專利名稱：軍團(tuán)菌的活菌檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及軍團(tuán)菌活菌的檢測方法，本發(fā)明還涉及 用于該方法的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
準(zhǔn)確地對環(huán)境中細(xì)菌進(jìn)行定性定量檢測，對于有效監(jiān)測病原細(xì)菌的繁殖和 傳播，預(yù)防疾病的發(fā)生，保障食品安全和維護(hù)公共衛(wèi)生利益具有重要意義。由軍團(tuán)菌 (Legionella)引起的軍團(tuán)菌病是非典型肺炎的重要組成部分，該菌是水環(huán)境中一種常見的 微生物，它廣泛存在于各種自然水體中，人工環(huán)境中的中央空調(diào)冷卻塔水和冷凝水、冷熱水 管道、溫泉水、游泳池以及養(yǎng)魚池水都是軍團(tuán)菌滋生繁殖的場所。軍團(tuán)菌的菌體微小，人在 正常呼吸時(shí)，會(huì)將空氣中含有軍團(tuán)菌的氣溶膠吸入呼吸道內(nèi)，致使軍團(tuán)菌有機(jī)會(huì)侵染肺泡 巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致軍團(tuán)菌病的發(fā)生。由于軍團(tuán)菌營養(yǎng)要求較高以及標(biāo)本中雜菌較多等因素，分 離培養(yǎng)較為困難，因此提高空調(diào)冷卻水中軍團(tuán)菌的檢出率，對于預(yù)防軍團(tuán)病的發(fā)生非常重 要。目前，國內(nèi)外軍團(tuán)菌活菌定量的檢測方法主要有平板分離培養(yǎng)法，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法。前者操作繁瑣，耗時(shí)較長，花費(fèi)高，對培養(yǎng)基的要求高，條件不同的實(shí)驗(yàn)室之間檢 測的靈敏度存在較大的差異性，不易評價(jià)和質(zhì)量控制。熒光定量PCR技術(shù)與細(xì)菌分離培養(yǎng) 法相比具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，有利于細(xì)菌的早期檢測。但其檢 測針對樣品中核酸的存在與否以及拷貝數(shù)，并不能真正的反映樣品中死菌和活菌的數(shù)量， 導(dǎo)致假陽性率高，對于環(huán)境標(biāo)本的檢測其重復(fù)性和穩(wěn)定性并不理想。傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)的軍團(tuán)菌 檢測法是當(dāng)今國際上主流的軍團(tuán)菌檢測方法。該方法被公認(rèn)主要存在以下幾方面不足。 (1)傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果誤差大。條件不同的實(shí)驗(yàn)室之間檢測的靈敏度存在較大的差異性， 不易評價(jià)和質(zhì)量控制。由于各個(gè)現(xiàn)場提供的監(jiān)測數(shù)據(jù)無法直接進(jìn)行比較，因此導(dǎo)致對各現(xiàn) 場軍團(tuán)菌發(fā)生狀況無法精確調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，對大范圍的疾病檢測控制工作造成困難。(2)傳 統(tǒng)方法檢測步驟繁瑣，檢測周期較長，花費(fèi)較高，無法第一時(shí)間對軍團(tuán)菌的發(fā)生狀況進(jìn)行掌 控。(劉文華，謝風(fēng)，何成彥.軍團(tuán)菌的實(shí)驗(yàn)診斷方法及其研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2006,10(4) :427-429)。普通PCR技術(shù)與其它檢測方法相比具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作 簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，更有利于軍團(tuán)菌的早期診斷。但其假陽性出現(xiàn)率較高，重復(fù)性和穩(wěn)定性 有待進(jìn)一步的研究。熒光PCR已經(jīng)展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于環(huán)境中軍團(tuán)菌的分離和數(shù)量 的檢測。盡管熒光PCR的檢測靈敏度比較高，但其檢測結(jié)果針對樣品中核酸的存在與否以 及拷貝數(shù)，并不能真正的反應(yīng)樣品中死菌和活菌的數(shù)量。在水質(zhì)檢測方面，死菌DNA長期存 在使基因水平的檢測方法高估了樣品中活菌的水平。如何快速準(zhǔn)確的鑒定出環(huán)境水中軍團(tuán) 菌活菌的數(shù)量，并把其和死亡菌做出正確的對比是長期以來困擾我們的一大難題。溴乙錠類化合物是一種熒光核酸插入染料，同時(shí)也是一種抗寄生蟲活性藥物。單 疊氮溴乙啶(ethidium monoazidem EMA)是為了光學(xué)標(biāo)記DNA而合成的一種疊氮乙錠衍 生物。近年來，利用其對活菌和死亡菌細(xì)胞壁的穿透作用的不同，能迅速區(qū)別活菌和死菌的技術(shù)在國外已有報(bào)道(Rueckert, A.，Rominus, R. S.，and Morgan, H. W. 2005. Rapid differentiation and enum eration of the total, viable vegetative celland spore content of thermophilic bacilli in milk powders with referenceto Anoxybacillus flavithermus. J. Appl. Microbiol. 99 :1246-1255.)。EMA 單純只能進(jìn)入那些損害細(xì)胞內(nèi)的 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，隨后共價(jià)結(jié)合在細(xì)菌的DNA上。隨后，通過可視光的光解作用，EMA所產(chǎn) 生的氮烯共價(jià)鏈接到染色體DNA上，通過光活化反應(yīng)將DNA裂解成小碎段。與此相比，未結(jié) 合EMA的完整細(xì)胞仍然能在水溶液中保持一種自由的狀態(tài)。也就是說，活菌細(xì)胞因具有完 整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使其得到保護(hù)不受EMA共價(jià)反應(yīng)的影響。EMA能選擇性進(jìn)入死菌的細(xì) 胞質(zhì)，通過光活化反應(yīng)裂解染色體DNA，從而使其在熒光定量PCR反應(yīng)中不能發(fā)生擴(kuò)增。因 此，EMA結(jié)合熒光定量PCR的方法將能區(qū)別活菌DNA和死菌DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種軍團(tuán)菌的活菌檢測方法，用以克服現(xiàn)有技術(shù)中無法準(zhǔn) 確快速鑒定出環(huán)境中軍團(tuán)菌活菌數(shù)量的問題；本發(fā)明還在于提供一種用于軍團(tuán)菌活菌檢測的試劑盒。本發(fā)明提供了一種軍團(tuán)菌的活菌檢測方法，該方法首先利用EMA降解待檢樣品中 死菌胞內(nèi)DNA，再提取待檢樣品DNA，通過熒光定量PCR檢測樣品中軍團(tuán)菌的活菌數(shù)。具體地，本發(fā)明方法包括如下步驟1)水樣品離心濃縮處理；2)向待檢樣品中加入EMA至終濃度為1 5 μ g/ml，暗處孵育8 12min，可視光 光照處理1 5min ；3)提取步驟2)處理后的樣品DNA ；4)以步驟3)提取的樣品DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測目標(biāo)菌的活菌數(shù)；當(dāng)待檢樣品不是水溶液時(shí)，先將待檢樣品制成菌液。其中，步驟1)對樣品離心濃縮處理的目的是為了獲得較高濃度的菌體，以便后續(xù) 進(jìn)一步操作。對于某些樣本由于濃度菌體含量較低，通過濃縮后可以增加其檢出率。水樣 品的濃縮處理可以通過離心實(shí)現(xiàn)，例如在5000 7000g下離心10 15分鐘。其中，步驟2)宜在4°C下進(jìn)行相關(guān)操作，優(yōu)選向待檢樣品中加入EMA至終濃度為 5μ g/ml，4°C下暗處孵育IOmin ；4°C下可視光離樣本15厘米處，光照處理5min。然后離心 收集菌體，用于后續(xù)的DNA提取。光照處理可以使用鹵素?zé)?，例如在本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選使 用500W的鹵素?zé)糇鳛楣庠?。其中，步驟3)提取軍團(tuán)菌DNA的方法可以是本領(lǐng)域所知的任何方法，包括但不限 于CTAB法、酚/氯仿法、chelexlOO等等。其中，步驟4)熒光定量PCR所用的引物可以是5s rRNA引物，優(yōu)選引物序列為，上游5，-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3，，下游5，-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3，；所用探針為HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。此外，本發(fā)明還提供檢測軍團(tuán)菌活菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中 20 μ 1反應(yīng)液的具體配置為
權(quán)利要求
1.一種軍團(tuán)菌(Legionella)的活菌檢測方法，該方法首先利用EMA降解待檢樣品中死 菌胞內(nèi)DNA，再提取待檢樣品DNA，通過熒光定量PCR檢測樣品中軍團(tuán)菌的活菌數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)水樣品離心濃縮處理；2)向待檢樣品中加入EMA至終濃度為1 5μ g/ml，暗處孵育8 12min，然后光照處 理1 5min ；3)提取步驟2)處理后的樣品DNA；4)以步驟3)提取的樣品DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測目標(biāo)菌的活菌數(shù)； 當(dāng)待檢樣品不是水溶液時(shí)，還包括在步驟1)前將待檢樣品制成菌液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，其中步驟2)向待檢樣品中加入EMA至 終濃度為5μ g/ml，4°C下暗處孵育IOmin ；4°C下500瓦鹵素?zé)綦x樣本15厘米處，光照處理 5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，熒光定量PCR所用引物序列為，上游5，-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3，， 下游5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3，； 所用探針為HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其 中20 μ 1反應(yīng)液的具體配置為
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述20 μ 1反應(yīng)液的具體配置為
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)；95°C變性5s，60°C退火20s，50個(gè)循環(huán)。
8.用于軍團(tuán)菌(Legionella)活菌檢測的試劑盒，其包括EMA、軍團(tuán)菌熒光定量檢測引 物和探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述引物為 上游5，-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3，，下游5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3，；所述探針為HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。
全文摘要
本發(fā)明提供了軍團(tuán)菌活菌的檢測方法，該方法利用EMA降解待檢樣品中死菌胞內(nèi)DNA，再提取待檢樣品DNA，通過熒光定量PCR檢測樣品中軍團(tuán)菌的活菌數(shù)。本發(fā)明方法可以只檢測出軍團(tuán)菌活菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)。本發(fā)明還提供了用于該方法的檢測試劑盒。將此技術(shù)運(yùn)用到環(huán)境水樣軍團(tuán)菌的檢測中，并與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法、普通PCR法、普通熒光定量PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果證明本發(fā)明靈敏快速、污染率低、成本低，能準(zhǔn)確地對軍團(tuán)菌活菌進(jìn)行定性和定量檢測，可用于對環(huán)境水源軍團(tuán)菌污染的監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/06GK102146480SQ201110109509
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者任紅宇, 盧金星, 秦天, 邵祝軍 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所