專利名稱：水稻脂肪酸去飽和酶基因OsFAD6編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在水稻中表達的脂肪酸去飽和酶基因0sFAD6的核苷酸編碼序列的克隆，序列的同源比對，重組表達載體構(gòu)建，對水稻此基因內(nèi)源的不同器官、組織的空間表達模式，高鹽、氧化、低溫脅迫處理后的表達模式變化進行分析鑒定所使用的方法，以及轉(zhuǎn)化此基因于酵母INVScI細(xì)胞內(nèi)，進行活細(xì)胞實驗，分子模擬油酸氧化脫氫的過程及抗性改變研究。
背景技術(shù)：
不飽和脂肪酸作為構(gòu)成植物膜脂的主要結(jié)構(gòu)成分之一(Shah et al. , 1997)， 對生物體生長發(fā)育至關(guān)重要。不飽和脂肪酸的含量在大多數(shù)植物組織中占總脂肪酸含量的75%以上(戴曉峰，2007)。并且具有影響植物生長發(fā)育、應(yīng)答各種環(huán)境信號等多種作用 (Klaus et al.，2002 ；代玉華等，2004)。不飽和脂肪酸脫氫酶的活性是影響各種不飽和脂肪酸合成的主要因素，在亞油酸和亞麻酸的合成過程中尤其重要。在擬南芥中研究成果較完整，目前，已經(jīng)分別克隆到了 7 個編碼脂肪酸脫氫酶的基因(/ 似，F(xiàn)AD3, FAD4, FAD5, FAD6, FAD7,FAD8) (Arondel et al. , 1992; Iba et al. , 1993; Yadav et al. , 1993; McConn et al. , 1994; Okuley et al.，1994)。是定位于葉綠體的ω -6不飽和脂肪酸脫氫酶基因，這個酶在單不飽和脂肪酸油酸的12碳和13碳之間引入1個雙鍵變成多不飽和脂肪酸亞油酸，以此控制著植物細(xì)胞中大多數(shù)多不飽和脂肪的合成。不飽和脂肪酸含量越高，那么植物的抗寒性就越強。基因目前已在多個物種中有報道，在高等植物中，這些物種分別是擬南芥(Falcone, Gibson et al. 1994)，大豆(Hitz, Carlson et al. 1994)，甘藍(lán)型油菜(Scheffler, Sharpe et al. 1997)，播娘蒿(Sanyuan, Ji et al. 2007)，油橄欖 (Banilas, Moressis et al. 2005)，馬齒莧(Teixeira, Coelho et al. 2009)和菠菜 (Schmidt, Dresselhaus et al. 1994)。憂外，在MMkChlamydomonasreinhardtii 印敘有
基因的報道(Chi, Zhang et al. 2008)。本發(fā)明通過克隆水稻脂肪酸去飽和酶基因fls/^i^，對其時空表達模式及脅迫響應(yīng)方式進行確定，并且對其脫氫功能進行驗證，結(jié)果顯示基因在各個器官中組成型表達在接受高鹽和低溫處理后，該基因在葉中的表達量下降而在根中的表達量上升；在接受氧化脅迫后，該基因在葉和根中表達量均上升。將《s/^i^轉(zhuǎn)入酵母INVScI細(xì)胞后，檢測酵母細(xì)胞內(nèi)亞油酸與油酸含量變化。結(jié)果顯示該基因的轉(zhuǎn)入能夠?qū)е陆湍讣?xì)胞內(nèi)產(chǎn)生亞油酸的生成，揭示該基因具有油酸去飽和酶的作用，從而為可控地改變水稻脂肪酸組成及最終為提高水稻耐冷以及其他脅迫抗性提高的分子育種提供基因來源與技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的水稻基因，還提供該水稻基因的蛋白編碼序列， 并提供該水稻基因的應(yīng)用。
本發(fā)明從水稻中克隆出一種新的水稻基因，命名為fls/^i^。為具有特定序列的 DNA分子，全長1365bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，并將其與其他物種中脂肪酸去飽和酶基因家族中的成員進行同源性比對。本發(fā)明還提供這種水稻0sFAD6蛋白編碼序列，有妨4個氨基酸殘基，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明還提供用于調(diào)取獲得水稻樣品中基因0sFAD6的一對核苷酸引物。該引物根據(jù)基因0sFAD6開放閱讀框設(shè)計，使用此對引物對水稻樣品cDNA進行PCR擴增可獲得長 1365bp的基因片段。具體的引物序列信息參見SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。本發(fā)明從水稻中克隆出的基因fls/^i^是脂肪酸去飽和酶基因，該酶對體內(nèi)生成的甘油脂其脂肪酸基團進一步脫氫去飽和，是油酸到亞油酸轉(zhuǎn)變的限速酶。本發(fā)明還提供一種檢測水稻基因fls/^i^在不同器官表達模式的方法，即利所述基因0sFAD6的核苷酸序列作為設(shè)計探針引物的保守區(qū)段，調(diào)取其序列的引物序列SEQ ID NO. 5與SEQ ID N0. 6，對水稻cDNA樣品進行Real-timePCR，然后檢測該基因在根、種子、莖和葉中的表達；樣品為水稻的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA ；其步驟如下
(1)提取水稻器官的總RNA(Trizol，市售)；
(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SEQID N0. 5與SEQ ID N0. 6設(shè)計引物，利用SEQ ID NO. 1的保守區(qū)段84bp作為PCR產(chǎn)物，進行實時定量PCR檢測。本發(fā)明還提供一種檢測水稻基因0sFAD6在高鹽、低溫、氧化脅迫下的表達模式變化的方法，即將水稻進行高鹽、氧化及低溫脅迫處理后，提取水稻葉和根的總RNA ；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID N0. 5與SEQ ID N0. 6，進行定量PCR 檢測。具體操作步驟如下
(1)將兩周大的水稻苗置于0. 25M氯化鈉溶液中，28° C培養(yǎng)Mh以進行高鹽脅迫處理； 置于水中，10° C培養(yǎng)Mh以進行低溫處理；置于6mM過氧化氫溶液中，28° C培養(yǎng)他以進行氧化脅迫處理；置于水中，28° C培養(yǎng)乩及24h作為對照。(2)提取前述個處理的水稻苗的葉和根中的總RNA(Trizol，市售)。(3)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SEQ ID N0. 5與SEQ ID N0. 6設(shè)計引物，利用SEQ ID NO. 1的保守區(qū)段84bp作為PCR產(chǎn)物，進行實時定量PCR檢測。本發(fā)明還提供一種將fls/^i^轉(zhuǎn)入酵母INVkI并檢測生成亞油酸的方法，其步驟如下
(1)使用SEQID N0. 7與SEQ ID N0. 8作為引物，從反轉(zhuǎn)錄得到的水稻cDNA中PCR得到兩端帶有損al/IAoI酶切位點及完整編碼閱讀框(SEQ ID NO. 1)的fls/^i^基因序列，并操作的連接酵母表達載體pYES NT (C) (.XbaI /ZAoI )，形成含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的載體；
(2)將轉(zhuǎn)入pYES-NT(C) -0sFAD6載體與轉(zhuǎn)pYES_NT (C)空載體的兩個酵母菌株分別在含有g(shù)al的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，各取IOml菌液5000rpm離心得到酵母細(xì)胞；
(3)向離心得到的酵母細(xì)胞中加入2.5%硫酸/甲醇溶液1ml，震蕩混勻后在80°C水浴中反應(yīng)1. 5h。加入1. 5ml 0. 9%NaCl溶液和Iml正己烷，震蕩混勻后5000rpm離心IOmin取
上清備用；(4)運用氣相色譜儀器(HP6890 Plus Hewlett - Packard, Wilmington, Del.)分析油酸和亞油酸的含量。程序為起始溫度150 °C 3 min后按照15°C/min的溫度上升速率升溫直至210°C，當(dāng)氣相色譜儀程序進行完畢后機器保持12min后分析結(jié)果。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入基因fls/^i^后，與轉(zhuǎn)空載體對照組相比，可以在酵母中檢測到亞油酸形成。本發(fā)明還提供一種檢測轉(zhuǎn)0sFAD6基因與轉(zhuǎn)空載體的酵母INScI對數(shù)種脅迫的抗性改變的方法，其步驟為
(1)將轉(zhuǎn)化后酵母在液體篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，調(diào)整菌液濃度使二者的起始0D_在 1. 5左右。取20 μ 1菌液在等量液體乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，測量兩者的0D_，并按比例取出保證細(xì)胞數(shù)相等的菌液各約Iml左右，3000rpm離心5min，棄掉培養(yǎng)基，用Iml無菌水懸浮細(xì)胞。并以10倍逐級稀釋6個濃度梯度。(2)將各梯度菌液分別取10 μ 1，滴于相應(yīng)YPD培養(yǎng)基上。除低溫外均在培養(yǎng)2d后照相觀察。低溫處理組在4° C暗處存放6周后置于恢復(fù)培養(yǎng)2d照相觀察。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入基因fls/^i^后，與空載體對照組相比，酵母對脅迫的抗性有顯著提高。以上結(jié)果表明，基因0sFAD6為可控地改變水稻脂肪酸組成及最終為提高水稻耐冷以及其他脅迫抗性的分子育種提供基因來源與技術(shù)基礎(chǔ)。即該基因《s/^i^可用于改良水稻品種，以提高水稻耐冷性及其他脅迫抗性。本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已經(jīng)知道的各種載體，如市售的載體以及質(zhì)粒。


圖1 (A)為對0sFAD6推測編碼氨基酸序列及其同源序列進行氨基酸序列相似性分析的結(jié)果圖示。圖1 (B)為圖1 (A)的續(xù)。圖2為最小進化法對FAD6成員進行系統(tǒng)進化分析圖示。圖3為水稻0sFAD6基因器官表達模式分析圖示。圖4為水稻基因fls/^i^在低溫、高鹽、氧化脅迫下的表達模式分析結(jié)果圖示。其中，A、B為葉中；C、D為根中。圖5為轉(zhuǎn)入0sFAD6基因的酵母INVScI中亞油酸含量變化檢測結(jié)果圖示。圖6為轉(zhuǎn)入基因0sFAD6的酵母INVkI對低溫、氧化、鹽及乙醇脅迫耐受性改變圖示。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅以用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規(guī)方法進行。如 Sambrook 等分子克隆實驗手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件，或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。實施例1水稻基因0sFAD6的克隆。1. /K 稻品種 Nipponbare {Oryza sativa Japonica)在培養(yǎng)箱 (SPX-250-GB, Shanghai, China)中培養(yǎng)生長條件為光周期 16h /8h (L/D)，28°C。
2. RNA提取。取100毫克左右新鮮的水稻植物組織材料，液氮充分研磨。加1 ml Trizol試劑，渦旋15 s后室溫放置5 min。加0.2 ml氯仿，去蛋白，12000rpm離心IOmin后上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min, 12k rpm離心lOmin， 棄上清，用DEPC處理過的水配制的75%乙醇1 ml洗滌沉淀，重復(fù)一次。室溫干燥5_10 min, 溶于20 μ 1 DEPC水中，測OD值，電泳檢測。3.基因的克隆。以逆轉(zhuǎn)錄的水稻cDNA第一鏈為模板，利用正向引物和反向引物進行PCR，獲得基因全長，具體序列信息參見SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4。實施例2水稻基因0sFAD6的同源性以及進化樹分析。利用Clustal. X程序?qū)?sFAD6推測編碼氨基酸序列及其同源序列進行氨基酸序列相似性分析；結(jié)果顯示，在0sFAD6中具有三個組氨酸簇，分別位于其氨基酸序列的78-82 位，208-218位和374-378位(圖1)。同源性比對的結(jié)果顯示，本基因存在三個保守的組氨酸簇結(jié)構(gòu)域HDC*H ；E##*H**HH ；H**HH。以衣藻ChIamydomonasreiz7AariZiii中的FAD6基因為外類群，利用Mega4軟件，最小進化法進行FAD6成員的系統(tǒng)進化分析(圖2);所挑選的序列均系根據(jù)已發(fā)表的成果或通過BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)在線搜索獲得。結(jié)果顯示，各物種中的 FAD6，雙子葉植物、單子葉植物分別聚類在了一起。這說明fls/^i^基因既有FAD6基因在序列上的共同性，亦存在著進化親緣關(guān)系上的獨立性。實施例3水稻0sFAD6基因器官表達模式分析。分別提取水稻種子、根、莖、葉中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，利用引物SEQ ID NO. 5與SEQ ID N0. 6，，進行實時熒光定量PCR檢測(圖3)。結(jié)果顯示，fls/^i^在上述四個器官均有表達，其中在葉中表達最高。實施例4水稻基因0sFAD6在低溫、高鹽、氧化脅迫下的表達模式分析。對兩周大的水稻幼苗分別進行10°C低溫(Mh)、0. 25M氯化鈉(Mh)、6mM(6h)過氧化氫的處理，并同無處理的對照組一起，分別提取根和葉中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID N0. 5與SEQ ID N0. 6，進行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，在經(jīng)過氧化處理后，根和葉中《s/^i^的表達量均有上升。在高鹽和低溫處理后，根中0sFAD6的表達量上升而葉中0sFAD6的表達量下降(圖4)。實施例5轉(zhuǎn)入0sFAD6基因的酵母INVkI中亞油酸含量變化檢測。(1)使用SEQ ID N0. 7與SEQ ID N0. 8作為引物，從反轉(zhuǎn)錄得到的水稻cDNA中PCR 得到兩端帶有損al/IAoI酶切位點及完整編碼閱讀框(SEQ ID NO. 1)的fls/^i^基因序列。 并連接至酵母表達載體PYES-NT(C)中。并通過測序驗證，轉(zhuǎn)化酵母。(2)將轉(zhuǎn)入pYES-NT (C) ~0sFAD6載體與pYES_NT (C)空載體的兩個酵母菌株分別在含有g(shù)al的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，各取IOml菌液5000rpm離心得到酵母細(xì)胞。(3)向離心得到的酵母細(xì)胞中加入2. 5%硫酸/甲醇溶液1ml，震蕩混勻后在80°C 水浴中反應(yīng)1. 5h。加入1. 5ml 0. 9%NaCl溶液和Iml正己烷，震蕩混勻后5000rpm離心IOmin 取上清備用。(4)運用氣相色譜儀器(HP6890 Plus Hewlett-Packard, Wilmington, Del.)分析油酸和亞油酸的含量。程序為起始溫度150 °C 3 min后按照15°C/min的溫度上升速率升溫直至210°C，當(dāng)氣相色譜儀程序進行完畢后，機器保持12min后分析結(jié)果。
結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)入空載體組相比，轉(zhuǎn)入fls/^i^基因的酵母細(xì)胞中能夠檢出亞油酸存在(圖5)，證明表達的0sFAD6能夠?qū)⒔湍钢杏退岽呋纬蓙営退?。實施?轉(zhuǎn)入基因fls/^i^的酵母INVScI對低溫、氧化、鹽及乙醇脅迫耐受性改變。(1)分別將轉(zhuǎn)入pYES-NT (C)空載體及轉(zhuǎn)入pYES_NT (C) ~0sFAD6的INVScI酵母在 YPD培養(yǎng)基中28° C培養(yǎng)至OD600達到1. 5左右。(2)取20 μ 1菌液加至IOml含有g(shù)al的& U—培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h。(3)測量兩者的0D·，并按比例取出保證細(xì)胞數(shù)相等的菌液各約Iml左右， 3000rpm離心5min，棄掉培養(yǎng)基，用Iml無菌水懸浮細(xì)胞。并以10倍逐級稀釋6個濃度梯度。(4)將各梯度菌液分別取10 μ 1，滴于相應(yīng)YPD培養(yǎng)基上。除低溫外在培養(yǎng) 2d后照相觀察。低溫處理組在4° C暗處存放6周后置于培養(yǎng)2d照相觀察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞與轉(zhuǎn)空載體的酵母相比，其對低溫、氧化、鹽及乙醇脅迫耐受性均有提高(圖6)。參考文獻
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權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，為從水稻中克隆出的基因0SFAD6,全長 136^DP，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.一種如權(quán)利要求1所述的基因《s/^i^編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征在于，該序列編碼妨4個氨基酸殘基，分子量44. 35kDa，等電點為9. 24，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3.一對用于調(diào)取獲得水稻樣品中基因0sFAD6的引物序列，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求 1所述基因0sFAD6開放閱讀框設(shè)計，序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
4.一種檢測水稻基因fls/^i^mRNA表達模式的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1所述基因fls/^M的的核苷酸序列作為設(shè)計探針引物的保守區(qū)段，調(diào)取其序列的引物序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，對水稻cDNA樣品進行Real-timePCR，然后檢測該基因在根、種子、莖和葉中的表達；樣品為水稻的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA ；其步驟如下提取水稻不同器官的總RNA ；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，進行定量PCR檢測。
5.一種檢測水稻在高鹽、氧化、低溫脅迫處理后，基因0sFAD6表達含量變化的方法， 其特征在于具體步驟為將水稻進行高鹽、氧化及低溫脅迫處理后，提取水稻葉和根的總 RNA ；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，進行定量PCR檢測。
6.如權(quán)利要求1所述的基因《s/^i^在改良水稻品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種水稻脂肪酸去飽和酶基因OsFAD6編碼序列及其應(yīng)用。具體包括基因OsFAD6的克隆、含有該基因的表達載體構(gòu)建、基因OsFAD6表達模式分析，低溫、高鹽、氧化處理后OsFAD6的表達量的變化分析。半定量PCR檢測結(jié)果顯示OsFAD6在植物的各個器官中均有表達，其中在葉中表達量最高。在氧化處理后，OsFAD6在根和葉這兩個器官中的表達量均有上升；在低溫和高鹽脅迫處理后，OsFAD6在葉中的表達量下降而在根中的表達量上升。本發(fā)明還公開基因OsFAD6在轉(zhuǎn)入酵母INVScI后，可以改變酵母的亞油酸含量并提高對高鹽、乙醇、氧化及低溫脅迫的抗性。該基因OsFAD6可用于植物品種改良。
文檔編號C12N9/02GK102206656SQ201110113370
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者明鳳, 王堯峰, 石金磊 申請人:復(fù)旦大學(xué)