專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯的方法。
背景技術(shù)：
蔗糖酯作為一種安全的表面活性劑，其表面活性作用和廣泛的適用范圍已受到人們的關(guān)注。日本、美國(guó)、歐洲共同體各國(guó)、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)，世界衛(wèi)生組織(WHO)及我國(guó)均已批準(zhǔn)蔗糖酯為食品、化妝品和藥物的乳化劑。與一般的表面活性劑不同，蔗糖酯在好氧和厭氧條件下均能生物降解，這使日用工業(yè)產(chǎn)品的三廢成為環(huán)境友好產(chǎn)物。我國(guó)蔗糖價(jià)格低廉、純度高，進(jìn)口棕櫚油價(jià)格較低，食用安全。因此，其用途不斷被開發(fā)，市場(chǎng)潛力巨大， 極具發(fā)展前景。長(zhǎng)期以來(lái)，蔗糖酯的化學(xué)制備多利用蔗糖直接酯化的方法，由于蔗糖有8個(gè)反應(yīng)活性相近的羥基，所以酯化反應(yīng)作用位點(diǎn)難以控制，欲得到指定結(jié)構(gòu)的單一產(chǎn)物十分困難， 往往需要冗長(zhǎng)的保護(hù)和去保護(hù)的步驟。脂肪酶是目前蔗糖酯合成中使用最廣泛的酶，但是生產(chǎn)成本高、固定化過程繁雜費(fèi)時(shí)大大局限了其商業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯的方法，可顯著降低蔗糖棕櫚酸酯生產(chǎn)成本，同時(shí)達(dá)到較高的酯化反應(yīng)效率和產(chǎn)率。一種酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯的方法，包括將蔗糖和棕櫚酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，于50 60°C反應(yīng)10 14小時(shí)，分離、純化制得蔗糖棕櫚酸酯。優(yōu)選的，所述的有機(jī)溶劑為叔丁醇。優(yōu)選的，每升有機(jī)溶劑中蔗糖、棕櫚酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 100g、l 2g。所述反應(yīng)置于水浴搖床中進(jìn)行，水浴搖床轉(zhuǎn)速為150 200轉(zhuǎn)/分鐘。優(yōu)選的，在分離純化前加入分子篩，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 12h，鎖住水分，促進(jìn)酯化
反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行。所述的分離、純化為離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗后溶于正己烷，
重結(jié)晶。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒的原始載體為載體pPIC9K，目的基因?yàn)橥ㄟ^連接肽序列連接的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因，所述的脂肪酶基因連接載體pPIC9K中MFal信號(hào)肽序列的C端。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號(hào)為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從^witrogen公司購(gòu)得。它的細(xì)胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號(hào)為]\C8164。載體PPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號(hào)肽序列(Genbank號(hào)Μ17301)，同時(shí)該載體內(nèi)信號(hào)肽序列上游存在AOXl啟動(dòng)子(Genbank號(hào) Ζ46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達(dá)穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)改變，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明通過將脂肪酶基因和細(xì)胞壁α凝集素基因?qū)氘叧嘟湍讣?xì)胞GS115，畢赤酵母細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，脂肪酶表達(dá)并分泌到胞外，同時(shí)利用細(xì)胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細(xì)胞表面。利用該酵母展示脂肪酶對(duì)酯化反應(yīng)進(jìn)行催化，可有效提高操作穩(wěn)定性、耐熱性以及重復(fù)性，由于酶反應(yīng)的特異性該酶能大幅度抑制副反應(yīng)的發(fā)生，酯化轉(zhuǎn)化率在80% 以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號(hào)AF229435)和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因(Genbank號(hào)為Μ28164)，同時(shí)在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時(shí)在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細(xì)胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應(yīng)體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運(yùn)行條件為94°C 3分鐘，；35個(gè)循環(huán)(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 0C 10 分鐘。用EocR I和Not I同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒，并在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質(zhì)粒，通過電泳檢驗(yàn)并回收質(zhì)粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發(fā)生His 4單位點(diǎn)置換重組，用Ml I對(duì)pPIC9K-R0L質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準(zhǔn)備好的畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，然后在1500ν，400Ω，25uF條件下電擊10ms，并加入約Iml預(yù)冷的山梨醇。將上述混勻的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物約400μ 1涂于MD平板上，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，然后將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子涂于不同濃度的G418平板上，根據(jù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子對(duì)G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽(yáng)性重組菌株。將多拷貝陽(yáng)性重組菌株接種在BMGY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收集細(xì)胞；再將細(xì)胞置于含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)144h，離心收集細(xì)胞，用水沖洗后，接種至YGC培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)120h，然后3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌后再用50mM pH7.0磷酸緩沖液洗滌，然后與2倍體積油酸混合，-80°C下預(yù)凍后再經(jīng)德國(guó) Christ真空冷凍干燥機(jī)干燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進(jìn)行再真空干燥去除己烷，即得到經(jīng)生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。實(shí)施例2酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯實(shí)例1取蔗糖0. 2g、棕櫚酸0. 5g，加入含有IOmL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、預(yù)熱 IOmin,然后加入酵母展示脂肪酶0. Olg，置于水浴搖床開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在50°c，反應(yīng)1 后加入0. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子篩，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得蔗糖棕櫚酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)例2取蔗糖lg、棕櫚酸lg，加入含有IOmL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、預(yù)熱 IOmin,然后加入酵母展示脂肪酶0. 02g,置于水浴搖床開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在，反應(yīng)1 后加入0. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子篩，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得蔗糖棕櫚酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成蔗糖棕櫚酸酯取蔗糖0. 2g、棕櫚酸0. 5g，加入含有IOmL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin， 置于水浴搖床開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在50°C，反應(yīng)1 后加入0. 5g 分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后，離心沉淀除去分子篩，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得蔗糖棕櫚酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)施例4測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率用硅膠G薄層板，于105 °C活化lh，展開劑為氯仿甲醇醋酸= 4 4 3(v ν)，以5%蒽酮溶液(溶劑為氯仿甲醇=1 1, ν ν)為顯色劑，把噴有顯色劑的硅膠板置于110°C加熱lOmin。蔗糖酯顯藍(lán)紫色，蔗糖為蘭色(原點(diǎn))。反應(yīng)物體系在反應(yīng)前、后分別加20mL丙酮/乙醇(1 1, ν v)，以酚酞作指示劑，用0.07mol/L 的KOH溶液滴定，分別取平均值作為酸值，以體系酸值的降低值確定酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。產(chǎn)率計(jì)算公式如下產(chǎn)率=C ester X η式中C ester為滴點(diǎn)測(cè)定樣品中蔗糖棕櫚酸酯的濃度，η為樣品稀釋倍數(shù)。酯化反應(yīng)效率轉(zhuǎn)化率(％ ) = (1-產(chǎn)物酸值/棕櫚酸酸值)X 100%通過上述方法檢測(cè)計(jì)算，實(shí)施例2中，實(shí)例1合成蔗糖棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率達(dá) 80.5%,實(shí)例2合成蔗糖棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率達(dá)82. 3%。而實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成蔗糖棕櫚酸酯的轉(zhuǎn)化率僅為50%左右。
權(quán)利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯的方法，包括將蔗糖和棕櫚酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，于50 60°C反應(yīng)10 14小時(shí)，分離、純化制得蔗糖棕櫚酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號(hào)肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升有機(jī)溶劑計(jì)，蔗糖、棕櫚酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 IOOgU 2g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為叔丁醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物印跡中采用的配體為油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕櫚酸酯的方法，包括將蔗糖和棕櫚酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反應(yīng)10～14小時(shí)，分離、純化制得蔗糖棕櫚酸酯；將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS 115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；本發(fā)明通過將脂肪酶展示在細(xì)胞外，利用該酶制劑催化合成蔗糖棕櫚酸酯，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，而且縮短了反應(yīng)時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102212590SQ20111010873
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者何國(guó)慶, 周陳偉, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 迪拉熱木, 阮暉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)