專利名稱：可以簡便檢測ndm-1基因的引物組合物及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種可以簡便檢測NDM-I基因的引物組合物及其應用。
背景技術(shù)：
早在人類誕生之前，細菌便開啟了自己的生命歷程，二戰(zhàn)期間細菌嚴重威脅了人類的生命。19 年，弗萊明偶然間發(fā)現(xiàn)了青霉素(Penicillin)，隨著抗生素藥物的問世，細菌的耐藥性在一些國家得到一定的控制。1961年，后英國學者Jevons首次發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resitant Staphylococcusaureus，MRSA) ,MRSA能分泌一種酚可溶性調(diào)控蛋白(Phenol-soluble modulin,PSM)破壞人類的嗜中性粒細胞，形成嚴重感染——第一任“超級細菌”就此誕生。近年來抗生素濫用及抗生素累積的雙重因素，使得細菌中的耐藥基因不斷積累，從而產(chǎn)生了多重抗藥性。據(jù)2010年8月11日出版的英國《The Lancet Infectious Diseases》期刊報道，目前有一種新的耐藥基因在一些國家流行，一些西方醫(yī)學家稱其為NDM-I基因。NDM-I 基因編碼的蛋白被命名為“新德里金屬- β-內(nèi)酰胺酶1 (New Metallo-^-Lactamase-D0 新德里金屬- β -內(nèi)酰胺酶1由269個氨基酸殘基組成，與現(xiàn)有的其它金屬- β -內(nèi)酰胺酶 (Metallo-β -Lactamase)的一致性不足33%，且在酶活性位點附近經(jīng)常有其獨特的氨基酸殘基及插入序列，并能與碳青霉烯類抗生素緊密結(jié)合。NDM-I基因目前已發(fā)現(xiàn)于克雷伯式桿菌的1801Λ的質(zhì)粒和大腸桿菌的1401Λ的質(zhì)粒上。在NDM-I基因上游的2個區(qū)域中還存在能夠抵抗鏈霉素、紅霉素、氯霉素、利福平等抗生素的基因以及消毒劑和磺胺藥物的多種耐藥基因。由于含有NDM-I基因的質(zhì)粒即能在菌株之間穿梭傳遞，又可以在轉(zhuǎn)移中發(fā)生重組，且通過攜帶NDM-I基因的質(zhì)粒的傳遞，還可使對抗生素敏感的細菌獲得多重耐藥性，大大增加臨床抗生素使用的困難。目前，攜帶有NDM-I基因的超級細菌正在全球蔓延，印度、美國、英國、澳大利亞、 加拿大、法國、荷蘭等多個國家已經(jīng)出現(xiàn)了疑似病例。面對“超級細菌”的跨國傳播趨勢，尋找一種簡便、快速、準確的耐藥基因檢測方法成為許多科研工作者的重大課題，也是臨床實踐檢驗中急切解決的問題。建立快速、簡便、可靠的檢測方法對NDM-I基因進行檢測，對于指導臨床的早期治療和有效的控制超級細菌的傳播具有重大意義。LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ^ 2000 Notomi
明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區(qū)域的四條引物 (兩條外引物，兩條內(nèi)引物)及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右進行核酸的指數(shù)級擴增，其擴增效率可達到IO9-IOltl個拷貝數(shù)量級。整個反應僅需1小時，在擴增反應中副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀與鈣黃綠素結(jié)合，產(chǎn)生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實驗結(jié)果。LAMP技術(shù)具有簡便、快速、準確、廉價、易檢測等特點。目前，國內(nèi)外尚未見LAMP 方法檢測NDM-I基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以簡便檢測NDM-I基因的引物組合物及其應用。本發(fā)明提供的輔助檢測NDM-I蛋白(新德里金屬-內(nèi)酰胺酶1)的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、 序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成。本發(fā)明還保護一種輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒，包括所述的專用引物。所述專用引物可用于制備輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒。所述專用引物或所述試劑盒可用于輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因。所述專用引物或所述試劑盒可用于輔助鑒定含有NDM-I蛋白的編碼基因的生物樣本。所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。所述NDM-I蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或⑷所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在嚴格條件下與(1)或O)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA 分子；(4)與⑴或⑵限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分子。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定待測生物樣本是否含有NDM-I蛋白的編碼基因的方法，包括如下步驟(1)提取所述待測生物樣本的基因組DNA ；(2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用所述的專用引物進行環(huán)介導恒溫擴增；(3)根據(jù)步驟O)的擴增產(chǎn)物鑒定所述待測生物樣本是否含有所述NDM-I蛋白的
編碼基因。所述環(huán)介導恒溫擴增的反應程序可為65°C 1小時，80°C 5分鐘。所述環(huán)介導恒溫擴增的反應體系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2 所示DNA的濃度均可為0. 2 μ mol/L,序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA 的濃度均可為1. 6 μ mol/L,序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA的濃度均可為 0. 8 μ mol/L。所述待測生物樣本可為大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)或月市炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌DH5 α、所述金黃色葡萄球菌具體可為金黃色葡萄球菌ATCC25923、所述肺炎克雷伯氏菌具體可為肺炎克雷伯氏菌EL-2株、所述肺炎鏈球菌具體可為肺炎鏈球菌R6。
所述環(huán)介導恒溫擴增的反應體系中含有鈣黃綠素時，可通過熒光顯色進行結(jié)果判讀，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。還可通過觀察沉淀進行結(jié)果判讀，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。還可通過瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果判讀，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。還可通過濁度儀進行結(jié)果判讀，從反應開始時刻即通過Loopamp濁度儀檢測反應液，如果生成濁度變化曲線待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果沒有生成濁度變化曲線待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。應用所述專用引物可以通過LAMP(環(huán)介導恒溫擴增)技術(shù)從分子水平上直接快速、準確檢測NDM-I耐藥基因，具有如下優(yōu)點(1)在恒溫條件下即可發(fā)生反應，擺脫了了對于儀器的依賴；⑵反應時間短；在Ih內(nèi)即可完成；(3)靈敏度高；比傳統(tǒng)PCR擴增技術(shù)提高了三個數(shù)量級，最低檢測限為ecopies/反應；(4)特異性強；應用6個靶基因位點，內(nèi)引物及外引物在6個區(qū)域特異性結(jié)合方可進行擴增；( 鑒定簡便；在核酸大量合成時，從 dNTP解離出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀；如果在反應體系中加入結(jié)合了 Mn2+的鈣黃綠素，Mg2+則替換掉鈣黃綠素中結(jié)合的Mn2+，是鈣黃綠素發(fā)出黃綠色熒光；以上兩種方法均不需要借助其他儀器便可肉眼觀察實驗結(jié)果，實現(xiàn)了結(jié)果可視化；也可通過Loopamp濁度儀檢測的方式進行結(jié)果判讀；(6)步驟簡單；先將DNA 模板在96°C，預變性:3min。再將所有配制在一起的試劑，一步添加進去，實現(xiàn)一步核酸擴增，免開蓋操作，可保證臨床檢驗人員自身安全，進而亦避免了“超級細菌”的傳播。應用本發(fā)明提供的專用引物檢測NDM-I蛋白的編碼基因，解決了其他檢測技術(shù)對于臨床實際應用需求的針對性不強的技術(shù)弊端，并且解決了其他檢測技術(shù)耗時長、操作復雜、檢測儀器昂貴、靈敏度及特異性差等技術(shù)問題，具有靈敏度高、速度快、特異性強、簡便、 安全等特點，為快速、準確的檢測NDM-I耐藥基因打下堅實的基礎，其廣泛應用將大大提高低儀器配置地區(qū)的病原微生物檢測能力，對病原微生物的早期、準確診斷有著重大意義。本發(fā)明不僅可指導臨床合理用藥，以免延誤病情和增加治療費用，而且有利于控制其傳播，防止暴發(fā)流行，這對提高治療效果和控制醫(yī)院內(nèi)感染均有重要意義。


圖1為實施例2中通過檢測濁度變化判讀結(jié)果。圖2為實施例3中通過瓊脂糖凝膠電泳判讀結(jié)果。圖3為實施例4中NDM-I基因語同源序列的BLAST比對結(jié)果。圖4為對比例中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a 公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得； 參考文獻韓俊，陳嵐，段淑敏等，金屬催化劑有效快速裂解SARS冠狀病毒和其他微生物， 中國實驗動物學報，2006年9月，第14卷，第3期，199-212頁。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923 公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻王堅，吳梅，陸煒方等，48株金黃色葡萄球菌檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及藥敏分析，中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2009年1月第12卷第1期，93-94。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)EL-2株公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻孔慶娟，劉馬峰，白建等，大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的藥敏試驗，畜禽業(yè)，2005年第1期總第177期，64-66。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) R6 公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻張巧，林科雄，馬千里等，肺炎鏈球菌溶菌酶作為肺炎鏈球菌多價核酸疫苗候選抗原的保護效能評價，重慶醫(yī)科大學學報，2010年第35卷第5期。實施例1、專用引物的設計和制備設計并合成表1所示的各條引物(FOP、BOP, FIP、BIP、FLP和BLP)。表1所示的六條引物組成專用引物，用于實施例2。表1引物的核苷酸序列
權(quán)利要求
1.輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示 DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的專用引物；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述專用引物在制備輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒中的應用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1所述專用引物或權(quán)利要求2所述試劑盒在輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因中的應用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述專用引物或權(quán)利要求2所述試劑盒在輔助鑒定含有NDM-I蛋白的編碼基因的生物樣本中的應用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的專用引物，如權(quán)利要求2所述的試劑盒，或如權(quán)利要求3至5中任一所述的應用，其特征在于所述NDM-I蛋白的編碼基因為如下⑴或(2)或(3)或⑷ 所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在嚴格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的 DNA分子。
7.一種輔助鑒定待測生物樣本是否含有NDM-I蛋白的編碼基因的方法，包括如下步驟(1)提取所述待測生物樣本的基因組DNA;(2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的專用引物進行環(huán)介導恒溫擴增；(3)根據(jù)步驟O)的擴增產(chǎn)物鑒定所述待測生物樣本是否含有NDM-I蛋白的編碼基因；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述NDM-I蛋白的編碼基因為如下(1)或 ⑵或(3)或(4)所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在嚴格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的 DNA分子。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導恒溫擴增的反應程序為 650C 1小時，80°C 5分鐘。
10.如權(quán)利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導恒溫擴增的反應體系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA的濃度均為0. 2 μ mol/L,序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA的濃度均為1. 6 μ mol/L,序列表的序列5所示 DNA和序列表的序列6所示DNA的濃度均為0. 8 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可以簡便檢測NDM-1基因的引物組合物及其應用。本發(fā)明提供了輔助檢測NDM-1蛋白的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示DNA組成；NDM-1蛋白是由序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。應用所述專用引物檢測，具有靈敏度高、速度快、特異性強、簡便、安全等特點，其廣泛應用將大大提高低儀器配置地區(qū)的病原微生物檢測能力，對病原微生物的早期、準確診斷有著重大意義。本發(fā)明不僅可指導臨床合理用藥，以免延誤病情和增加治療費用，而且有利于控制其傳播，防止暴發(fā)流行，這對提高治療效果和控制醫(yī)院內(nèi)感染均有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102154507SQ20111010865
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者張苑怡, 朱寶利, 武娜, 王志云 申請人:中國科學院微生物研究所