCG AACAWAGTTGTACRTTAAGAATAAACGC
AATTCCCATGCATAAAAAATTAYACAAA
第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度240bp 惡性瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)
度 204bp 間日瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)
度 119bp 卵形瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)
度 456bp 三日瘧，擴(kuò)增長(zhǎng)度141bp 使用了如下的軟件進(jìn)行上述引物探針的設(shè)計(jì)使用Lasergene軟件包的EditSeq 和MegAlign工具進(jìn)行DNA序列分析和同源性比較。用Primer Express3. O軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)所需的特異性引物和FAM熒光探針，用Primer Premier 5. O軟件設(shè)計(jì)一般的PCR引物。
4
上述試劑盒的使用方法(1)通用型巢式 PCR 檢測(cè)用 rPLUout-FP、rPLUout-RP、rPLUin-FP、rPLUin-RP 引物；進(jìn)行巢式PCR第一次擴(kuò)增時(shí)，使用rPLUout-FP、rPLUout-RP進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。進(jìn)行巢式PCR第二次擴(kuò)增時(shí)，使用rPLUin-FP、rPLUin-RP引物，PCR反應(yīng)程序?yàn)?940C 2min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。(2)分型巢式PCR檢測(cè)用rPLUout-FP、rPLUout-RP及檢測(cè)惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、 三日瘧的特異性引物；進(jìn)行巢式PCR第一次擴(kuò)增時(shí)，使用rPLUout-FP、rPLUout-RP進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。進(jìn)行巢式PCR第二次擴(kuò)增時(shí)，使用惡性瘧、間日瘧、卵形瘧和三日瘧特異性引物， PCR 反應(yīng)程序?yàn)?MV 2min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。(3)熒光PCR檢測(cè)分別用通用型或惡性瘧、間日瘧、三日瘧特異性的引物及熒光標(biāo)記探針；使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix進(jìn)行體系配置，反應(yīng)總體積 20 μ 1，包括主反應(yīng)混合液10μ 1、10μΜ正向引物1μ 1、10μΜ反向引物1μ 1、5μΜ探針 1 μ 1、DNA 7 μ 1，同時(shí)分別以DEPCH2O和DNA陽(yáng)性模板作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增和檢測(cè)在 ABI 7900HTFast熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5°C 20s ；95°C ls，58°C 20s，40個(gè)循環(huán)，在58 °C收集熒光。 (4)卵形瘧熒光檢測(cè)用OVA-FP和OVA-RP引物進(jìn)行卵形瘧的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)采用染料摻入法進(jìn)行卵形瘧的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)。反應(yīng)引物為OVA-FP和0VA-RP，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 15min ；94°C 15s， 50°C 30s, 72°C 30s (收集熒光)，40個(gè)循環(huán)；最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。上述試劑盒可以應(yīng)用在臨床、口岸檢驗(yàn)中。本發(fā)明的試劑盒能檢測(cè)瘧原蟲(chóng)屬特異性和惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、三日瘧等四種瘧原蟲(chóng)分型，而且還能發(fā)現(xiàn)一例國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)的輸入性卵形瘧疾病例。該試劑盒能應(yīng)用于臨床、 口岸中瘧疾的檢驗(yàn)。


圖1為瘧原蟲(chóng)通用型巢式PCR檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖；圖2為瘧原蟲(chóng)的特異性巢式PCR檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖；圖3為瘧原蟲(chóng)的鏡檢與熒光PCR比較檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖；圖3-1為40份鏡檢陽(yáng)性的樣本的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖3-2為20份鏡檢陰性的樣本的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖4為瘧原蟲(chóng)的熒光PCR分型檢測(cè)結(jié)果圖；圖4-1為三日瘧的引物探針的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖4-2為惡性瘧的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖4-3為間日瘧的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖4-4為輸入性卵形瘧的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖；圖4-5為輸入性卵形瘧的熔解曲線(xiàn)分析圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用的樣本、試劑及瘧原蟲(chóng)DNA的提取方法等說(shuō)明如下樣本來(lái)源30份瘧疾鏡檢陽(yáng)性血樣由云南省寄生蟲(chóng)病防治所提供，10份瘧疾鏡檢陽(yáng)性血樣和20份瘧疾鏡檢陰性血樣為國(guó)境口岸入境發(fā)熱患者的抗凝血，由發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。樣本采集均為靜脈取血，2% EDTA-Na2抗疑，-20°C低溫保存。試劑全血DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Extraction Minikit)和染料摻入法熒光PCR試劑(QuantiTect SYBR Green PCR Kit)購(gòu)自Qiagen公司，探針?lè)晒釶CR試劑 (TaqMan Fast Universal PCRMaster Mix)購(gòu)自 ABI 公司，Taq DNA 聚合酶購(gòu)自 Roche 公司，IOObpDNA Ladder Marker、DL2000DNA Marker 和瓊脂糖購(gòu)自 TaKaRa 公司。瘧原蟲(chóng)DNA提取參照全血DNA提取試劑盒(QIAampDNA Blood ExtractionMinikit)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 提取的總DNA于_20°C低溫保存。(1)在1. 5ml離心管底加入20 μ 1蛋白酶K。(2)加200 μ 1血樣至離心管中，如果樣本不足200 μ 1，用PBS補(bǔ)齊。(3)加200 μ 1緩沖液AL至離心管中，脈沖振蕩15s混勻。(4) 56°C孵育 IOmin。(5)短暫離心。(6)加入200 μ 1無(wú)水乙醇，脈沖振蕩15s混勻。短暫離心。(7)將第六步的混合液吸至過(guò)濾柱上，6000g離心lmin。將過(guò)濾柱置于干凈的收集管上。(8)打開(kāi)過(guò)濾柱蓋子，加入500 μ 1洗液AW1，蓋上蓋子，6000g離心lmin。將過(guò)濾柱置于干凈的收集管上。(9)打開(kāi)過(guò)濾柱蓋子，加入500 μ 1洗液AW2，蓋上蓋子，20000g離心3min。將過(guò)濾柱置于干凈的收集管上。(10) 20000g 離心 lmin.(11)將過(guò)濾柱置于1.5ml離心管上，打開(kāi)蓋子，加入200 μ 1緩沖液AE或無(wú)菌雙蒸水，室溫放置lmin，6000g離心lmin。(12)洗脫下來(lái)的液體即為瘧疾的DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析取5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，GelGreen染色，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察結(jié)果并拍照。DNA序列測(cè)定
6
擴(kuò)增的PCR片段由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，再對(duì)堿基組成進(jìn)行 BLAST比較分析。實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒及在瘧疾通用型巢式PCR檢測(cè)中應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例本發(fā)明的的瘧疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，包括PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶混合物，還包括如表1所列的引物及探針(如 SEQ IDNO 1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表堿基A或C，R代表堿基A 或G。瘧疾通用型巢式PCR檢測(cè)中，可用外引物和瘧疾的通用型內(nèi)引物，引物序列(為 5’ -3’ )如下外引物rPLUout-FP TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGArPLUout-RP CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC檢測(cè)瘧疾的通用型內(nèi)引物rPLUin-FP AAGGATAACTACGGAAAAGCTGTrPLUin-RP TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC。實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒及在瘧疾通用型巢式PCR檢測(cè)中應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例本發(fā)明的的瘧疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，包括PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶混合物，還包括如表1所列的引物及探針(如 SEQ IDNO 1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表堿基A或C，R代表堿基A 或G。瘧疾通用型巢式PCR檢測(cè)中，可用外引物和檢測(cè)惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、三日瘧的特異性引物，引物序列(為5’ -3’ )如下外引物rPLUout-FP TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGArPLUout-RP CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC檢測(cè)惡性瘧的引物rFAL-FP TTAAACTGGTTTGGGAAAACrFAL-RP ACAATGAACTCAATCATGACTACC檢測(cè)間日瘧的引物rVIV-FP CTTCTAGCTTAATCCACATAACTGrVIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC檢測(cè)卵形瘧的引物rOVA-FP CGGGGAAATTTCTTAGATTGCr0VA-RP GAGAAACAGCATGAATTGCG檢測(cè)三日瘧的引物rMAL-FP AACAffAGTTGTACRTTAAGAATAAACGCrMAL-RP AATTCCCATGCATAAAAAATTAYACAAA。
M代表堿基A或C，R代表堿基A或G，W代表A或T，Y代表C或T。實(shí)施例3 本發(fā)明的試劑盒及在卵形瘧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例本發(fā)明的的瘧疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，包括PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶混合物，還包括如表1所列的引物及探針(如 SEQ IDNO 1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表堿基A或C，R代表堿基A 或G。卵形瘧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中，可用卵形瘧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物，引物序列(為 5’ -3’ )如下卵形瘧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物OVA-FP ATTAATGTGTCCTTTTCCCTATTCTOVA-RP GCTTTACAATCAAACGAATACATTC。實(shí)施例4 本發(fā)明的試劑盒及在熒光PCR通用型及分型檢測(cè)瘧疾中應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例本發(fā)明的的瘧疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，包括PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶混合物，還包括如表1所列的引物及探針(如 SEQ IDNO 1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表堿基A或C，R代表堿基A 或G。卵形瘧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中，可用通用型引物探針或惡性瘧、間日瘧、三日瘧特異性的引物及熒光標(biāo)記探針。引物探針序列(為5’ -3’ )如下通用型的熒光檢測(cè)引物及探針如下Plas-FP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGAPlas-RP TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTATPlas-Pro FAM-ACCGTCGTAATCTT-MGBM代表堿基A或C，R代表堿基A或G。惡性瘧的熒光檢測(cè)引物及探針如下FAL-FP CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAFAL-RP TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAAFAL-Pro FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1間日瘧的熒光檢測(cè)引物及探針如下VIV-FP ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTVIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCCVIV-Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQlR代表堿基A或G。三日瘧的熒光檢測(cè)引物及探針如下MAL-FP CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAMAL-RP AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAAMAL-Pro FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT—MGB。
實(shí)施例5 瘧原蟲(chóng)通用型巢式PCR檢測(cè)的應(yīng)用巢式PCR兩次擴(kuò)增的體系和條件略有不同。第一次擴(kuò)增時(shí)，PCR緩沖液2.5μ1， IOmM dNTP 0. 5 μ 1，IOmM rPLUout-FP 和 rPLUout-RP 弓 | 物各 0. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ 1，雙蒸水15. 75 μ 1，DNA模板5 μ 1，總體系25 μ 1，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。進(jìn)行第二次擴(kuò)增時(shí)，取2 μ 1的第一次PCR產(chǎn)物作為模板，上下游引物換為rPLUin-FP和rPLUin-RP 的上下游引物，雙蒸水增加至18. 75μ 1，其余同第一次PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)程序也略有不同 940C 2min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。瘧原蟲(chóng)通用型巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，泳道1為IOObpDNA標(biāo)志物；泳道2 為瘧疾陽(yáng)性血樣PCR結(jié)果；泳道3為PCR陽(yáng)性對(duì)照；泳道4為PCR陰性對(duì)照，陰性對(duì)照使用無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照使用合成的瘧疾DNA片段。60份血樣經(jīng)通用型巢式PCR檢測(cè)，有40份血樣擴(kuò)增出了預(yù)期大小的240bp特異性擴(kuò)增條帶，為瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性；20份樣本沒(méi)有預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，為瘧原蟲(chóng)陰性。實(shí)施例6 瘧原蟲(chóng)的分型巢式PCR檢測(cè)的應(yīng)用巢式PCR兩次擴(kuò)增的體系和條件略有不同。第一次擴(kuò)增時(shí)，PCR緩沖液2.5μ1， IOmM dNTP 0. 5 μ 1，IOmM rPLUout-FP 和 rPLUout-RP 弓 | 物各 0. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ 1，雙蒸水15. 75 μ 1，DNA模板5 μ 1，總體系25 μ 1，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。進(jìn)行第二次擴(kuò)增時(shí)，取2μ 1的第一次PCR產(chǎn)物作為模板，上下游引物為檢測(cè)分型的上下游引物，雙蒸水增加至18. 75 μ 1，其余同第一次PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)程序也略有不同94°C 2min ；94°C lmin, 58°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C。使用種特異性引物對(duì)瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性的血樣進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2，圖2為瘧原蟲(chóng)的特異性巢式PCR檢測(cè)結(jié)果圖，泳道1 :100bpDNA標(biāo)志物；泳道2 陽(yáng)性血樣惡性瘧PCR擴(kuò)增；泳道3 陰性對(duì)照惡性瘧PCR擴(kuò)增；泳道4 陽(yáng)性對(duì)照惡性瘧PCR擴(kuò)增；泳道5 陰性對(duì)照間日瘧PCR擴(kuò)增；泳道6 陽(yáng)性血樣間日瘧PCR擴(kuò)增；泳道7 陽(yáng)性對(duì)照間日瘧PCR擴(kuò)增；泳道 8 陰性對(duì)照三日瘧PCR擴(kuò)增；泳道9 陽(yáng)性對(duì)照三日瘧PCR擴(kuò)增；泳道10.陽(yáng)性血樣卵形瘧 PCR擴(kuò)增；泳道11 陽(yáng)性對(duì)照卵形瘧PCR擴(kuò)增；泳道12 陰性對(duì)照卵形瘧PCR擴(kuò)增。惡性瘧、 間日瘧、卵形瘧和三日瘧陽(yáng)性血樣的預(yù)計(jì)擴(kuò)增條帶分別為204bp、119bp、456bp*141bp。結(jié)果有22份為惡性瘧感染，13份為間日瘧感染，1份為卵形瘧感染；3份為惡性瘧/間日瘧混合感染。陰性對(duì)照使用無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照使用合成的瘧疾DNA片段。實(shí)施例7 熒光PCR通用型檢測(cè)的應(yīng)用使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix進(jìn)行體系配置，反應(yīng)總體積 20 μ 1，包括 Master Mix 10 μ 1、10 μ M 正向引物 1 μ 1、10 μ M 反向引物 1 μ 1、5 μ M 探針 lul>DNA 7μ1，同時(shí)分別以DEPC Η20和DNA陽(yáng)性模板作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增和檢測(cè)在A(yíng)BI 7900ΗΤ Fast熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5°C 20s ；95°C ls，58°C 20s， 40個(gè)循環(huán)，在58 °C收集熒光。通用型的熒光檢測(cè)引物及探針如下Plas-FP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGAPlas-RP TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT
9
Plas-Pro FAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB。M代表堿基A或C，R代表堿基A或G。將60份樣本進(jìn)行瘧疾通用型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間約需20min。圖3為瘧原蟲(chóng)的鏡檢與熒光PCR比較檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖，其中，圖3-1為40份鏡檢陽(yáng)性的樣本的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示39份鏡檢陽(yáng)性樣本的熒光PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性；圖 3-2為20份鏡檢陰性的樣本的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果；泳道1 陽(yáng)性對(duì)照；泳道2、3和4分別為 55,45和58號(hào)樣本熒光PCR檢測(cè)結(jié)果；在20份鏡檢陰性的樣本中，有3份樣本為實(shí)時(shí)熒光 PCR陽(yáng)性，其余17份樣本為實(shí)時(shí)熒光PCR陰性。實(shí)施例8 熒光PCR分型檢測(cè)的應(yīng)用使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix進(jìn)行體系配置，反應(yīng)總體積 20 μ 1，包括 Master Mix 10 μ 1、10 μ M 正向引物 1 μ 1、10 μ M 反向引物 1 μ 1、5 μ M 探針 lul>DNA 7μ1，同時(shí)分別以DEPC Η20和DNA陽(yáng)性模板作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增和檢測(cè)在A(yíng)BI 7900ΗΤ Fast熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5°C 20s ；95°C ls，58°C 20s， 40個(gè)循環(huán)，在58 °C收集熒光。特異性的引物及熒光標(biāo)記探針。引物探針序列分別(為5’ -3’ )如下惡性瘧的熒光檢測(cè)引物及探針如下FAL-FP CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAFAL-RP TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAAFAL-Pro FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1間日瘧的熒光檢測(cè)引物及探針如下VIV-FP ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTVIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCCVIV-Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQl三日瘧的熒光檢測(cè)引物及探針如下MAL-FP CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAMAL-RP AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAAMAL-Pro FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGB。采用染料摻入法進(jìn)行卵形瘧的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 μ 1，包括2XPCR 緩沖液12. 5 μ 1、IOmM上下游引物OVA-FP和OVA-RP各0. 75 μ 1、無(wú)菌雙蒸水9 μ 1以及瘧原蟲(chóng)模板 DNA 2 μ 1。實(shí)時(shí)熒光 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 15min ；94°C 15s，50°C 30s, 72°C 30s (收集熒光)，40個(gè)循環(huán)；最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，程序?yàn)?4 °C 15s, 60 °C 60s, 95 °C 15s。圖4為瘧原蟲(chóng)的熒光PCR分型檢測(cè)結(jié)果圖；圖4-1為三日瘧的引物探針的熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果圖，泳道1和2分別為惡性瘧和三日瘧體系的熒光PCR檢測(cè)；泳道3和4分別為惡性瘧和三日瘧陰性對(duì)照。圖4-2為惡性瘧的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖，圖4-3為間日瘧的熒光 PCR檢測(cè)結(jié)果圖，圖4-4為輸入性卵形瘧的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖，圖4-5為輸入性卵形瘧的熔解曲線(xiàn)分析圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)24份惡性瘧(圖4-2)、11份間日瘧(圖4-3)、1份惡性瘧/間日瘧混合感染、1份卵形瘧感染(圖4-4)、3份未能分型。
通過(guò)血樣的巢式PCR檢測(cè)和熒光PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了一例輸入性卵形瘧病例。其巢式PCR擴(kuò)增大小約為450bp ；圖4-4為輸入性卵形瘧的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果圖；熒光PCR擴(kuò)增為明顯的S形曲線(xiàn)，泳道1 :58號(hào)血樣的卵形瘧熒光PCR檢測(cè)；泳道2 陽(yáng)性對(duì)照熒光PCR檢測(cè)；泳道3:陰性對(duì)照熒光PCR檢測(cè)。圖4-5為輸入性卵形瘧的熔解曲線(xiàn)分析，泳道1 :58號(hào)血樣擴(kuò)增片段的熔解曲線(xiàn)；泳道2 陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增片段的熔解曲線(xiàn)；泳道3 陰性對(duì)照擴(kuò)增片段的熔解曲線(xiàn)；由圖可見(jiàn)，擴(kuò)增片段的熔解曲線(xiàn)Tm值為72.5°C ；將輸入性卵形瘧的巢式 PCR擴(kuò)增片段送去測(cè)序，序列分析表明，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為434bp，序列的堿基組成如下CGGGGAAATTTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGA GTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGAC TCAACACGGGGAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATG GTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACCTGCT AATTAGCGGCGAATACGTTATATTCCTACTTGAAATTGAATATAGCTGAATTTGCTTATTTTGAAGAATATATTAGG ATGCATTATAGTGTCCTTTTCCCTTTTCTACTTAATTCGCAATTCATGCTGTTTCTC下劃線(xiàn)堿基為擴(kuò)增的上下游引物部位。將該序列遞交到GenBank上，GenBank登錄號(hào)為JF505386。實(shí)施例9 瘧原蟲(chóng)鏡檢和巢式PCR擴(kuò)增方法的比較將瘧原蟲(chóng)鏡檢和巢式PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行比較(表2)，18份惡性瘧、11份間日瘧和 17份陰性血樣的兩種檢測(cè)結(jié)果一致，2份鏡檢為間日瘧和2份鏡檢為陰性的樣本經(jīng)巢式PCR 擴(kuò)增顯示為惡性瘧，2份鏡檢為惡性瘧的樣本經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增顯示為間日瘧，1份鏡檢為陰性的樣本經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增顯示為卵形瘧，2份鏡檢為惡性瘧和1份鏡檢為間日瘧的樣本經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增顯示為惡性瘧/間日瘧混合感染，1份鏡檢間日瘧陽(yáng)性血樣經(jīng)巢式PCR未能分型，2份鏡檢為惡性瘧和1份鏡檢為間日瘧的樣本經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增顯示為陰性。表2血樣的瘧原蟲(chóng)巢式PCR和鏡檢結(jié)果比較
鏡檢檢測(cè)
巢式PCR檢測(cè)
Pf Pv Pm Po 陰性總數(shù)
Pf182 00 222Pv211 00 013Pm00 00 00Po00 00 11Pf+Po21 00 03未分型01 00 01陰性21 00 1720總數(shù)2416 00 2060將與鏡檢結(jié)果不一致的血樣的特異性巢式PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的blast分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列均為擴(kuò)增的相應(yīng)瘧原蟲(chóng)的SSU rDNA基因序列，證實(shí)巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果是正確的。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
110157]序列表
0158]<120> 一種瘧疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及熒光PCR檢測(cè)試劑盒
0159]<160>26
0160]<170>PatentIn version 3. 2
0161]<210>1
0162]<211>25
0163]<212>DNA
0164]<213> 人工序列 Plas-FP
0165]<400>1
0166]AGTTAAGGGA GTGAAGACGATCAGA25
0167]<210>1
0168]<211>29
0169]<212>DNA
0170]<213> 人工序列 Plas-RP
0171]<400>2
0172]TCATCCAAMR CCTAGTCGGC ATAGTTTAT29
0173]<210>1
0174]<211>14
0175]<212>DNA
0176]<213> 人工序列 Plas-Pro
0177]<400>3
0178]ACCGTCGTAA TCTT14
0179]<210>1
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0181]<212>DNA
0182]<213> 人工序列 FAL-FP
0183]<400>4
0184]CTTTTGAGAG GTTTTGTTAC TTTGAGTAA29
0185]<210>1
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0187]<212>DNA
0188]<213> 人工序列 FAL-RP
0189]<400>5
0190]TATTCCATGC TGTAGTATTC AAACACAA28
0191]<210>1
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0193]<212>DNA
0194]<213> 人工序列 FAL-Pro
0195]<400>6
TGTTCATAAC AGACGGGTAG TCATGATTGA GTTCA35<210>1<211>26<212>DNA<213> 人工序列 VIV-FP<400>7ACGCTTCTAG CTTAATCCAC ATAACT26<210>1<211>27<212>DNA<213> 人工序列 VIV-RP<400>8ACTTCCAAGC CRAAGCAAAG AAAGTCC27<210>1<211>27<212>DNA<213> 人工序列 VIV-Pro<400>9TTCGTATCGA CTTTGTGCGC ATTTTGC27<210>1<211>25<212>DNA<213> 人工序列 OVA-FP<400>10ATTAATGTGT CCTTTTCCCT ATTCT25<210>1<211>25<212>DNA<213> 人工序列 OVA-RP<400>11GCTTTACAAT CAAACGAATA CATTC25<210>1<211>28<212>DNA<213> 人工序列 MAL-FP<400>12CCGACTAGGT GTTGGATGAT AGAGTAAA28<210>1<211>26
<212>DNA<213> 人工序列 MAL-RP<400>13AACCCAAAGA CTTTGATTTC TCATAA26<210>1<211 >21<212>DNA<213> 人工序列 MAL-Pro<400>14CTATCTAAAA GAAACACTCAT21<210>1<211>24<212>DNA<213> 人工序列 rPLUout-FP<400>15TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGA24<210>1<211>22<212>DNA<213> 人工序列 rPLUout-RP<400>16CCTGTTGTTG CCTTAAACTT CC22<210>1<211>23<212>DNA<213> 人工序列 rPLUin-FP<400>17AAGGATAACT ACGGAAAAGC TGT23<210>1<211>30<212>DNA<213> 人工序列 rPLUin-RP<400>18TACCCGTCAT AGCCATGTTA GGCCAATACC30<210>1<211>20<212>DNA<213> 人工序列 rFAL-FP<400>19
14
TTAAACTGGT TTGGGAAAAC
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列rFAL-RP
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CTTCTAGCTT AATCCACATAACTG
<210>1
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<212>DNA
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ACTTCCAAGC CRAAGCAAAGAAAGTCC
<210>1
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<212>DNA
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<400>23
CGGGGAAATT TCTTAGATTGC
<210>1
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<212>DNA
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<400>24
GAGAAACAGC ATGAATTGCG
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列rMAL-FP
<400>25
AACAffAGTTG TACRTTAAGAATAAACGC
<210>1
<211>28
<212>DNA<213> 人工序列 rMAL-RP<400>26AATTCCCATG CATAAAAAAT TAYACAAA28
權(quán)利要求
1.一種皰疾通用型及其分型的巢式PCR檢測(cè)及焚光PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR緩沖液 和I^aq DNA聚合酶混合物，其特征在于，還包括核酸序列如SEQID NO :1- 所示的引物及探 針，其中，W代表堿基A或T，Y代表堿基C或T，M代表堿基A或C，R代表堿基A或G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述分型包括惡性皰、間日癥、卵形癥 和三日皰四種型別。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :1-3所示的 弓丨物及探針用于皰疾通用型焚光PCR檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :4-6所示的 弓丨物及探針用于惡性皰的焚光PCR檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :7-9所示的 引物及探針用于間日皰的焚光PCR檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :10-11所示 的引物用于卵形皰的焚光PCR檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :12-14所示 的引物及探針用于三日皰的焚光PCR檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :15-18所示 的引物用于皰疾通用型巢式PCR檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :15-16及 19-20所示的引物用于惡性皰巢式PCR檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :15-16及 21-22所示的引物用于間日皰巢式PCR檢測(cè)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :15-16及 23-24所示的引物用于卵形皰巢式PCR檢測(cè)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述核酸序列如SEQIDNO :15-16及 25-26所示的引物用于三日皰巢式PCR檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種瘧疾通用型及其分型的巢式PCR及熒光PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶混合物，還包括如SEQ ID NO1-26所示的引物及探針。該試劑盒能檢測(cè)瘧原蟲(chóng)屬特異性和惡性瘧、間日瘧、卵形瘧、三日瘧等四種瘧原蟲(chóng)分型，用該試劑盒檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了一例國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)的輸入性卵形瘧疾病例。該試劑盒能應(yīng)用于臨床、口岸中瘧疾的檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102220419SQ20111010557
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者劉靜宇, 師永霞, 幸蘆琴, 李小波, 洪燁, 相大鵬, 蘇錦坤, 鄭夔, 郭波旋, 鐘玉清, 陳永紅, 黃吉城 申請(qǐng)人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心