專利名稱：一種提高煙葉含油量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高煙葉含油量的方法。
背景技術(shù)：
煙草是重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，目前只發(fā)現(xiàn)一例通過(guò)基因技術(shù)提高煙葉含油量的方法美國(guó)Thomas Jefferson大學(xué)的Andrianov等人在煙草中分別用rbcS和Alc啟動(dòng)子表達(dá)擬南芥的 DGAT (diacylglycerol acyltransferase)和 LEC2 (LEAFY COTYLEDON 2)基因，將煙葉單位干重含油量提高到5. 8-6. 8%，比改造前材料的含油量提高了約5個(gè)百分點(diǎn) (Andrianov V et al. , Plant Biotechnology Journal, 2010,8 :277-287)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高煙葉含油量的方法，該方法能提高煙葉的含油量。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種提高煙葉含油量的方法，其特征在于它包括如下步驟1)、煙草rbcS啟動(dòng)子的克隆及序列分析以煙草基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1 % (質(zhì)量)的瓊脂糖凝膠電泳顯示， 從煙草基因組DNA擴(kuò)增出IOOObp的單帶；將此特異條帶回收，連接到克隆載體PMD-18T vector,導(dǎo)入宿主菌E. coli菌株DH5 α后，挑單菌落搖菌，經(jīng)篩選的重組子pMD-18T_rbcS 的PCR擴(kuò)增及酶切結(jié)果顯示，均出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明擴(kuò)增片段已成功連接于pMD-18T中；測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為979bp，序列分析表明，該序列為rbcS啟動(dòng)子序列；2)、SLCl-I基因的克隆及其點(diǎn)突變①SLCl基因編碼區(qū)的克隆從武漢大學(xué)菌種保藏中心取得酵母菌種，該酵母菌種的編號(hào)AY92007 = AS2. 159，來(lái)源中科院微生物所，用YM培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)夜，回收培養(yǎng)物，抽提其基因組 DNA作為PCR擴(kuò)增模版，使用高保真Pyrobest DNA聚合酶和引物，Primer 120為SLCl的5， 編碼引物5’ -TTTCCCGGATCCGCCACCATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTT-3，；Primer 121 為 SLCl 的 3，編碼引物5，-TTTCCCGAGCTCTTAATGCATCTTTTTTACAGATGAAC-3，，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 38cycles ；72°C延伸 5min ；YM培養(yǎng)基成分
酵母抽提物3g，
麥芽糖3g，
Peptone5g,
瓊脂20g,
雙蒸水1000ml; 25 μ 1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 2U Taq 酶和 1 μ 1 2. 5mM dATP 于 72°C加 A 20min,克隆插入pMDIS-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α涂于Amp平板；用通用引物Ml3+和Ml3-進(jìn)行篩選，程序均為 94°C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 40cycles ；72°C延伸 5min ；為了驗(yàn)證插入序列的方向，再次用120/121、M13+/120、M13-/121進(jìn)行驗(yàn)證，隨機(jī)挑取正向和反向插入的兩個(gè)克隆進(jìn)行單向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)克隆其序列與SLCl基因序列僅有1個(gè)核苷酸的差異，很可能本身就是一個(gè)基因組變異；所以必須突變1個(gè)位點(diǎn)，才能得到與突變型SLCl-I基因功能相同的序列；②SLCl基因點(diǎn)突變后獲得SLCl-I基因先用Pyrobest DNA 聚合酶和引物 120/126,121/127 和 120/121 分別在 25 μ 1 體系中PCR擴(kuò)增上述SLCl基因的5’片段、3，片段和全長(zhǎng)序列，PCR程序?yàn)?4°C 2min ； 94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 35cycles ；72°C延伸 5min ；Primer 126 為 SLCl 的 5，突變引物:5，-CGCGCAGTAATCCACAGAGCCAAATGTTG-3，；Primer 127 為 SLCl 的 3，突變引物5， -TTGGCCTTGACGTCAAGGTCGTTGGCG-3’ ；將SLCl基因的5，片段、3，片段和全長(zhǎng)序列混合，用Pyrobest DNA聚合酶在50μ1 體系中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 程序?yàn)?94°C lmin ；94°C 30sec，68°C 90sec, 20cycles ；72°C延伸 5min ；PCR體系組成如下
IOXbuffer5ul,
dNTP4ul,
Pyrobest0.25ul,
雙蒸水25.75ul，
5，PCR 產(chǎn)物5ul,
3，PCR 產(chǎn)物5ul，
100 X稀釋全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物 5ul;電泳分離Pyrobest擴(kuò)增體系中的全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物，切膠回收并測(cè)序；測(cè)序表明其中一個(gè)克隆(SLC-3-31)成功完成了 1個(gè)目標(biāo)氨基酸位點(diǎn)的突變；用BamHI和McI從 SLC-3-31切下目的片段并插入PBI121載體，即獲得了點(diǎn)突變后的SLCl-I基因；3)、目的表達(dá)載體rbcS =SLCl-I的構(gòu)建用HindIII和Xba I限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒!35S :pBI121、;35S :SLC1_1和 pMD-18T-rbcS，完畢后分別回收酶切載體大片段和啟動(dòng)子序列片段產(chǎn)物，將酶切載體大片段和啟動(dòng)子序列片段產(chǎn)物按照4 1的質(zhì)量比例混合，在T4DNA Iigase作用下于16°C溫育 12h以上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入宿主菌Ε. coli DH5 α，通過(guò)PCR鑒定和酶切鑒定顯示，得到植物表達(dá)載體 rbcS :pBI121 和 rbcS =SLCl-I ；4)、煙草轉(zhuǎn)基因體系的建立及陽(yáng)性苗的PCR檢測(cè)將目的表達(dá)載體rbcS =SLCl-I轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到含有目的表達(dá)載體rbcS SLCl-I的農(nóng)桿菌；取煙草幼嫩的無(wú)菌葉片，用打孔器制取葉盤(pán)，并用含有目的表達(dá)載體 rbcS =SLCl-I農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染；將葉盤(pán)直接放置煙草葉盤(pán)預(yù)、共培養(yǎng)基MSl上，在弱光下預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)3-4天后；共培養(yǎng)3-4天后將葉盤(pán)轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基MS2上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每隔2-3周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)；待出現(xiàn)Icm小芽時(shí)將小芽切下放置煙草生根培養(yǎng)基MS3上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待苗子生長(zhǎng)稍大一點(diǎn)可提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)；
煙草轉(zhuǎn)基因采用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法參照 Agrobacterium protocols I ；用附加AS的基本培養(yǎng)基MS0重懸菌液，OD值達(dá)到0. 5-1. 0， 侵染經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)或未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的煙草葉盤(pán)，侵染20-30分鐘，弱光下共培養(yǎng)3天，含IOOmg/ L卡那、400mg/L羧芐培養(yǎng)基篩選，每?jī)芍芨鼡Q一次新鮮培養(yǎng)基，直至抗性芽長(zhǎng)至Icm時(shí)移入煙草生根培養(yǎng)基MS3，附加75mg/L卡那篩選；長(zhǎng)勢(shì)健壯的植株采用NPTII進(jìn)行PCR檢測(cè)；將小芽移植，生長(zhǎng)至成熟，得到Ttl代煙草轉(zhuǎn)基因植株。所述基本培養(yǎng)基MStl 大量元素+微量元素+有機(jī)成分+鐵鹽成分+3%蔗糖+0. 7% 瓊脂；所述煙草葉盤(pán)預(yù)、共培養(yǎng)基MSl :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA ；所述蹄選培養(yǎng)基MS2 :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA+500mg/L Carb+lOOmg/L Kan ；所述煙草生根培養(yǎng)基MS3 :MS0+0. 2mg/L IAA+200mg/L Carb+75mg/L Kan ；
大量元素NH4NO31650mg/L,KNO31900mg/L,CaCl2 · 2H20440mg/L,MgS04 · 7H20370mg/L,KH2PO41700mg/L；微量元素KI0. 83mg/L,H3BO36.2mg/L,MnSO4 · 4H2022.3mg/L,ZnSO4 · 7H208.6mg/L，Na2MoO4 · 2H200.25mg/L，CuSO4 · 5H200.025mg/L,CoCl2 · 6H200. 025mg/L；鐵鹽成分FeSO4 · 7H2027.8mg/L,Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L；有機(jī)成分:肌醇100mg/L，煙酸0. 5mg/L,鹽酸吡哆醇(VB6)0. 5mg/L,鹽酸硫胺素(VB1)0. 5mg/L,甘氨酸2mg/L。 本發(fā)明的有益效果是該方法能提高煙葉的含油量。挑選轉(zhuǎn)基因T2代轉(zhuǎn)基因植株中拷貝數(shù)較低且RT-PCR結(jié)果較好的樣品，取全株葉片研磨混勻編號(hào)，進(jìn)行粗脂肪的測(cè)定， 樣品slc5的粗脂肪含量較ck的粗脂肪含量高了 5. 9個(gè)百分點(diǎn)。


圖1 rbcS啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，1 DL2000marker ；2陰性對(duì)照；3PCR產(chǎn)物。圖2是pMD-18T-rbcS為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖，1 DL2000Marker ；2陰性對(duì)照；3-5 為PCR產(chǎn)物。圖3是pMD-18T-rbcS酶切產(chǎn)物電泳圖，1 Hind III和Xba I酶切產(chǎn)物；2 DGL2000 markerο圖4是克隆到的rbcS啟動(dòng)子片段序列圖(用于與已報(bào)道序列(GenBank :X02353) 比對(duì)結(jié)果)。圖 5 是質(zhì)粒;35S :SLC1_1 酶切鑒定圖，IDL 2000marker ；2 BamH I 和 Sac I 雙酶切。圖6克隆到的SLCl-I片段序列圖[用于與已報(bào)道序列SLCl (GenBank :Z74100. 1)
比對(duì)結(jié)果]。圖 7rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 陽(yáng)性克隆 PCR 檢測(cè)電泳圖，lDGL2000Marker ；2 陰性對(duì)照；3-21 PCR產(chǎn)物。圖 8rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 質(zhì)粒酶切電泳圖，lDL2000Marker ；2 質(zhì)粒 rbcS pBI121Hind III和 Xba I 酶切產(chǎn)物；3 質(zhì)粒 rbcS =SLCl-I Hind III和 Xba I 酶切產(chǎn)物。圖 9 是 rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 載體圖譜，LB、RB 為左右邊界；NOSp,NOSt 為 NOS啟動(dòng)子和終止子；nptll 為卡那抗性篩選基因；rbcS 為煙草葉部組織特異性啟動(dòng)子 rbcS ；Hindi 11 ,XbaI, BamHI, SacI 為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；⑶S為報(bào)告基因。圖10是煙草遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程圖，a切苗，b預(yù)培養(yǎng)，c共培養(yǎng)，d篩選，e生根，f移栽。圖11轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)電泳圖，1 DL2000Marker ；2-21 PCR產(chǎn)物；22空白對(duì)照；23陰性對(duì)照；24陽(yáng)性質(zhì)粒。圖12轉(zhuǎn)基因煙草的PCR電泳圖，1 DL2000Marker ；2陰性對(duì)照；3陽(yáng)性質(zhì)粒； 4-13PCR 產(chǎn)物。圖13對(duì)照、轉(zhuǎn)rbcs :pBI121、轉(zhuǎn)35S :pBI121植株的不同部位⑶S活性的組織化學(xué)染色圖，圖中A1、A2、A3分別為未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照)的根、莖、葉進(jìn)行GUS染色后體式解剖鏡觀察圖；B1、B2、B3分別為轉(zhuǎn)rbcS :pBI121的煙草根、莖、葉進(jìn)行⑶S染色后經(jīng)體式解剖顯微鏡觀察圖；C1、C2、C3分別為轉(zhuǎn)35S :pBI121的煙草根、莖、葉進(jìn)行⑶S染色后體式解剖顯微鏡觀察圖。圖14利用RT-PCR技術(shù)分析煙草葉片SLCl-I基因的表達(dá)量圖。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。一、英文縮略詞CaMV35S 椰菜花葉病毒啟動(dòng)子⑶S β -葡糖醛酸酶NPTII 氨基糖苷-3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(卡那霉素抗性)rbcS 核酮糖-1，5- 二磷酸加氧酶/羧化酶小亞基SLC 基因編碼酵母 sn-2 Acyltransferase 的基因IPCR 反向 PCR
TaiL-PCR 熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCRCTAB 十六烷基三甲基溴化銨6-BA 6-芐氨基嘌呤NAA: α-萘乙酸Car 羧芐青霉素Rif 利福平Amp 氨芐青霉素DEPC 焦碳酸二乙脂X-gluc 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷。二、實(shí)驗(yàn)材料1. 1載體及菌株E. coli 菌株 DH5a、農(nóng)桿菌 LBA4404、植物表達(dá)載體!35S :pBI12U35S =SLCl-I 由中國(guó)農(nóng)科院油料作物研究所提供。1. 2DNA純化回收試劑盒為i^ermentas產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，PMD-18T vector、T4DNA 連接酶、Hind III Jba I、BamH I.Sac I、 Taq I和Mst I限制性內(nèi)切酶購(gòu)于Takara、Promega公司。1. 3培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1. 一種提高煙葉含油量的方法，其特征在于它包括如下步驟1)、煙草rbcS啟動(dòng)子的克隆及序列分析以煙草基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1 % (質(zhì)量)的瓊脂糖凝膠電泳顯示，從煙草基因組DNA擴(kuò)增出IOOObp的單帶；將此特異條帶回收，連接到克隆載體pMD-18T vector, 導(dǎo)入宿主菌Ε. coli菌株DH5a后，挑單菌落搖菌，經(jīng)篩選的重組子pMD-18T_rbcS的PCR擴(kuò)增及酶切結(jié)果顯示，均出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明擴(kuò)增片段已成功連接于PMD-18T中；測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為979bp，序列分析表明，該序列為rbcS啟動(dòng)子序列；2)、SLCl-I基因的克隆及其點(diǎn)突變①SLCl基因編碼區(qū)的克隆從武漢大學(xué)菌種保藏中心取得酵母菌種，該酵母菌種的編號(hào)AY92007 = AS2. 159，來(lái)源中科院微生物所，用YM培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)夜，回收培養(yǎng)物，抽提其基因組DNA作為 PCR擴(kuò)增模版，使用高保真Pyrobest DNA聚合酶和引物，Primer 120為SLCl的5，編碼引物5，-TTTCCCGGATCCGCCACCATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTT-3，；Primer 121 為 SLCl 的 3，編碼引物5，-TTTCCCGAGCTCTTAATGCATCTTTTTTACAGATGAAC-3’，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 940C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 38cycles ；72°C延伸 5min ；YM培養(yǎng)基成分 酵母抽提物 3g麥芽糖 3g Peptone5g 瓊脂 20g雙蒸水 1000ml 、25 μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2U Taq酶和1 μ 1 2. 5mM dATP于72°C加A 20min,克隆插入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α涂于Amp平板；用通用引物Μ13+和Μ13-進(jìn)行篩選，程序均為 940C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin,40cycles ；72°C延伸 5min ；為了驗(yàn)證插入序列的方向，再次用120/121、M13+/120、M13-/121進(jìn)行驗(yàn)證，隨機(jī)挑取正向和反向插入的兩個(gè)克隆進(jìn)行單向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)克隆其序列與SLCl基因序列僅有1個(gè)核苷酸的差異， 很可能本身就是一個(gè)基因組變異；所以必須突變1個(gè)位點(diǎn)，才能得到與突變型SLCl-I基因功能相同的序列；②SLCl基因點(diǎn)突變后獲得SLCl-I基因先用Pyrobest DNA聚合酶和引物120/126、121/127和120/121分別在25 μ 1體系中 PCR擴(kuò)增上述SLCl基因的5’片段、3’片段和全長(zhǎng)序列，PCR程序?yàn)?4°C 2min ；94°C 30sec, 50°C 30sec，72°C lmin, 35cycles ；72°C延伸 5min ；Primer 126 為 SLCl 的 5，突變引物:5，_ CGCGCAGTAATCCACAGAGCCAAATGTTG-3，；Primer 127 為 SLCl 的 3，突變引物5，-TTGGCCTTGA CGTCAAGGTCGTTGGCG-3‘；將SLCl基因的5，片段、3，片段和全長(zhǎng)序列混合，用Pyrobest DNA聚合酶在50 μ 1體系中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)?94°C lmin ；94°C 30sec，68°C 90sec, 20cycles ；72°C延伸 5min ； PCR體系組成如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高煙葉含油量的方法，其特征在于所述基本培養(yǎng)基 MS0 大量元素+微量元素+有機(jī)成分+鐵鹽成分+3%蔗糖+0. 7%瓊脂； 所述煙草葉盤(pán)預(yù)、共培養(yǎng)基MSl :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA ； 所述篩選培養(yǎng)基 MS2 :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA+500mg/L Carb+lOOmg/L Kan ； 所述煙草生根培養(yǎng)基 MS3 :MS0+0. 2mg/L IAA+200mg/L Carb+75mg/L Kan ；
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高煙葉含油量的方法。一種提高煙葉含油量的方法，其特征在于它包括如下步驟1)煙草rbcS啟動(dòng)子的克隆及序列分析；2)SLC1-1基因的克隆及其點(diǎn)突變，獲得了點(diǎn)突變后的SLC1-1基因；3)目的表達(dá)載體rbcSSLC1-1的構(gòu)建，得到植物表達(dá)載體rbcSpBI121和rbcSSLC1-1；4)煙草轉(zhuǎn)基因體系的建立及陽(yáng)性苗的PCR檢測(cè)將葉盤(pán)直接放置煙草葉盤(pán)預(yù)、共培養(yǎng)基MS1上，共培養(yǎng)3-4天后將葉盤(pán)轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基MS2上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每隔2-3周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)；待出現(xiàn)1cm小芽時(shí)將小芽切下放置煙草生根培養(yǎng)基MS3上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待苗子生長(zhǎng)稍大一點(diǎn)可提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)；將小芽移植，生長(zhǎng)至成熟，得到T0代煙草轉(zhuǎn)基因植株。該方法能提高煙葉的含油量。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102229948SQ20111011786
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者江木蘭, 閆曉紅, 魏文輝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所