專利名稱：多疣壁虎Hoxc10蛋白的體外表達及多克隆抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多疣壁虎HoxclO蛋白的體外表達及多克隆抗體制備方法。
背景技術(shù)：
同源異型框基因(homeobox gene，Hox)，編碼一個高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家系，這些轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生中起關(guān)鍵作用，能夠維持正常的體節(jié)形成，菱腦原節(jié)形成和發(fā)育，以及后腦和各個器官、組織及四肢的正常的分化和發(fā)育。HoxclO是Hox基因家族中一位重要的成員。已有研究表明，HoxclO不僅影響脊椎動物的胚胎發(fā)育，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，同時也影響脊椎動物的斷肢及尾部的再生過程。市場上多是針對小鼠、人及大鼠 HoxclO的抗體，這些抗體與羊、兔、猴等有一定的交叉反應(yīng)，針對多疣壁虎的HoxclO蛋白高特異性、高滴度的抗體目前還沒有。為進一步探究HoxclO在多疣壁虎斷尾再生過程中的作用及其他相關(guān)生物學(xué)功能，本專利擬制備兔源抗多疣壁虎HoxclO抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能大量制備出高質(zhì)量的抗多疣壁虎HoxclO蛋白抗體的多疣壁虎HoxclO蛋白的體外表達及多克隆抗體制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
步驟1)、多疣壁虎HoxclO的EST序列的獲得
根據(jù)同源比對小鼠、人、雞等物種HoxclO基因序列，設(shè)計一對簡并引物，序列如下 上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ； 下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’， 基因克隆獲得多疣壁虎HoxclO的EST序列。步驟2)、多疣壁虎HoxclO全長序列獲得
RACE法獲得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，與EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全長序列，共包含2156bp，其ORF區(qū)位于112_1242bp，共編碼376個氨基酸。 經(jīng)生物學(xué)相關(guān)分析確認為多疣壁虎HoxclO基因。GenBank登陸號GQ267528. 1
步驟3)、使用DNA STAR軟件和SWISS-PLOT在線預(yù)測多疣壁虎HoxclO抗原表位，通過綜合分析發(fā)現(xiàn)HoxclO抗原表位極有可能位于氨基酸4-6，21-24，27，29-30, 36-42，45，57，7 2-73，78-81, 83-85, 99，
131-132, 136，147-149，153-154，162-165，205-206，209，211，216-217， 226，233-234，240-241，271-274，295，301-302，308-310，337，370，372-373。本專利選取含有預(yù)測抗原表位較多的96-191片段為免疫肽段(對應(yīng)397-684核苷酸序列)。步驟4)、構(gòu)建HoxclO的原核表達載體
1.設(shè)計構(gòu)建HoxclO原核表達載體的引物，上游引物5’端加上B10 I酶切位點及其保護堿基和補充堿基使其不出現(xiàn)移碼，序列為5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位點及其保護堿基和補充堿基使其不出現(xiàn)移碼，序列為5，- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3，； 2.取多疣壁虎腦，脊髓及部分其他組織，用Trizol試劑法提取總RNA ；3. RT-PCR擴增用 QIAGEN公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2 μ g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA ；4.采用原核表達引物，以合成的cDNA為模板進行多疣壁虎HoxclO的397-684核苷酸序列(對應(yīng)蛋白表位優(yōu)勢肽段96-191) PCR擴增；5.用限制性內(nèi)切酶)(ho I、EcoR I消化HoxclO的PCR產(chǎn)物和PGEX-4T1原核表達載體質(zhì)粒，并進行酶切產(chǎn)物的膠回收。6.連接用T4 DNA連接酶將 PCR酶切回收產(chǎn)物和PGEX-4T1原核表達載體質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物連接；7.感受態(tài)細胞的制備用無菌接種棒從_70°C保存的DH5 α菌株中蘸少許菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板， 37°C培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)搖床中于37°C、250轉(zhuǎn)/ 分震蕩培養(yǎng)12小時。取0. 5ml該菌液接種于無氨芐青霉素IOOml LB液體培養(yǎng)基中，37°C 震蕩培養(yǎng)2-2. 5小時，至OD6tltl為0. 4-0. 5時，放置于4°C冰箱冷卻1_2小時。將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4°C離心，4000gX10分鐘，棄去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml懸浮 30分鐘。4°C離心，4000gX10分鐘，棄去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml懸浮。 以100 μ 1/管分裝入1. 5ml離心管中，-70°C凍存?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化取5μ 1 DNA 連接產(chǎn)物加入100 μ 1感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)數(shù)次使DNA分散均勻，冰浴30分鐘，42°C水浴中熱休克90秒，繼續(xù)冰浴2-3分鐘后加入LB培養(yǎng)基200 μ 1，于37°C緩搖孵育60分鐘， 將培養(yǎng)物適量涂于1. 5%瓊脂LB平板(含氨芐青霉素)，待膠表面沒有液體流動時，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12-16小時；9.重組克隆的篩選及酶切鑒定從上述培養(yǎng)板中挑取6個克隆接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，以堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶消化1小時，電泳鑒定DNA目的片斷是否正確構(gòu)建于表達載體中；10.將雙酶切鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒進行測序鑒定，其測序結(jié)果序列與基因庫中397-684核苷酸序列完全一致。 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG
步驟5)、目的蛋白的表達BL21感受態(tài)細胞的制備(方法同上述DH5ci感受態(tài)細胞的制備)。用鑒定正確的pGEX-4Tl-HoXC10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至anl LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50mg/L)中37°C震蕩培養(yǎng)過夜。將Iml菌液加入到含50ml LB培養(yǎng)基的IOOOml培養(yǎng)瓶中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6左右，取Iml菌液作為未誘導(dǎo)的對照組，余下菌液中加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0. 2 mm0l/L，3(TC誘導(dǎo)6小時。同時以轉(zhuǎn)化了 pGEX_4Tl載體的BL21細菌作陰性對照。將誘導(dǎo)、 末誘導(dǎo)的含PGEX-4T1載體的BL21菌液各1ml，室溫IOOOOg離心1分鐘，棄去上清，0. OlM PBS 500ml重懸，加入等體積2 X SDS電泳上樣緩沖液，100°C煮沸5分鐘，然后以12000g 離心1分鐘，在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠中各加入20 μ 1懸液，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后檢測融合蛋白表達情況；步驟6)、目的蛋白的純化證實有目的蛋白表達后，將20ml轉(zhuǎn)化了 pGEX-4Tl-HoXC10 的BL21細菌接種到1000ml LB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37°C震蕩培養(yǎng)至0D_為0. 6左右， 加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0. 2 mmOl/L，30°C誘導(dǎo)6小時。菌液離心,超聲破碎后，用 GE healthcare 公司的 glutathione sepharose 吸附 GST-HoxclO 融合蛋白。用10 mM的還原型GSH洗脫glutathione s印harose，將洗脫液放入預(yù)處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4°C透析M小時，收集透析后的液體。用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測經(jīng)過洗脫、透析后的GST-HoxclO融合蛋白。步驟7)、多克隆抗體的制備參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，定量透析后蛋白質(zhì)的濃度并取一定量用于新西蘭大白兔的免疫。第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等體積(1 ml)的Freud’ s完全佐劑乳化完全，于皮下多點免疫；第一次免疫M天后進行第二次免疫，使用0. 5mg融合蛋白與等體積的Freud’ s完全佐劑乳化完全進行皮下多點免疫；第一次免疫42天后進行第三次免疫，使用0. 5mg融合蛋白與等體積的Freud’ s 不完全佐劑乳化完全進行皮下多點免疫；末次免疫10天后，Elisa檢測HoxclO抗血清達到效價后，心臟取血，免疫血清儲存于_80°C備用。使用制備的HoxclO抗血清對細菌目的蛋白條帶和動物組織中的HoxclO蛋白進行檢測，確定抗血清的特異性，并用于多克隆抗體的純化。本發(fā)明所述制備的兔源抗多疣壁虎HoxclO蛋白多克隆抗體，體內(nèi)外均可特異性的與多疣壁虎HoxclO蛋白相結(jié)合。本發(fā)明的優(yōu)越性在于以PGEX-4T1為基礎(chǔ)所構(gòu)建的體外HoxclO表達系統(tǒng)在 BL 21中能高效地表達目的蛋白，進一步以成熟的方法進行純化，可方便地獲得大量的 GST-HoxclO融合蛋白。另外，經(jīng)此蛋白免疫新西蘭大白兔所制備的兔源抗多疣壁虎HoxclO 抗血清滴度高、特異性好，完全可以滿足相關(guān)實驗的需要。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1是多疣壁虎HoxclO優(yōu)勢表位肽段構(gòu)建入原核表達載體的測序結(jié)果示圖。 圖2是原核表達質(zhì)粒pGEX-4T I-Hoxc 10構(gòu)建示圖。圖3是GST-HoxclO融合蛋白的誘導(dǎo)表達電泳示圖
圖 4 是 GST-HoxclO 經(jīng) glutathione sepharose 純化后電泳示5是制備的抗體與細菌表達的HoxclO融合蛋白Western Blot結(jié)果示6是制備的抗體與多疣壁虎各組織中的HoxclO蛋白Western Blot結(jié)果示7是制備的抗體與多疣壁虎脊髓組織中的HoxclO蛋白免疫組化結(jié)果示圖。圖3中M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1 未誘導(dǎo)的含PGEX-4T1質(zhì)粒的細菌總蛋白； 2 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-4Tl質(zhì)粒的細菌總蛋白；3 未誘導(dǎo)的含pGEX_4TI-Hoxc 10質(zhì)粒的細菌總蛋白；4 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-4Tl- HoxclO質(zhì)粒的細菌總蛋白。圖4中1 經(jīng)glutathione sepharose純化后的GST-HoxclO融合蛋白；2 未誘導(dǎo)的含pGEX-4Tl質(zhì)粒的細菌總蛋白；3 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含pGEX_4Tl質(zhì)粒的細菌總蛋白；4 未誘導(dǎo)的含pGEX-4Tl-HoxclO質(zhì)粒的細菌總蛋白；5 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含pGEX_4Tl_ HoxclO 質(zhì)粒的細菌總蛋白；箭頭表示GST-HoxclO融合蛋白。
圖 5 中 1 經(jīng) glutathione sepharose 純化后 GST-HoxclO 融合蛋白；2 經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的含PGEX-4T1質(zhì)粒的細菌總蛋白；箭頭所示分別為37 kD HoxclO蛋白和沈kD GST蛋白。圖6中1 壁虎睪丸組織總蛋白；2 壁虎腎組織總蛋白；3 壁虎肺組織總蛋白； 4 壁虎心組織總蛋白；5 壁虎脊髓組織總蛋白；6 壁虎腦組織總蛋白；7 壁虎肝組織總蛋白；箭頭所示為41 kD HoxclO蛋白。圖7中A:多疣壁虎脊髓組織中TRITC標(biāo)記的HoxclO蛋白，bar=20 μ m ；B:Hoechst 標(biāo)記細胞核，bar=20ym;C:A圖與B圖疊加，bar=20ym;D: C圖矩形區(qū)域的放大，箭頭標(biāo)記 HoxclO 蛋白，bar=20 μ m。
具體實施例方式步驟1)、多疣壁虎HoxclO的EST序列的獲得
根據(jù)同源比對小鼠、人、雞等物種HoxclO基因序列，設(shè)計一對簡并引物，序列如下 上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ； 下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’， 基因克隆獲得多疣壁虎HoxclO的EST序列。步驟2)、多疣壁虎HoxclO全長序列獲得
RACE法獲得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，與EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全長序列，共包含2156bp，其ORF區(qū)位于112_1242bp，共編碼376個氨基酸。 經(jīng)生物學(xué)相關(guān)分析確認為多疣壁虎HoxclO基因。GenBank登陸號GQ267528. 1
步驟3)、使用DNA STAR軟件和SWISS-PLOT在線預(yù)測多疣壁虎HoxclO抗原表位，通過綜合分析發(fā)現(xiàn)HoxclO抗原表位極有可能位于氨基酸4-6，21-24，27，29-30, 36-42，45，57，7 2-73，78-81, 83-85, 99，
131-132, 136，147-149，153-154，162-165，205-206，209，211，216-217， 226，233-234，240-241，271-274，295，301-302，308-310，337，370，372-373。本專利選取含有預(yù)測抗原表位較多的96-191片段為免疫肽段(對應(yīng)397-684核苷酸序列)。步驟4)、構(gòu)建HoxclO的原核表達載體
1.設(shè)計構(gòu)建HoxclO原核表達載體的引物，上游引物5’端加上B10 I酶切位點及其保護堿基和補充堿基使其不出現(xiàn)移碼，序列為
5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位點及其保護堿基和補充堿基使其不出現(xiàn)移碼，序列為5，- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3，； 2.取多疣壁虎腦，脊髓及部分其他組織，用Trizol試劑法提取總RNA ；3. RT-PCR擴增用 QIAGEN公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2 μ g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA ；4.采用原核表達引物，以合成的cDNA為模板進行多疣壁虎HoxclO的397-684核苷酸序列(對應(yīng)蛋白表位優(yōu)勢肽段96-191) PCR擴增；5.用限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I消化HoxclO的PCR產(chǎn)物和PGEX-4T1原核表達載體質(zhì)粒，并進行酶切產(chǎn)物的膠回收。6.連接用T4 DNA連接酶將 PCR酶切回收產(chǎn)物和PGEX-4T1原核表達載體質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物連接；7.感受態(tài)細胞的制備用無菌接種棒從_70°C保存的DH5 α菌株中蘸少許菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，
737°C培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)搖床中于37°C、250轉(zhuǎn)/ 分震蕩培養(yǎng)12小時。取0. 5ml該菌液接種于無氨芐青霉素100ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C 震蕩培養(yǎng)2-2. 5小時，至OD6tltl為0. 4-0. 5時，放置于4°C冰箱冷卻1_2小時。將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4°C離心，4000gX10分鐘，棄去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml懸浮 30分鐘。4°C離心，4000gX10分鐘，棄去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml懸浮。 以100 μ 1/管分裝入1. 5ml離心管中，-70°C凍存?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化取5μ 1 DNA 連接產(chǎn)物加入100 μ 1感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)數(shù)次使DNA分散均勻，冰浴30分鐘，42°C水浴中熱休克90秒，繼續(xù)冰浴2-3分鐘后加入LB培養(yǎng)基200 μ 1，于37°C緩搖孵育60分鐘， 將培養(yǎng)物適量涂于1. 5%瓊脂LB平板(含氨芐青霉素)，待膠表面沒有液體流動時，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12-16小時；9.重組克隆的篩選及酶切鑒定從上述培養(yǎng)板中挑取6個克隆接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，以堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶消化1小時，電泳鑒定DNA目的片斷是否正確構(gòu)建于表達載體中；10.將雙酶切鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒進行測序鑒定，其測序結(jié)果序列與基因庫中397-684核苷酸序列完全一致。1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC
101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG
步驟5)、目的蛋白的表達BL21感受態(tài)細胞的制備。用鑒定正確的pGEX-4Tl-HoXC10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至aiil LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素 50mg/L)中37°C震蕩培養(yǎng)過夜。將Iml菌液加入到含50ml LB培養(yǎng)基的IOOOml培養(yǎng)瓶中， 37°C震蕩培養(yǎng)至0D_為0. 6左右，取Iml菌液作為未誘導(dǎo)的對照組，余下菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0. 2 mmOl/L，30°C誘導(dǎo)6小時。同時以轉(zhuǎn)化了 PGEX-4T1載體的BL21細菌作陰性對照。將誘導(dǎo)、末誘導(dǎo)的含pGEX_4Tl載體的BL21菌液各 lml，室溫IOOOOg離心1分鐘，棄去上清，0. OlM PBS 500ml重懸，加入等體積2 X SDS電泳上樣緩沖液，100°C煮沸5分鐘，然后以12000g離心1分鐘，在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠中各加入20 μ 1懸液，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后檢測融合蛋白表達情況； 步驟6)、目的蛋白的純化證實有目的蛋白表達后，將20ml轉(zhuǎn)化了 pGEX-4Tl-HoXC10 的BL21細菌接種到1000ml LB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37°C震蕩培養(yǎng)至0D_為0. 6左右， 加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0. 2 mmOl/L，30°C誘導(dǎo)6小時。菌液離心,超聲破碎后，用 GE healthcare 公司的 glutathione sepharose 吸附 GST-HoxclO 融合蛋白。用10 mM的還原型GSH洗脫glutathione s印harose，將洗脫液放入預(yù)處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4°C透析M小時，收集透析后的液體。用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測經(jīng)過洗脫、透析后的GST-HoxclO融合蛋白。步驟7)、多克隆抗體的制備參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，定量透析后蛋白質(zhì)的濃度并取一定量用于新西蘭大白兔的免疫。第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等體積(1 ml)的Freud’ s完全佐劑乳化完全，于皮下多點免疫；第一次免疫M天后進行第二次免疫，使用0. 5mg融合蛋白與等體積的Freud’ s完全佐劑乳化完全進行皮下多點免疫；第一次免疫42天后進行第三次免疫，使用0. 5mg融合蛋白與等體積的Freud’ s 不完全佐劑乳化完全進行皮下多點免疫；末次免疫10天后，Elisa檢測HoxclO抗血清達到效價后，心臟取血，免疫血清儲存于_80°C備用。使用制備的HoxclO抗血清對細菌目的蛋白條帶和動物組織中的HoxclO蛋白進行檢測，確定抗血清的特異性，并用于多克隆抗體的純化。 制備BL21感受態(tài)細胞的方法是用無菌接種棒從_70°C保存的BL21菌株中蘸菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，37°C培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)搖床中于37°C、250轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12小時；取0. 5ml該菌液接種于無氨芐青霉素100ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)2-2. 5小時，至OD600為0. 4-0. 5時，放置于4°C冰箱冷卻1-2小時；將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4°C離心，4000gX10分鐘，棄去上清， 用冰浴的0. IM MgCl2 25ml懸浮30分鐘；4°C離心，4000gX 10分鐘，棄去上清，加入冰浴的 0. IM CaCl2-甘油溶液Iml懸?。灰?00 μ 1/管分裝入1. 5ml離心管中，_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1. 一種多疣壁虎HoxclO蛋白的體外表達及多克隆抗體制備方法，其特征是包括下列步驟(1)多疣壁虎HoxclO的EST序列的獲得根據(jù)同源比對小鼠、人、雞物種HoxclO基因序列，設(shè)計一對簡并引物，序列如下上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ；下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’，基因克隆獲得多疣壁虎HoxclO的EST序列；(2)多疣壁虎HoxclO全長序列獲得RACE法獲得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，與EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全長序列，共包含2156bp，其ORF區(qū)位于112_1242bp，共編碼376個氨基酸； 經(jīng)生物學(xué)相關(guān)分析確認為多疣壁虎HoxclO基因，GenBank登陸號GQ267528. 1 ；(3)使用DNASTAR軟件和SWISS-PLOT在線預(yù)測多疣壁虎HoxclO抗原表位，選取 96-191片段為免疫肽段，對應(yīng)397-684核苷酸序列；(4)構(gòu)建HoxclO的原核表達載體設(shè)計構(gòu)建HoxclO原核表達載體的引物，上游引物5’端加上Bio I酶切位點及其保護堿基和補充堿基使其不出現(xiàn)移碼，序列為5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位點及其保護堿基和補充堿基使其不出現(xiàn)移碼，序列為5’ - CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’ ； 取多疣壁虎腦及脊髓組織，用iTrizol試劑法提取總RNA ； RT-PCR擴增用QIAGEN公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2 μ g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA ；采用原核表達引物，以合成的cDNA為模板進行多疣壁虎HoxclO的對應(yīng)蛋白表位優(yōu)勢肽段96-191的397-684核苷酸序列，PCR 擴增；用限制性內(nèi)切酶》io I ,EcoR I消化HoxclO的PCR產(chǎn)物和pGEX-4Tl原核表達載體質(zhì)粒，并進行酶切產(chǎn)物的膠回收；連接用jM DNA連接酶將PCR酶切回收產(chǎn)物和PGEX-4T1原核表達載體質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物連接；感受態(tài)細胞的制備用無菌接種棒從-70°C保存的 DH5 α菌株中蘸菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，37°C培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)搖床中于37°C、250轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12小時；取0. 5ml該菌液接種于無氨芐青霉素IOOml LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)2-2. 5小時，至0D_為0. 4-0. 5 時，放置于4°C冰箱冷卻1-2小時；將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4°C離心，4000gX 10 分鐘，棄去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml懸浮30分鐘；4°C離心，4000gX 10分鐘，棄去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml懸??；以100 μ 1/管分裝入1. 5ml離心管中，-70°C凍存?zhèn)溆?；重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化取5μ 1 DNA連接產(chǎn)物加入100 μ 1感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)數(shù)次使DNA分散均勻，冰浴30分鐘，42°C水浴中熱休克90秒，繼續(xù)冰浴2_3分鐘后加入LB培養(yǎng)基200 μ 1，于37°C搖孵育60分鐘，將培養(yǎng)物涂于含氨芐青霉素的1. 5%瓊脂LB 平板，待膠表面沒有液體流動時，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12-16小時；重組克隆的篩選及酶切鑒定從上述培養(yǎng)板中挑取6個克隆接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，以堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶消化1小時，電泳鑒定DNA目的片斷是否正確構(gòu)建于表達載體中；將雙酶切鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒進行測序鑒定，其測序結(jié)果序列與基因庫中397-684核苷酸序列完全一致1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGMAATGCCTG.51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG ；(5 )目的蛋白的表達制備BL21感受態(tài)細胞；用鑒定正確的pGEX-4T I-Hoxc 10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至含氨芐青霉素50mg/L的 2ml LB培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)過夜；將Iml菌液加入到含50ml LB培養(yǎng)基的IOOOml培養(yǎng)瓶中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.6，取Iml菌液作為未誘導(dǎo)的對照組，余下菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度為0. 2 mm0l/L，3(TC誘導(dǎo)6小時；同時以轉(zhuǎn)化了 PGEX-4T1載體的BL21細菌作陰性對照；將誘導(dǎo)、末誘導(dǎo)的含pGEX_4Tl載體的BL21菌液各 lml，室溫IOOOOg離心1分鐘，棄去上清，0. OlM PBS 500ml重懸，加入等體積2 X SDS電泳上樣緩沖液，100°C煮沸5分鐘，然后以12000g離心1分鐘，在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠中各加入20 μ 1懸液，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后檢測融合蛋白表達情況；(6)目的蛋白的純化證實有目的蛋白表達后，將20ml轉(zhuǎn)化了pGEX-4Tl-HoXC10的 BL21細菌接種到1000ml LB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37°C震蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至終濃度為0. 2 mmol/L, 30°C誘導(dǎo)6小時，菌液離心，超聲破碎后，用 GE healthcare 公司的 glutathione s印harose 吸附GST-HoxclO 融合蛋白；用 10 mM 的還原型GSH洗脫glutathione sepharose,將洗脫液放入預(yù)處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4°C透析M小時，收集透析后的液體；用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測經(jīng)過洗脫、透析后的GST-HoxclO融合蛋白；(7)多克隆抗體的制備參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，定量透析后蛋白質(zhì)的濃度并取一定量用于新西蘭大白兔的免疫第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等體積的Freud's完全佐劑乳化完全，于皮下多點免疫；第一次免疫對天后進行第二次免疫， 使用0. 5mg融合蛋白與等體積的Freud’ s完全佐劑乳化完全進行皮下多點免疫；第一次免疫42天后進行第三次免疫，使用0. 5mg融合蛋白與等體積的Freud’ s不完全佐劑乳化完全進行皮下多點免疫；第三次免疫10天后，Elisa檢測HoxclO抗血清達到效價后，心臟取血， 免疫血清儲存于-80°C備用；使用制備的HoxclO抗血清對細菌目的蛋白條帶和動物組織中的HoxclO蛋白進行檢測，確定抗血清的特異性，并用于多克隆抗體的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多疣壁虎HoxclO蛋白的體外表達及多克隆抗體制備方法， 其特征是制備BL21感受態(tài)細胞的方法是用無菌接種棒從_70°C保存的BL21菌株中蘸菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，37°C培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)搖床中于37°C、250轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12小時；取0. 5ml該菌液接種于無氨芐青霉素100ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)2-2. 5小時，至OD600為0. 4-0. 5時，放置于4°C冰箱冷卻1-2小時；將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4°C離心，4000gX10分鐘，棄去上清， 用冰浴的0. IM MgCl2 25ml懸浮30分鐘；4°C離心，4000gX 10分鐘，棄去上清，加入冰浴的 0. IM CaCl2-甘油溶液Iml懸??；以100 μ 1/管分裝入1. 5ml離心管中，_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了多疣壁虎Hoxc10蛋白的體外表達及多克隆抗體制備方法，包括多疣壁虎Hoxc10的EST序列的獲得，RACE法獲得Hoxc10全長序列，采用DNASTAR軟件和SWISS-PLOT在線預(yù)測多疣壁虎Hoxc10蛋白的抗原表位，選取優(yōu)勢表位肽段構(gòu)建Hoxc10的原核表達載體，體外誘導(dǎo)融合蛋白表達，融合蛋白的純化及多克隆抗體的制備等步驟。本發(fā)明以pGEX-4T1為基礎(chǔ)所構(gòu)建的體外Hoxc10表達系統(tǒng)在BL21中能高效地表達目的蛋白，進一步進行純化，可方便地獲得大量的GST-Hoxc10融合蛋白，經(jīng)此蛋白免疫新西蘭大白兔所制備的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特異性好。
文檔編號C12N15/70GK102206647SQ201110113360
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者周曉芳, 陸仁飛, 陳海蓮, 顧星星 申請人:南通大學(xué)