專利名稱：用于直接表達肽的改進的細菌宿主細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及直接表達肽產(chǎn)物到表達該肽產(chǎn)物的遺傳工程化宿主細胞的培養(yǎng)基中。 更特別地，本發(fā)明涉及克隆載體、表達載體、宿主細胞和/或用于高產(chǎn)量生產(chǎn)從宿主分泌出并進入培養(yǎng)基中的肽產(chǎn)物的發(fā)酵方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及直接表達具有C-末端甘氨酸的肽產(chǎn)物，它在此后被轉化為具有代替所述甘氨酸的氨基的酰胺化肽。
背景技術：
存在各種用于重組生產(chǎn)肽產(chǎn)物的技術，肽產(chǎn)物就是任何其分子結構包括多個通過肽鍵連接的氨基酸的化合物。當外源肽產(chǎn)物較小時的問題就是它們經(jīng)常容易被表達該肽的宿主細胞的細胞質或周質中的內源蛋白酶降解。其它問題包括不改變其三級結構(它可能不令人期望的減少了發(fā)揮其基本功能的能力)而得到足夠的產(chǎn)量并以相當純的形式回收該肽。要解決大小較小的問題，現(xiàn)有技術中已經(jīng)頻繁地將所感興趣的肽產(chǎn)物與另一(通常更大的)肽作為融合蛋白來表達，并在細胞質中積累這種融合蛋白。另一肽可能提供幾種功能，例如保護所感興趣的肽不暴露給宿主細胞的細胞質中存在的蛋白酶。一種這樣的表達系統(tǒng)在 Ray et al. , Bio/Technology, Vol. 11, pages 64-70，(1993)中描述過。但是，用這種技術分離肽產(chǎn)物需要切割融合蛋白質并從宿主細胞質中正常存在的所有肽中純化出來。這可能使許多其它可能降低方法的總效率的步驟成為必要。例如現(xiàn)有技術的融合蛋白在細胞質中積累時，必須經(jīng)常收獲并裂解細胞，在澄清步驟中去除細胞碎片。根據(jù)本發(fā)明，所有這些都被避免，其中所感興趣的肽產(chǎn)物被直接表達到培養(yǎng)基中并從培養(yǎng)基中回收。在現(xiàn)有技術中，經(jīng)常有必要使用親合層析步驟來純化融合蛋白，這還是必須經(jīng)歷切割來將所感興趣的肽與其融合配偶體分開。例如，在上述Biol Technology論文中，用溴化氰將鮭魚降鈣素前體從其融合配偶體上切割下來。這個切割步驟還是需要額外的步驟來保護鮭魚降鈣素前體1位和7位的半胱氨酸巰基基團。利用磺化作用為半胱氨酸提供保護基團。這隨后又改變了鮭魚降鈣素前體的三級結構，需要在隨后復性前體(當然還要除去保護基團)。本發(fā)明的肽產(chǎn)物只表達為帶有信號序列，不與大的融合配偶體一起表達。本發(fā)明產(chǎn)生了“直接表達”。它最初表達為帶有加入到N-末端側的信號區(qū)域。然而，該信號區(qū)域是在肽產(chǎn)物分泌到細胞周質期間被翻譯后切除的。其后，肽產(chǎn)物從周質擴散或者分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，在此它可能以適當?shù)娜壗Y構被回收。它不與任何融合配偶體連接，后者的除去可能首先需要細胞裂解變性或修飾，盡管在本發(fā)明的一些實施方案中，使用了磺化來保護肽產(chǎn)物純化期間的半胱氨酸巰基基團。現(xiàn)有技術中在細胞內累積肽產(chǎn)物的另一問題是，累積產(chǎn)物可能對細胞有毒，可能因此限制了可被合成的融合蛋白的量。該方法的另一個問題是，大多數(shù)產(chǎn)物通常是由較大的融合配偶體構成的。例如，90%的產(chǎn)物可能是較大的融合配偶體，這就導致只有10%的產(chǎn)物屬于所感興趣的肽。該方法還有另一問題是，融合蛋白可能在細胞內形成不溶的包含體， 在裂解之后包含體的溶解可能不產(chǎn)生有生物活性的肽?，F(xiàn)有技術中試圖將肽與附加在N-末端上的信號肽一起表達以引導期望的肽產(chǎn)物分泌到周質中(參見EP 177, 343, Genentech Inc.) 0幾個信號肽已經(jīng)被鑒別(參 JAL Watson, Μ. Nucleic Acids Research, Vol 12，No. 13， pp :5145-5164)。例如，Hsiung et al. (Biotechnology, Vol 4，November 1986，pp :991-995)使用大腸桿菌的夕卜膜蛋白 A(OmpA)的信號肽來引導某些肽進入周質中。最經(jīng)常的是，分泌到周質中的肽常常傾向于保持在那里而最少地分泌到培養(yǎng)基中?？赡苄枰⒉黄谕倪M一步的步驟來破壞或通透外膜以釋放足量的周質組分。一些現(xiàn)有技術試圖將肽從周質分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，包括破壞外膜屏障的完整性，其通過讓宿主細胞同時表達含有信號肽的期望的肽產(chǎn)物與能使外膜成為可通透的或滲漏的溶胞肽蛋白(美國專利No. 4，595，658)。然而，人們需要小心溶胞肽蛋白的量，以便不會破壞細胞的完整性并殺死細胞。通過這種技術也可能使得所感興趣的肽的純化變得更加困難。除了上述破壞外膜穩(wěn)定性的技術外，還有不這么嚴格的使革蘭氏陰性細菌外膜通透的方法。這些方法不會引起不必要的能導致細胞生存力降低的外膜的破壞。這些方法包括但不限于使用陽離子試劑(Martti Vaara, Microbiological Reviews, Vol. 56, pages 395-411(1992))禾口甘氨酸(Kaderbhai et al. , Biotech. Appl. Biochem, Vol. 25, pages53-61(1997))0陽離子試劑通過與外膜的脂多糖主鏈相互作用并引起脂多糖主鏈的損傷來使外膜通透。損傷和破壞的量可以是非致死的或致死的，這取決于所使用的濃度。甘氨酸可取代肽聚糖的肽組分中的丙氨酸殘基。肽聚糖是革蘭氏陰性細菌外細胞壁的結構組分之一。在高濃度的甘氨酸中培養(yǎng)大腸桿菌會提高甘氨酸-丙氨酸的取代頻率，這將導致細胞壁的缺陷，從而增加通透性。使期望的肽產(chǎn)物分泌的另一現(xiàn)有技術方法包括將產(chǎn)物融合到正常地被分泌到培養(yǎng)基(溶血素)中的載體蛋白上或者融合到在外膜上表達的完整蛋白質上(如OmpF蛋白質)。例如，當結合了 ompF蛋白片段時，人β -內啡肽可以通過大腸桿菌細胞作為融合蛋白被分泌(EMB0J.，Vol 4，No. 13A，pp =3589-3592,1987) 0然而所期望的肽產(chǎn)物的分離很困難，因為必須將它們與載體肽分開，并且包括一些(雖然不是全部)與在細胞質中的融合肽的表達有關的缺點。還有另一現(xiàn)有技術方法，就是在遺傳上改變宿主細胞以產(chǎn)生具有相對不能保留周質的肽和蛋白質的可通透性外膜的新菌株。然而這些新菌株很難維持，可能需要嚴格的條件，這反過來又影響了所期望的肽產(chǎn)物的產(chǎn)量。Raymond Wong et al.(美國專利No. 5，223，407)設計了另一分泌肽產(chǎn)物的方法， 其通過制造包括編碼異源蛋白的DNA的重組DNA構建體，該DNA在讀碼框內與編碼ompA信號肽的DNA以及包括tac啟動子的控制區(qū)域連接。據(jù)報道，該系統(tǒng)的產(chǎn)量明顯少于用本發(fā)明所能得到的產(chǎn)量。雖然現(xiàn)有技術可能允許蛋白質從周質輸出到培養(yǎng)基中，但是這可能導致不健康的細胞，其不容易培養(yǎng)到所期望的高密度，從而又影響了產(chǎn)物的產(chǎn)量。
更近來，Mehta et al.(美國專利No. 6，210，925)披露了用于將肽產(chǎn)物直接表達到培養(yǎng)遺傳工程化宿主細胞的培養(yǎng)基中的表達系統(tǒng)。高產(chǎn)量的獲得在于用了新載體、特殊的宿主選擇、和/或包括小心控制細胞生長速度的發(fā)酵工藝、以及在生長期使用誘導物。提供了特殊的載體，其包括具有多個啟動子的并與編碼信號肽的編碼區(qū)域可操作地連接的控制區(qū)域，該信號肽編碼區(qū)域位于編碼所感興趣的肽的編碼區(qū)的上游。也使用多個轉錄盒來增加產(chǎn)量。本發(fā)明設法使用新的遺傳工程化宿主細胞來用有效的表達載體生產(chǎn)更高產(chǎn)量的肽。本發(fā)明也設法使用新的通用克隆載體來生產(chǎn)有效的表達載體。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目標就是讓肽產(chǎn)物在培養(yǎng)產(chǎn)生肽的宿主細胞的培養(yǎng)基中以高產(chǎn)率累積。這是有利的，因為培養(yǎng)基相對不受許多細胞肽的污染。本發(fā)明的另一目標是提供遺傳工程化宿主細胞，其在表達發(fā)明的新的表達載體并使肽產(chǎn)物在培養(yǎng)產(chǎn)生肽的宿主細胞的培養(yǎng)基中以高產(chǎn)率累積方面特別有用。本發(fā)明的另一目標是提供改進的發(fā)酵工藝，用來增加通過遺傳工程化宿主細胞表達的肽產(chǎn)物的產(chǎn)率。本發(fā)明進一步的目標是提供改進的方法，其利用具有C-末端甘氨酸的前體肽來生產(chǎn)酰胺化的肽，該前體在直接表達到根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基后被酰胺化。因此，本發(fā)明提供了缺乏分別編碼重組蛋白A和蛋白酶III的染色體基因recA和 Ptr的遺傳工程化大腸桿菌細菌。本發(fā)明也提供了克隆載體，包括(a)包括至少兩個啟動子的控制區(qū)；(b)編碼信號序列的核酸；(c)兩個基因克隆酶限制位點，其允許符合所述信號序列讀碼框編碼地克隆肽的基因，并與所述控制區(qū)可操作地連接；(d)至少兩個盒克隆酶限制位點，位于所述基因克隆酶限制位點的3'；以及(e)至少兩個盒克隆酶限制位點，位于所述控制區(qū)的5'，其中所有所述的限制酶位點互不相同，并在所述載體中是獨特的。本發(fā)明進一步提供了制備含有多個轉錄盒的表達載體的方法，每個盒包括(1) 帶有編碼肽產(chǎn)物的核酸的編碼區(qū)，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3'；以及(2) 可操作地與編碼區(qū)連接的控制區(qū)，所述控制區(qū)包括多個啟動子，所述方法包括(a)使用兩種基因克隆酶限制位點將所述帶有編碼肽產(chǎn)物的核酸的編碼區(qū)符合讀碼框地克隆到本發(fā)明克隆載體中編碼信號肽的核酸的3'，從而形成克隆載體中的表達盒；(b)使用在所述基因克隆酶限制位點3'的盒克隆酶限制位點處進行切割的第一限制酶和在所述基因克隆酶限制位點5'的盒式克隆酶限制位點處進行切割的第二限制酶將表達盒從克隆載體上切割下來；(c)將表達盒連接到含有步驟(b)的盒克隆酶限制位點的模板表達載體中，這樣第一限制酶位點就在第二限制酶位點的3'，其中所述模板表達載體(i)已經(jīng)用第一和第二限制酶連接，以及(ii)含有至少多一對的盒克隆酶限制位點，例如位點對的第一成員與權利要求4的位于所述基因克隆酶限制位點3'的盒克隆酶限制位點相同，而位點對的第二成員與權利要求4的位于所述基因克隆酶限制位點5'的盒克隆酶限制位點相同，其中位點對的第一成員在位點對的第二成員3'，每個盒克隆酶限制位點是模板載體上獨特的，沒有其它的權利要求4的盒克隆酶限制位點落在第一盒克隆酶限制位點5'的區(qū)域和第二盒式可能性酶限制位點3'的區(qū)域中，或者落在盒克隆酶限制位點對第一成員5'和盒克隆酶限制位點對第二成員3'的區(qū)域中；以及(d)至少重復一次步驟(b)和(c)，但是使用切割盒克隆酶限制位點對任一第一成員和第二成員的限制酶，而不是步驟(b)的第一和第二限制酶。本發(fā)明也提供缺乏分別編碼重組蛋白A和蛋白酶III的染色體基因rec A和ptr 的大腸桿菌宿主細胞，所述宿主含有并表達包括多個串聯(lián)式轉錄盒的表達載體，每個盒包括(1)帶有編碼肽產(chǎn)物的核酸的編碼區(qū)，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3'； 以及( 可操作地與編碼區(qū)連接的控制區(qū)，所述控制區(qū)包括多個啟動子。本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)肽產(chǎn)物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用本發(fā)明表達載體轉化或轉染的本發(fā)明的宿主細胞，然后從培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中回收肽產(chǎn)物。本發(fā)明也提供生產(chǎn)酰胺化肽產(chǎn)物的方法，包括步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用本發(fā)明表達載體轉化或轉染的本發(fā)明的宿主細胞，其中肽產(chǎn)物包括C-末端甘氨酸；(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述肽產(chǎn)物；以及(c)通過將所述C-末端甘氨酸轉化為氨基而將所述肽產(chǎn)物轉變?yōu)轷０坊碾摹?br> 生物保藏
以下生物材料保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209，具有以下分類名稱、保藏號和保藏日。
權利要求
1.缺乏分別編碼重組蛋白和蛋白酶III的染色體基因recA和ptr的大腸桿菌宿主細胞，所述宿主含有并表達包括多個串聯(lián)式轉錄盒的表達載體，每個盒包括(1)帶有編碼肽產(chǎn)物的核酸的編碼區(qū)，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3' 端；以及(2)可操作地與編碼區(qū)連接的控制區(qū)，所述控制區(qū)包括多個啟動子。
2.權利要求1的宿主細胞，其是BLR菌株。
3.權利要求1的宿主細胞，其是UGL801并具有ATCC保藏號PTA-5501。
4.權利要求1的宿主細胞，其中所述表達載體是具有ATCC保藏號PTA-5567的 PUSEC-05IQ克隆載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于直接表達肽的改進的細菌宿主細胞。本發(fā)明還涉及表達系統(tǒng)，用于將產(chǎn)物直接表達到遺傳工程化宿主細胞所生長的培養(yǎng)基中。用特殊選擇的宿主和/或發(fā)酵工藝獲得了高產(chǎn)量，發(fā)酵工藝包括小心控制細胞生長速度、在生長速度期間使用誘導物以及在生長階段期間使用誘導物。提供了用于制備表達載體的特殊的通用克隆載體，其包括具有可操作地與編碼信號肽的編碼區(qū)連接的多個啟動子的控制區(qū)，該信號肽編碼區(qū)位于編碼所感興趣的肽的編碼區(qū)的上游。也使用多種轉錄盒來增加產(chǎn)量。也公開了使用表達系統(tǒng)來生產(chǎn)酰胺化的肽。
文檔編號C12P21/02GK102337241SQ201110107199
公開日2012年2月1日 申請日期2005年3月10日 優(yōu)先權日2004年3月12日
發(fā)明者A·P·康薩爾沃, C·P·米南, M·V·L·雷, N·M·梅塔 申請人:尤尼基因實驗室公司