專利名稱：一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母atcc9763的篩選和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選和應(yīng)用，尤其涉及該酵母在葡萄酒發(fā)酵，酸面團發(fā)酵，動物飼料生產(chǎn)和基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
釀酒酵母(feccAarofflj^M cererisiae)，又稱面包酵母或者出芽酵母，是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母。它不僅應(yīng)用于面包、饅頭、釀酒等領(lǐng)域；在現(xiàn)代分子和細胞生物學(xué)中，也被用作真核模式生物，其作用相當于原核的模式生物大腸桿菌。在葡萄皮、果柄及果梗上，生長有大量天然酵母，當葡萄被破碎、壓榨后，酵母進入葡萄汁中，將葡萄汁中所含的糖進行發(fā)酵、降解，從而生產(chǎn)出醇美的葡萄酒。本發(fā)明采集的農(nóng)家土制葡萄酒除具有葡萄本身果香外，也具有酵母產(chǎn)生的良好果香與酒香，口味新鮮清爽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選和應(yīng)用，該釀酒酵母具有耐溫、耐酒精度、耐酸、耐糖、耐氧，產(chǎn)氣能力強，生長快速等特點。一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選，利用YPD培養(yǎng)基平板計數(shù)法和DGGE法分析葡萄酒原液菌群數(shù)量和組成并篩出7株菌，結(jié)合DGGE分析和測序結(jié)果，確定其中的釀酒酵母ATCC9763為葡萄酒中優(yōu)勢菌。在YPD培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的葡萄糖和酒精，24 h后測定其OD6tltl值，檢測不同濃度糖和酒精對其生長的影響作用。將YPD培養(yǎng)基調(diào)為不同的pH值，24 h后測定其0D_值，檢測不同pH值對其生長的影響作用。將培養(yǎng)菌置于不同溫度，24 h后測定其0D_值，檢測不同溫度對其生長的影響作用。將培養(yǎng)菌分別置于需氧和厭氧條件，每隔2 h取樣測定其0D_值，繪制其生長曲線并比較其在需氧和厭氧條件下OD值的異同。是釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于葡萄酒釀制該釀酒酵母可以在糖濃度0. 5-6. 5%的環(huán)境下大量生長，可以耐受0- %的酒精度，需/厭氧條件下皆可存活，因此可應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)工業(yè)。釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于酸面團發(fā)酵該酵母可在pH 2. 5-8. 5下大量生長，耐酸能力強，可抵抗酸面團中乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)；生長迅速，22 h內(nèi)可達到對數(shù)穩(wěn)定期，產(chǎn) CO2能力強，可應(yīng)用于酸面團發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于動物飼料生產(chǎn)該酵母生長迅速，22 h內(nèi)可達到對數(shù)穩(wěn)定期，可為動物飼料提供較多蛋白質(zhì)，B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)；該酵母耐酸能力強，可聯(lián)合益生菌如乳酸菌一起使用，改善飼料風味，為動物提供益生物質(zhì)；此外，該酵母需/厭氧條件下皆可存活，為生產(chǎn)用飼料深層發(fā)酵提供有利條件。釀酒酵母ATCC9763可應(yīng)用為工程菌株該酵母生長迅速，需/厭氧下皆可高量生長，容易培養(yǎng)，可作為模式生物，研究酵母生物信息學(xué)和健全異源基因在酵母中進行功能互補。本發(fā)明應(yīng)用如下
1、釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于葡萄酒釀制
該釀酒酵母可以在糖濃度0. 5-6. 5%的環(huán)境下大量生長，可以耐受0- %的酒精度，需 /厭氧條件下皆可存活，因此可應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)工業(yè)。2、釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于酸面團發(fā)酵
該酵母可在PH 2. 5-8. 5下大量生長，耐酸能力強，可抵抗酸面團中乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)；生長迅速，22 h內(nèi)可達到對數(shù)穩(wěn)定期，產(chǎn)(X)2能力強，可應(yīng)用于酸面團發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。3、釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于動物飼料生產(chǎn)
該酵母生長迅速，22 h內(nèi)可達到對數(shù)穩(wěn)定期，可為動物飼料提供較多蛋白質(zhì)，B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)；該酵母耐酸能力強，可聯(lián)合益生菌如乳酸菌一起使用，改善飼料風味，為動物提供益生物質(zhì)；此外，該酵母需/厭氧條件下皆可存活，為生產(chǎn)用飼料深層發(fā)酵提供有利條件。4、釀酒酵母ATCC9763可應(yīng)用為工程菌株
該酵母生長迅速，需/厭氧下皆可高量生長，容易培養(yǎng)，可作為模式生物，研究酵母生物信息學(xué)和健全異源基因在酵母中進行功能互補。本發(fā)明的優(yōu)點是來源于農(nóng)家自制葡萄酒的釀酒酵母ATCC9763，耐溫、耐酒精度、 耐酸、耐糖、耐氧，產(chǎn)氣能力強，生長快速，可應(yīng)用于酸面團發(fā)酵、葡萄酒釀造、動物飼料生產(chǎn)、工程菌構(gòu)建中。本發(fā)明對篩選得到的菌株用生理生化和分子生物學(xué)手段進行鑒定，確定其為釀酒酵母ATCC9763，之后對其進行了一系列的耐糖，耐酸，耐酒精和耐氧實驗，確定其在酸面團發(fā)酵，釀酒和動物飼料中的潛在價值。葡萄酒酵母最適宜的繁殖溫度是22 30 °C，當溫度超過35 °C，酵母呈癱瘓狀態(tài)，在40 ！以上時完全停止生長和發(fā)酵；發(fā)酵初期葡萄汁中含有一定量的氧，有利于獲得強壯酵母，保證發(fā)酵的順利進行，在發(fā)酵中后期，應(yīng)控制氧的存在，保證在厭氧條件下進行發(fā)酵與陳釀；不同的酵母對糖的利用能力不一樣，發(fā)酵率高的酵母適于釀造干葡萄酒，而發(fā)酵率低的適于釀造甜葡萄酒。此外，發(fā)酵過程中總酸度要適宜，以PH計，應(yīng)控制在3 5的范圍。飼料酵母通常用假絲酵母或脆壁克魯維酵母經(jīng)培養(yǎng)、干燥制成，是不具有發(fā)酵力、 細胞呈死亡狀態(tài)的粉末狀或顆粒狀產(chǎn)品。它含有豐富的蛋白質(zhì)(30 40%左右)、B族維生素、氨基酸等物質(zhì)，廣泛用作動物飼料的蛋白質(zhì)補充物；它能促進動物的生長發(fā)育，縮短飼養(yǎng)期，增加肉量和蛋量，改良肉質(zhì)和提高瘦肉率，改善皮毛的光澤度，并能增強幼禽畜的抗病能力。此外，因釀酒酵母與同為真核生物的動物和植物細胞具有很多相同的結(jié)構(gòu)，又容易培養(yǎng)，被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人們了解最多的生物之一。人體中重要的蛋白質(zhì)很多都是在酵母中先被發(fā)現(xiàn)其同源物的，包括有關(guān)細胞周期的蛋白、信號蛋白和蛋白質(zhì)加工酶。本發(fā)明篩選的釀酒酵母ATCC9763具有耐溫(25-40 °C )、耐酒精度(0_29%)、耐酸 CpH 2. 5-8. 5)、耐糖(0. 5-6. 5%)、耐氧，產(chǎn)氣能力強，生長快速等特性，為酸面團發(fā)酵、葡萄酒釀造、動物飼料生產(chǎn)、工程菌構(gòu)建提供了優(yōu)良的候選菌株。


圖1為釀酒酵母菌落形態(tài)。圖2為釀酒酵母菌體形態(tài)。圖3 DGGE分析結(jié)果。圖4測序基因堿基序列。圖5為釀酒酵母對葡萄糖的耐受實驗。圖6為釀酒酵母對酸的耐受實驗。圖7為釀酒酵母對溫度的耐受實驗。圖8為釀酒酵母對酒精的耐受實驗。圖9為釀酒酵母在需/厭氧條件下的生長曲線。圖10為釀酒酵母產(chǎn)氣狀況。實施例1
1.葡萄酒原液倍比稀釋，取100 μ L涂布于YPD或BHI瓊脂平板，37°C、厭氧或好氧條件下培養(yǎng)至M-36小時，選取菌落數(shù)范圍在30-300的平板進行活菌計數(shù)并觀察其菌落形態(tài)；同時，挑選不同菌落形態(tài)的菌體進行下一步驗證。2.將挑選得到的7株菌進行革蘭氏染色，于油鏡下觀察其菌體形態(tài)。3.以上每種菌液各取1 mL提取基因組DNA 向2 mL離心管中加入700 ？ L的裂解緩沖液[500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0，50 mM EDTA, 4% SDS]，300 ？ L 酚 / 氯仿 / 異戊醇(25 :24 :1，！Iomega)和 0. 4 g 玻璃珠(0.35 g/0. 1 mm, 0. 05 g/0. 5 mm), 混勻，并將離心管置于渦旋振蕩器上振蕩10 min，20000Xg離心5 min后，向上清液中加入 150 ？ L 10 M乙酸銨，DNA隨即使用兩次酚/氯仿/異戊醇提取和一次氯仿提取，異丙醇沉淀，70% 乙醇洗滌，風干后，加入 100 ？ L TE緩沖液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 溶解 DNA 沉淀，加入 2 lRNase (10 mg/ml)在 37°C孵育 15 min。4.擴增 18S rDNA 引物為 FF390(F) (5' - CGATAACGAACGAGACCT -3' )，F(xiàn)R1 (R) + (5' - CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCGAICCATTCAA
TCGGTAIT -3')擴增體系(50 ？ L 包括 100 ng DNA 模板，IX EX Taq buffer, 200 μ M dNTP, 200 nM 各引物，1. 5 mM MgC12, 670 ng/μ L BSA, 1.25 U EX Taq DNA 聚合酶)參照 Muyzer 等方法。反應(yīng)條件94 "C, 5 min; 94 "C 30 s;56 "C, 30 s;72 °C，1 min, 30 個循環(huán)；72 °C，7 min。5.使用8 %聚丙烯酰胺凝膠，35 % 65 % [100%變性梯度包含40% (ν/ν)甲酰胺和 7 M尿素]變形梯度。電泳采用 DCode Universal Mutation Detection System (變性梯度凝膠電泳儀，Bio-fcid Laboratories, Hercules, CA, USA)，首先在220 V電壓下預(yù)電泳10 min，隨后在85 V的固定電壓下電泳16 h。電泳結(jié)束后，進行硝酸銀染色。6.實驗結(jié)果如圖1-4所示從DGGE膠上可以看到，菌株1_4為相同菌且在葡萄酒中占優(yōu)勢；對其相應(yīng)條帶切膠測序得到其對應(yīng)堿基序列(圖4)，經(jīng)BLAST比對后確定其為釀酒酵母ATCC9763。該釀酒酵母菌落形態(tài)與細菌相似(圖1)，但較大較厚，呈乳白色，表面濕潤、粘稠，易被挑起；菌體形態(tài)為單細胞(圖2)，一般呈卵圓形、圓形、圓柱形或檸蒙形，出芽形成的子細胞尚未與母細胞分開，又長了新芽，形成成串的細胞。實施例2
1.將釀酒酵母ATCC9763按1%的量接種到含葡萄糖濃度為0. 5、1.5、2.5,3.5, 4.5、 5. 5、6. 5%的液體YPD中，37 °C需氧條件下培養(yǎng)M h，于OD6tltl下測定其吸光值。2.實驗結(jié)果如圖5所示隨糖濃度升高，其菌體數(shù)量先上升后下降。糖濃度為 5. 5%時該菌生長狀態(tài)最好，其0D_=3. 89 ；糖濃度升高，其生長受抑制，當糖濃度為6. 5%時， OD600=3. 44。實施例3
1.將釀酒酵母ATCC9763按1%的量接種到pH值不同的液體YPD中(2. 5、3. 5、4. 5、 5.5、6.5、7.5,8.5),37 V需氧條件下培養(yǎng)M h，于OD6c 下測定其吸光值。2.實驗結(jié)果如圖6所示隨pH升高，其菌體數(shù)量總體表現(xiàn)為先上升后下降。當 pH=2. 5時，菌體數(shù)量最少0D_=0. 66 ；pH=6. 5時，菌體數(shù)量達到最高，其OD6tltl=L 60 ；之后，菌體數(shù)量隨PH升高而減少。實施例4
1.將釀酒酵母ATCC9763按1%的量接種到液體YPD中，于25、30、37、42 °C需氧條件下培養(yǎng)M h, 0D_下測定其吸光值。2.實驗結(jié)果如圖7所示隨溫度升高，其菌體數(shù)量總體表現(xiàn)為先上升后下降。25°C 時，菌體數(shù)量最少，0D_=2. 19 ；溫度為30 °C時，菌體數(shù)量達到最高，其0D6(1(1=2. 93 ；之后，菌體數(shù)量開始下降，40 °C時其OD6tltl=L 88。實施例5
1.將釀酒酵母ATCC9763按1%的量接種到含酒精濃度為0、2、4、5、6、8、9、10、12、 13、14、16、17、18、21、25、29% 的液體 YPD 中，37 "C 需氧條件下培養(yǎng) 24 h，于 OD6tltl 下測定其吸光值。2.實驗結(jié)果如圖8所示隨酒精度升高，其菌體數(shù)量總體呈下降趨勢，當酒精度高于8%時，菌體數(shù)量少且生長緩慢，其OD6qq=O. 036。盡管如此，我們用肉眼可以很清楚看到大量氣泡貼附在試管壁上，間接表明0-29%酒精度下釀酒酵母ATCC9763可以存活且產(chǎn)氣(圖 10)。實施例6
1.將釀酒酵母ATCC9763按1%的量接種到液體YPD中，37 °C，在需/厭氧條件下，采用OD6tltl測定法測定不同時間(4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)釀酒酵母 ATCC9763的生長曲線。2.實驗結(jié)果如圖9所示0-8 h，需氧和厭氧條件下釀酒酵母ATCC9763差別不大； 之后，需氧條件下釀酒酵母ATCC9763菌體量明顯高于厭氧條件，20 h，需氧菌和厭氧菌均達到最高生長量，需氧條件0D_=3.觀，厭氧條件0D_=2. 80 ；之后，菌體數(shù)量有所下降。
權(quán)利要求
1.一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選，其特征是利用YPD培養(yǎng)基平板計數(shù)法和DGGE法分析葡萄酒原液菌群數(shù)量和組成并篩出7株菌，結(jié)合DGGE分析和測序結(jié)果，確定其中的釀酒酵母ATCC9763為葡萄酒中優(yōu)勢菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選，其特征是，在YPD培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的葡萄糖和酒精，24 h后測定其0D_值，檢測不同濃度糖和酒精對其生長的影響作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選，其特征是，將YPD培養(yǎng)基調(diào)為不同的pH值，24 h后測定其OD6tltl值，檢測不同pH值對其生長的影響作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選，其特征是，將培養(yǎng)菌置于不同溫度，24 h后測定其OD6tltl值，檢測不同溫度對其生長的影響作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選，其特征是將培養(yǎng)菌分別置于需氧和厭氧條件，每隔2 h取樣測定其OD6tltl值，繪制其生長曲線并比較其在需氧和厭氧條件下OD值的異同。
6.一種權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的應(yīng)用，其特征是是釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于葡萄酒釀制該釀酒酵母可以在糖濃度0. 5-6. 5%的環(huán)境下大量生長，可以耐受0- %的酒精度，需/厭氧條件下皆可存活，因此可應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)工業(yè)。
7.—種權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的應(yīng)用，其特征是釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于酸面團發(fā)酵該酵母可在pH 2. 5-8. 5下大量生長，耐酸能力強，可抵抗酸面團中乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)；生長迅速，22 h內(nèi)可達到對數(shù)穩(wěn)定期，產(chǎn)CO2能力強，可應(yīng)用于酸面團發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。
8.—種權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的應(yīng)用，其特征是釀酒酵母ATCC9763應(yīng)用于動物飼料生產(chǎn)該酵母生長迅速，22 h內(nèi)可達到對數(shù)穩(wěn)定期，可為動物飼料提供較多蛋白質(zhì)，B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)；該酵母耐酸能力強，可聯(lián)合益生菌如乳酸菌一起使用，改善飼料風味，為動物提供益生物質(zhì)；此外，該酵母需/厭氧條件下皆可存活，為生產(chǎn)用飼料深層發(fā)酵提供有利條件。
9.一種權(quán)利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的應(yīng)用，其特征是釀酒酵母ATCC9763可應(yīng)用為工程菌株該酵母生長迅速，需/厭氧下皆可高量生長，容易培養(yǎng)，可作為模式生物，研究酵母生物信息學(xué)和健全異源基因在酵母中進行功能互補。
全文摘要
一株耐高糖、高酒精和高酸釀酒酵母ATCC9763的篩選和應(yīng)用，其應(yīng)用如下1、利用該釀酒酵母耐受高糖、高酒精和生長快速等特點，可應(yīng)用于葡萄酒發(fā)酵和生產(chǎn)；2、利用該釀酒酵母產(chǎn)氣量大、生長快等特點，可應(yīng)用于酸面團發(fā)酵生產(chǎn)；3、利用該酵母耐高酸，需/厭氧皆可生長等特點，可應(yīng)用于動物飼料發(fā)酵生產(chǎn)；4、利用該釀酒酵母生長快，需/厭氧皆可生長等特點，可用作基因工程菌株。本發(fā)明的優(yōu)點是來源于農(nóng)家自制葡萄酒的釀酒酵母ATCC9763，具有耐高酸、高糖、產(chǎn)氣量大、生長迅速等特點，可應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)，酸面團發(fā)酵和動物飼料發(fā)酵；此外，因該釀酒酵母生長迅速，需/厭氧皆可生長，可作為良好的工程候選菌株。
文檔編號A21D8/04GK102373160SQ20111011697
公開日2012年3月14日 申請日期2011年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月8日
發(fā)明者萬翠香, 姜淑英, 徐鋒, 汪孟娟, 熊順強, 許恒毅, 陳廷濤, 魏華 申請人:南昌大學(xué)