專利名稱：福氏痢疾桿菌血清型檢測用引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及福氏痢疾桿菌血清型檢測用引物及其應用， 特別涉及使用所述引物進行單重擴增以用于鑒定福氏痢疾桿菌血清型。
背景技術：
福氏痢疾桿菌(S.flexneri)是發(fā)展中國家細菌性痢疾的主要病原菌(Wang， X.Y. etal. Trend and disease burden of bacillary dysentery in China(1991-2000) · Bulletin of The World Health Organization 84,561-568, (2006))，每年全球大約有 2 百萬人感染，導致 65 萬人死亡(W. H. 0. Research priorities for diarrhoeal disease vaccines :memorandom froma WHO meeting. Bull. W. H. 0. 69,667-676(1991)) ο 在我國，福氏痢疾發(fā)病數占全國痢疾感染的2/3以上，是重要的致病菌(http://www.moh. gov. cn)。福氏痢疾桿菌菌體外膜脂多糖(LPS)O抗原是痢疾桿菌重要的毒力因子，也是宿主針對痢疾桿菌感染保護性免疫反應的作用靶位。根據0抗原的不同，福氏痢疾桿菌分為 Fx、Fy、Fla、Fib、Flc、F2a、F2b、F3a、F3b、F4a、F4b、F5a、F5b、Fxb (關于該血清型的命名存在爭議，Pryamukhina 等人在 1988 年將其命名為 F4c (Pryamukhina，N. S. &Khomenko, N. A.Suggestion to supplement Shigella flexneri classification scheme with the subserovar Shigella flexneri 4c :phenotypic characteristics of strains. J Clin Microbiol 26，1147-1149 (1988))，本發(fā)明中采用 “Fxb” 命名)和 F6 共 15 個血清型(von Seidlein, L. et al. A multicentre study of Shigella diarrhoea in six Asian countries :disease burden, clinical manifestations, and microbiology. PLoS Med 3，e353(2006))o福氏痢疾桿菌除6型(F6)外，其它血清型的0抗原都具有由四糖重復單位構成的多糖骨架(N-acetylglucosamine-rhamnose-rhamnoserhamnose) (Simmons, D. A. R. &Romanowska, Ε.Structure and biology of Shigella flexneri 0 antigens. Journal of Medical Microbiology 23，289-302 (1987))，在骨架的不同糖基上進行糖基或 /和乙?；揎棧瑢е戮瓯砻娌煌男?如I，II，III，IV，V)和群(如3，4;7，8;6)抗原位點的出現，菌株呈現不同的血清型(Edwards, P. R.，and W. H. Ewing. Identification of Enterobacteriaceae. Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minn,126-131 (1972)； Carlin,N. I. ,Lindberg,A. A. ,Bock,K. &Bundle,D. R. The Shigella flexneri 0-antigenie polysaccharide chain. Nature of the biological repeating unit.Eur J Biochem 139,189-194(1984))。人體感染福氏痢疾桿菌后，會產生針對0抗原的免疫保護，但對不同的血清型菌株感染沒有交叉免疫保護作用(Brahmbhatt，H. N.，Lindberg, A. A. &Timmis, K.N. Shigella lipopolysaccharide :structure, genetics, and vaccine development. Current topics in Microbiology and Immunology 180,45-64 (1992) ；Hale,T. L. &Keren,D.F.Pathogenesis and immunology in shigellosis :applications for vaccine development. Curr Top Microbiol Immunol 180，117-137(1992) ；Lindberg，A. A. &Pal， T.Strategies for development of potential candidate Shigella vaccines. Vaccine 11,168-179(1993))。福氏痢疾桿菌通過0抗原多糖骨架修飾化，進行血清型轉換，借此逃避宿主機體的免疫，以致在同一地區(qū)不同時間內，福氏痢疾桿菌的流行血清型不同。因此， 確定福氏痢疾桿菌的血清型，對于痢疾感染的治療、預防、流行控制及疫苗研制等方面具有重要的意義。目前，鑒定福氏痢疾桿菌及其它群痢疾桿菌的血清型主要采用免疫動物的抗血清與分離菌株進行玻片凝集反應，根據免疫凝集結果進行判定(Edwards，P. R.，and W. H. Ewing. Identification of Enterobacteriaceae. Burgess Publishing Company, Minneapolis，Minn，126-131 (1972))。盡管福氏痢疾桿菌血清型診斷系統已經建立(Ewing， W. H. Edwards and Ewing ' s identification of Enterobacteriaceae, .Elsevier Science Publishing Co, Inc, New York. 4th ed.，，135-172 (1986))，而且多種商業(yè)化診斷血清亦廣泛應用，但是仍有具有諸多不足(Evins，G.M.，Gheesling, L. L. &Tauxe, R. V. Quality of commercially produced Shigella serogrouping and serotyping antisera. J Clin Microbiol 26，438-442 (1988))，如樣品需要進行預培養(yǎng)和分離單菌落，延長了診斷周期；血清反應受細菌培養(yǎng)條件和生長狀態(tài)影響；部分血清型間存在交叉反應，導致錯誤判讀；結果判定通過肉眼觀察，具有個體主觀性。因此，尋找福氏痢疾桿菌血清型的分子標識，發(fā)展基于PCR等分子生物學技術的鑒定方法，對于及時、準確鑒定病原菌血清型具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于尋找福氏痢疾桿菌血清型的分子標識，發(fā)展分子生物學技術鑒定福氏痢疾桿菌血清型的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種福氏痢疾桿菌血清型檢測用引物。本發(fā)明的另一目的在于提供所述引物的應用，具體包括其在檢測福氏痢疾桿菌血清型中的應用，以及在制備福氏痢疾桿菌血清型檢測用制劑中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述引物擴增檢測福氏痢疾桿菌血清型的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種福氏痢疾桿菌血清型檢測用制劑如試劑盒。福氏痢疾桿菌0抗原多糖骨架上的修飾作用是由整合到菌株基因組中的噬菌體或隱性噬菌體攜帶的相關基因(gtrA、gtrB、δ Γ(ΚΙΚινινιΧ)和/或oac)介導的糖基轉移和乙?；饔猛瓿傻?。其中，gtr I、gtr II、gtr IV、gtr V、gtr X和oac基因分別存在溫和噬菌體 Sfl、SfII, SfIV, SfV, SfX, Sf6 上(Adams，Μ. Μ.，Allison, G. Ε. &Verma, N. K. Type IV 0 antigen modification genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296. Microbiology 147,851-860(2001) ；Adhikari, P.，Allison, G.，Whittle, B. &Verma, N. Serotype la O-Antigen modification :molecular characterization of the genes involved and their novel organization in the Shigella flexneri chromosome. Journal of Bacteriology 181，4711—4718 (1999) ;Biistin， D. A. ， Lord， A. &Verm￡i，N.K. Cloning and analysis of the glucosyl transferase gene encoding type I antigen in Shigella flexneri. FEMS MicrobiologyLetters 156，133-139 (1997)； Clark, C. A. , Beltrame, J. Manning, P. A. The oac gene encoding a lipopolysaccharide 0-antigen acetylase map s adj acent to the integrase-encoding gene on the genome of Shigella flexneri bacteriophage Sf6. Gene 107，43-52 (1991) ；Guan, S.， Bastin，D. A. &Verma, N. K. Functional analysis of the O antigen glucosylation gene cluster of Shigella flexneri bacteriophage SfX. Microbiology 145 (Pt 5)， 1263-1273(1999) ；Huan, P. Τ. ， Whittle, B. L. ， Bastin, D. Α. ， Lindberg, Α. Α. &Verma, N. K.Shigella flexneri type-specific antigen V :cloning，sequencing and characterization of the glucosyl transferase gene of temperate bacteriophage SfV. Gene 195,207-216，doi :S0378_1119 (97)00144—3[pii](1997) ；Huan，T.P.，Bastin, D. Α.，Whittle, B. L.，Lindberg，A. A. &Verma, N. Molecular characterization of the genes involved in 0-antigen modification,attachment,integration and excision in Shigella flexneri bacteriophage SfV. Gene 195，217-227 (1997) ；Mavris，M.，Manning， P. A. &Morona, R. Mechanism of bacteriophage SfII-mediated serotype conversion in Shigella flexneri. Molecular Microbiology 26，939-950 (1997) ；Verma, N. K. , Brandt， J. M.，Verma，D. J. &Lindberg, A.A.Molecular characterization of the 0-acetyl transferase gene of converting bacteriophage SF6 that adds group antigen 6 to Shigella flexneri. Mol Microbiol 5，71-75 (1991) ；Verma, N. K.，Verma, D. J.，Huan, P.Τ. &Lindberg, A. A. Cloning and sequencing of the glucosyl transferase—encoding gene from converting bacteriophage X(SFX)of Shigella flexneri. Gene 129,99-101, doi 0378-1119(93)90702-5[pii] (1993))，分別編碼糖基轉移酶和O-乙酰轉移酶，介導多糖骨架的糖基化和/或乙酰化，具有血清型別的特異性和唯一性(Adams，Μ. Μ.，Allison, G. Ε. &Verma, N. K. Type IV 0 antigen modification genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296. Microbiology 147,851-860(2001)) 本發(fā)明根據gtr I、gtr II、gtr IV、gtr V、gtr X和oac基因具有血清型別的特異性和唯一性，將其作為分子標識，來鑒定福氏痢疾桿菌及其血清型。一方面，本發(fā)明提供了一種福氏痢疾桿菌血清型檢測用引物。其中包括分別為檢測以下目標基因gtr I、gtr II,gtr IV、gtr V, gtr X和/或oac基因的擴增引物。在本發(fā)明的一具體實施例中(參見實施例1)，根據已知的gtr I、gtr II,gtr IV,gtr V,gtr X 和oac基因序列，設計了具特異性的、退火溫度接近的擴增引物，具體為本發(fā)明的以下擴增引物如SEQ ID No. 1和2，用于擴增gtr I基因片段；SEQ ID No. 3和4，用于擴增gtr II 基因片段；SEQ ID No. 5和6，用于擴增oac基因片段；SEQ ID No. 7和8，用于擴增gtr IV 基因片段；SEQ ID No. 9和10，用于擴增gtr V基因片段；以及SEQ ID No. 11和12，用于擴增gtr X基因片段。本發(fā)明的引物，可用于定性檢測福氏痢疾桿菌血清型。根據本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案，本發(fā)明提供了一套福氏痢疾桿菌血清型檢測用弓丨物，其包括SEQ ID No. 1 和 2 ；SEQ ID No. 3 和 4 ；SEQ ID No. 5 和 6 ；SEQ ID No. 7 和 8 ；SEQ ID No. 9 和 10 ；以及 SEQ ID No. 11 和 12。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述引物的應用，所述的應用具體包括所述引物在檢測福氏痢疾桿菌血清型中的應用，以及所述引物在制備福氏痢疾桿菌血清型檢測用制劑中的應用。根據本發(fā)明提供的所述引物在檢測福氏痢疾桿菌血清型中的應用，本發(fā)明還建立起一套快速、靈敏、易于推廣使用的擴增檢測福氏痢疾桿菌血清型的方法，其具體為單重擴增檢測方法。本發(fā)明提供的單重擴增檢測方法包括利用所述的引物進行擴增，用于基于引物與模板的特異結合產生特異擴增產物的酶促核酸體外擴增檢測技術中；優(yōu)選所述擴增選自聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應、鏈置換擴增、核酸單堿基取代、轉錄介導擴增。在本發(fā)明中，更優(yōu)選PCR反應。在PCR中，PCR系統是由耐熱DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸、待擴增的DNA模板和緩沖液組成。本發(fā)明在選擇優(yōu)選引物的基礎上，還對反應體系和條件進行了優(yōu)化。本發(fā)明提供一種優(yōu)選的PCR反應，其條件為94°C預變性5min ；94°C變性 30s, 55 58°C退火30s，72°C延伸40s，共15 30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。對于本發(fā)明所述的單重擴增檢測方法，優(yōu)選進一步包括在所述擴增之后進行定性分析。定性分析方法可以是本領域普通技術人員已知的，例如包括利用凝膠電泳顯示所述擴增產物，本領域技術人員可根據擴增產物的大小，確定所用的凝膠和濃度。在本發(fā)明的一具體實施方案中(參見實施例1)，利用本發(fā)明優(yōu)選的引物，PCR擴增了目前常見的13個福氏痢疾桿菌血清型菌株中gtr基因，在本發(fā)明中，除Fxb外，福氏痢疾桿菌各血清型標準菌株的型/群抗原表型與其特異基因gtr的PCR擴增結果一致，即血清型與PCR擴增結果吻合，應用本發(fā)明的引物與擴增檢測方法，可以及時、準確鑒定福氏痢疾桿菌的血清型；而且本發(fā)明的PCR具有很好的特異性，非福氏痢疾桿菌的腸道細菌PCR擴增均為陰性(參見實施例2)。根據本發(fā)明的具體實施方案，如已知待測樣品中所含福氏痢疾桿菌菌株血清型部分信息，或僅需測定待測福氏痢疾桿菌菌株是否為某種或某些種血清亞型，可以僅利用本發(fā)明的部分引物對(例如SEQ ID No. 1和2 ；SEQ ID No. 3和4 ；SEQ ID No. 5和6 ；SEQ ID No. 7和8 ；SEQ ID No. 9和10 ；以及SEQ ID No. 11和12中的一對或多對)進行擴增檢測， 以確定具體的血清型和亞型。在本發(fā)明的一具體實施方案中，本發(fā)明還提供了一種單重擴增檢測福氏痢疾桿菌是否為Fxb血清型的方法，該方法包括利用包含為檢測gtr II、oac、 gtr V、gtr X基因的引物對進行單重擴增；優(yōu)選還包括血清凝集方法檢測待測菌株與單價血清IV或單克隆抗體MASF IV-I是否發(fā)生凝集的過程。根據本發(fā)明提供的所述引物在制備福氏痢疾桿菌血清型檢測用制劑中的應用，本發(fā)明中所述檢測用制劑優(yōu)選用于對分離的福氏痢疾桿菌菌株進行檢測。根據本發(fā)明的具體實施方案，所述的檢測用制劑可以是試劑盒。本發(fā)明還提供了一種福氏痢疾桿菌血清型檢測用試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的所述引物。所述試劑盒還可以包括用于檢測目標基因的目標檢測探針，所述的探針優(yōu)選為本發(fā)明如 SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17 和 / 或SEQ ID No. 18所示的探針。本發(fā)明的試劑盒可用于定性檢測福氏痢疾桿菌血清型。綜上所述，本發(fā)明提供了福氏痢疾桿菌血清型檢測用引物，建立了基于福氏痢疾桿菌0抗原修飾酶基因的單重PCR檢測方法。本發(fā)明的擴增引物以及單重擴增方法具有較高的特異性，鑒定時只需要菌株或樣品的DNA作為模板，不需要分離單菌落；而且結果判定簡易、客觀，避免了血清免疫凝集反應中的主觀性、不穩(wěn)定性等問題。本發(fā)明的方法可作為血清凝集方法的補充和完善，用于福氏痢疾桿菌血清型的鑒定，對于及時、準確鑒定臨床分離病原菌的血清型及細菌性痢疾的防治具有重要的實際意義和應用價值。


圖1顯示標準菌株gtr基因PCR擴增結果。其中，I、II、oaC、IV、V、X分別代表特異基因gtrl、gtrll、oac、gtrlV、gtrV、gtrX擴增產物；DNA分子量標準為廣譜DNA分子量標準(100 6，000)，1 8 條帶分別為 6000bp、4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、 1000bp、750bp。圖2顯示PCR擴增特異性檢測結果。其中，圖片A、B、C、D、E、F分別為gtrl、gtrll、 oac、gtrlV、gtrV和gtrX基因擴增結果；各圖片中，1為陽性對照菌株，2 24分別為菌株 S. dysenteriae(l)、S. boydii ⑴、S. Sonnie(S) ,S. Sonnie (R)、豬霍亂沙門氏菌(50109-3)、 甲型副傷寒沙門氏菌(50001-24)、EAggEc (17-2)、EHEC(EDL933)、EPEC(234869)、大腸桿菌 K12 (HBlOl)、EHEC(Sakai)、ETEC(10407)、EIEC(44825)、鼠傷寒沙門氏菌(50013-6)、 UPEC (CFT073)、大腸桿菌 K12 (MG1655)、EHEC (882364)、EAggEc (042)、小腸結腸炎耶爾森菌 (ff/Ο)、霍亂弧菌(附6961)、鼠傷寒沙門氏菌(LT2)、單增李斯特菌(54003)、S. flexneriF6。 DNA標準為廣譜DNA分子量標準(100 6，000)，1 8條帶分別為6000bp、4000bp、3000bp、 2500bp、2000bp、1500bp、IOOObp、750bp。圖3顯示PCR擴增靈敏性檢測結果。其中，圖片A、B、C、D、E、F分別為gtrl、gtrll、 oac、gtrlV、gtrV和gtrX基因擴增結果，特異基因的擴增模板分別為51571 (S. flexneri la)、301(S. flexneri 2a),51575(S. flexneri 3b),51576(S. flexneri 4a),51247(S. flxneri 5a) ,2002017 (S. flxneri xb)；各圖片中，1、2、3、4、5、6 分別代表擴增 20 μ 1 體系中模板DNA量為10ng、lng、100pg、10pg、lpg ；DNA分子量標準為DL2，000 DNA分子量標準， 1 3 條帶分別為 2000bp、IOOObp、750bp。圖4顯示特異基因的southern blot結果。其中，A 陽性對照菌株51576 (4a) ；B 陰性對照菌株2003036 (Fy) ；C =2002017 (Fxb)；探針為51576菌株gtr IV基因擴增產物。
具體實施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現參照下列實施例及附圖進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。菌株、培養(yǎng)條件和鑒定下列實施例中所用標準福氏痢疾桿菌菌株中，菌株號51571、51572、51251、 51575、51576、51577、51247、51246的菌株購自中國生物制品藥品檢定所，菌株號 2002110、2003036、2002014、2002017的菌株為2002 2003年間在中國河南省分離，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所微生物室保存；301菌株為1985年在中國北京昌平分離，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所微生物室保存。用于特異性分析的菌株為商購標準菌株，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所微生物室收藏保存；
檢測分析的福氏痢疾桿菌為2001 2006年間在中國河南省臨床分離株，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所微生物室保存。主要試劑及材料Tag DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶購自TaKaLa公司；DNA回收純化試劑盒為QIGEN公司產品；染色體DNA提取試劑盒購自上海生工公司；福氏痢疾桿菌群抗原和型抗原單價抗血清購自日本生研公司；福氏痢疾桿菌群抗原和型抗原單克隆抗體購自瑞典Reagensia AB公司；廣譜DNA分子量標準(Wide Range DNA Marker) (100 6，000)為寶生物工程有限公司產品；ECL 直接標記禾口檢測試齊[J盒(ECL direct labeling and detection system, RPN3000)為 GE healthcare 公司產品；其它試劑均為分析純。實施例1、引物設計與單重PCR1、引物設計根據已經發(fā)表的gtr I (GenBank接受序列號AF139596)、 gtr II (GenBank 接受序列號AF021347)、oac (GenBank 接受序列號AF547987)、gtr IV (GenBank 接受序列號AF288197)、gtr V (GenBank 接受序列號U82619)、gtr X (GenBank 接受序列號L05001)基因序列，應用primer 5. 0軟件設計引物。選擇退火溫度接近的引物作為備選引物，以方便PCR擴增同時進行。本發(fā)明中所設計的優(yōu)選的引物序列請參見下表1，這些引物的理論Tm值為55 58°C，這樣保證了所有的擴增可以在同一退火溫度下進行，提高了時效性。各引物委托上海生物工程公司合成。表1實施例中所用的引物
權利要求
1.單重擴增檢測福氏痢疾桿菌是否為Fxb血清型的引物，其包括分別為檢測以下目標基因gtr Il.gtr V、gtr X和oac基因的擴增引物，所述引物包括SEQ ID No. 3 和 4 ； SEQ ID No. 5 和 6 ； SEQ ID No. 9 和 10 ；和 SEQ ID No. 11 和 12。
2.—種單重擴增檢測福氏痢疾桿菌是否為Fxb血清型的方法，該方法包括利用權利要求1所述的引物進行單重擴增。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述擴增為聚合酶鏈式反應。
4.根據權利要求2所述的方法，該方法還包括血清凝集方法檢測待測菌株與單價血清 IV或單克隆抗體MASF IV-I是否發(fā)生凝集的過程。
5.權利要求1所述的引物在制備檢測福氏痢疾桿菌是否為Fxb血清型的制劑中的應用。
6.權利要求1所述的引物在制備檢測福氏痢疾桿菌是否為Fxb血清型的試劑盒中的應用。
7.—種檢測福氏痢疾桿菌是否為Fxb血清型的試劑盒，該試劑盒包含權利要求1所述的引物。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，該試劑盒還包括以下標記或未標記的探針SEQID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17 和 / 或 SEQ ID No. 18。
全文摘要
本發(fā)明涉及福氏痢疾桿菌血清型檢測用引物及其應用，所述引物包括分別為檢測以下目標基因gtr I、gtr II、gtr IV、gtr V、gtr X和/或oac基因的擴增引物，可鑒定福氏痢疾桿菌的血清型。本發(fā)明還涉及利用所述引物進行單重擴增檢測的方法。本發(fā)明進一步涉及所述檢測用引物在制備檢測用制劑中的應用。本發(fā)明進一步涉及包含上述引物的福氏痢疾桿菌血清型檢測用試劑盒。本發(fā)明的技術用于福氏痢疾桿菌血清型的鑒定，對于及時、準確鑒定臨床分離病原菌的血清型及細菌性痢疾的防治具有重要意義。
文檔編號C12N15/11GK102220420SQ201110114000
公開日2011年10月19日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權日2009年4月14日
發(fā)明者孫強正, 徐建國, 王藝婷 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所