專利名稱：OsELF3基因在控制水稻抽穗期中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻抽穗期的基因0SELF3的克隆、功能驗(yàn)證，同時(shí)涉及該基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明采用反向遺傳學(xué)的方法，在水稻突變體庫中，尋找與開花調(diào)控相關(guān)的候選基因的突變體，經(jīng)插入突變體表型鑒定，克隆到控制水稻抽穗期基因0sELF3。利用基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)0sELF3基因具有在長日條件下促進(jìn)水稻抽穗的功能。利用基因工程的手段超量表達(dá)0sELF3，使水稻出現(xiàn)早抽穗的表型，從而證實(shí)調(diào)控基因0sELF3的表達(dá)量，能夠改變水稻的抽穗期。本發(fā)明涉及利用該基因或其功能類似物調(diào)控植株的抽穗期從而提高農(nóng)作物地區(qū)適應(yīng)性、雜交親本的花期調(diào)節(jié)和提高作物產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
水稻是三大主要糧食作物之一，全世界有近二分之一的人口以其為主食，對(duì)其生長發(fā)育相關(guān)功能基因的研究具有重要的理論和應(yīng)用意義。在水稻從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換過程中涉及了一系列的關(guān)鍵基因。同時(shí)，由于水稻具有基因組小、精細(xì)的遺傳和物理圖譜、相對(duì)容易的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及與其它禾本科作物的共線性，而被作為禾本科作物的模式植物。隨著包括水稻在內(nèi)的多種生物基因組測序的完成，人類開始進(jìn)入后基因組時(shí)代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域。因此水稻功能基因的研究對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生物學(xué)研究具有重大意義。水稻是我國主要的糧食作物，在水稻的眾多農(nóng)藝性狀中，抽穗期是重要的農(nóng)藝性狀之一，它決定著水稻品種地區(qū)與季節(jié)的適應(yīng)性。水稻的抽穗期受許多因素的影響，分為外在因素和內(nèi)在因素。外在因素包括光周期(日照長度)、光質(zhì)(光的光譜組成)、光照強(qiáng)度(光子流密度)、溫度(低溫，如擬南芥和冬小麥的春化作用)、群體密度和營養(yǎng)等，而內(nèi)在因素是指激素(赤霉素等)和控制植物發(fā)育階段的各種基因調(diào)控機(jī)制。近幾年來擬南芥開花時(shí)間的調(diào)控研究有了很大的進(jìn)展，并獲得了多種晚開花和早開花的突變體，與這些突變性狀相關(guān)的基因得到克隆和鑒定，人們認(rèn)為控制擬南芥開花時(shí)間主要是通過4個(gè)途徑即光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernalization pathway)、自主途徑(autonomous pathway)和赤霉素途徑(GA pathway)。在這四個(gè)途徑中，研究得最深入的是光周期途徑。同時(shí)，在開花信號(hào)中，最重要的一個(gè)決定因素是植物對(duì)于光周期的反應(yīng)。光周期指一日之內(nèi)晝夜長度的相對(duì)變化，也即日長根據(jù)植物對(duì)光周期的反應(yīng)不同，可以將植物分為以下3類光照長于一定時(shí)數(shù)才能促進(jìn)開花的長日植物(LDP long-dayplant)、光照短于一定時(shí)數(shù)才能促進(jìn)開花的短日植物(SDP :short_day plant)以及對(duì)光照長短不敏感的日中性植物(DNP :day-neutral plant)。水稻和擬南芥分別是短日照植物和長日照植物的模式植物，對(duì)它們開花分子機(jī)制的研究，學(xué)者們一直給予高度關(guān)注，如果可以克隆到更多開花途徑中的基因，了解更詳細(xì)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和機(jī)制，將會(huì)更加完整地闡釋植物開花的分子機(jī)制，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)育種實(shí)踐、品種改良以及品種推廣均具有重大意義，比如在水稻雜交制種過程中解決父母本花期不遇問題等。此外，越來越頻繁的自然災(zāi)害使得選育合適生育期以及抽穗期，受環(huán)境影響較小的品種在避害利用中顯得十分重要。通過遺傳突變體來研究一些與植物生長、發(fā)育和其他性狀相關(guān)的基因已成為一種重要的基因功能研究手段。通過傳統(tǒng)的化學(xué)誘變、輻射誘變以及新近采用的轉(zhuǎn)座子和T-DNA標(biāo)簽法均已分離到一批與植物發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的重要基因。隨著水稻突變體資源及相關(guān)的功能基因組建設(shè)平臺(tái)的完善，水稻抽穗期基因的分離克隆日益增多，許多分離克隆的基因被證實(shí)可以用于水稻抽穗期的調(diào)節(jié)。如Lee等在水稻T-DNA插入系中分離到了一個(gè)推遲開花的突變體，研究表明T-DNA整合入水稻0sMADS50基因的K_box區(qū)域，0sMADS50基因與擬南芥 MADS-box 基因 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1/AGAM0US-LIKE20 (SOCl/AGL20)的氨基酸一致性達(dá)到了 50.6%。0sMADS50基因的超量表達(dá)導(dǎo)致水稻在愈傷階段就極早開花，而0sMADS50基因的干涉突變體則表現(xiàn)出晚開花的表型，同時(shí)伴有伸長節(jié)間數(shù)目增加。0sMADS50控制著水稻中眾多的成花調(diào)控因子，是水稻開花重要的促進(jìn)因子(Lee等，F(xiàn)unctional analyses of the flowering time gene 0sMADS50,the putative SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1/AGAM0US-LIKE 20 (S0C1/AGL20)ortholog in rice, PlantJournal, 2004, 38 :754-764)。再如 Yang-Seok Lee 等在 2010 年利用 T-DNA 插入標(biāo)簽法分離到水稻中的一個(gè)組成型開花抑制因子0sC0L4(Lee等，0sC0L4 is a constitutiveflowering repressor upstream of Ehdl and downstream of OsphyB, Plant Journal,2010,63 :18-30)。這兩個(gè)基因都是利用了插入突變體庫對(duì)功能基因組的研究提供的研究材料和信息平臺(tái)。近些年來，Shoko Kojima等(2002)和ReinaKomiya等(2009)分別發(fā)現(xiàn)了水稻中的短日和長日條件下的成花素Hd3a和RFT1，這兩個(gè)基因都是FT-Iike基因并與擬南芥的成花素 FT 同源(Kojima 等，Hd3a,a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene,promotes transition to flowering downstream of Hdl under short-day conditions,Plant and Cell Physiology, 2002,43 :1096-1105 ；Komiya 等，A gene network forlong-day flowering activates RFTl encoding a mobile flowering signal in rice,Development, 2009,136 :3443-3450)。這些基因都是基于擬南芥中同源基因克隆到的水稻開花基因。作為雙子葉植物擬南芥，目前已克隆到大批的控制開花時(shí)間的基因，并對(duì)擬南芥開花機(jī)理的調(diào)控模式有了較為深刻的認(rèn)識(shí)，可以作為其他植物的開花時(shí)間研究的參照。但是對(duì)作為重要的禾本科作物水稻來說，由于它是短日照植物，它的開花調(diào)控應(yīng)該與擬南芥存在較大的差異，現(xiàn)階段的研究尚不深入。由于世界上許多國家都相繼創(chuàng)建了各種標(biāo)簽插入突變體庫，及相應(yīng)的插入標(biāo)簽側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫平臺(tái)。利用水稻功能基因研究平臺(tái)克隆基因是一種快捷、有效的基因功能研究方法，因此更多的水稻抽穗基因有望通過此方法被分離克隆。擬南芥的抽穗期基因AtELF3已經(jīng)有較為深入的研究，研究證明AtELF3在光信號(hào)向生物節(jié)律鐘傳遞和調(diào)節(jié)生物節(jié)律中起重要作用。AtELF3基因突變后，其突變體在長短日照條件下都表現(xiàn)為早抽穗表型。AtELF3編碼一個(gè)起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的核蛋白，它的mRNA和蛋白都表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性，在體外AtELF3可以與PHYB相互作用，它作為連接蛋白可使E3泛素連接酶COPl與GI結(jié)合，最后促進(jìn)GI降解，AtELF3在光信號(hào)向生物節(jié)律鐘的輸入中起閥門作用(Liu 等，ELF3 encodes a circadian clock-regulated nuclear protein thatfunctions in an Arabidopsis PHYB signal transduction pathway, Plant Cell,2001,13 :1293-1304 ;Yu等,COP I and ELF3 control circadian function and photoperiodicflowering by regulating GI stability,Molecular Cell, 2008, 32 :617-630)。對(duì)擬南芥中的抽穗期基因AtELF3在功能和作用機(jī)制上已有深入的研究，我們可基于擬南芥中同源性克隆水稻中與基因AtELF3對(duì)應(yīng)同源的基因，從而深入研究水稻的開花調(diào)控基因。本發(fā)明是利用水稻插入突變體庫，采用反向遺傳學(xué)的方法，依據(jù)生物信息學(xué)分析，在本室插入突變體庫中，篩選到與擬南芥抽穗期基因AtELF3同源的水稻基因0sELF3有插入突變的家系，經(jīng)過田間種植和生物技術(shù)克隆到控制水稻抽穗期性狀的基因0sELF3。該基因的克隆，為人們?cè)诜肿铀缴狭私馑镜墓庵芷陂_花決定機(jī)制提供了基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，采用反向遺傳學(xué)的方法，在水稻突變體庫中，尋找與開花調(diào)控相關(guān)的候選基因的突變體，經(jīng)插入突變體表型鑒定，克隆到控制水稻抽穗期基因0sELF3。利用基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)0sELF3基因具有在長日條件下促進(jìn)水稻抽穗的功能。利用基因工程的手段超量表達(dá)0sELF3，使水稻出現(xiàn)早抽穗的表型，從而證實(shí)調(diào)控基因0sELF3的表達(dá)量，能夠改變水稻的抽穗期。本發(fā)明涉及利用該基因或其功能類似物 調(diào)控植株的抽穗期從而提高農(nóng)作物地區(qū)適應(yīng)性、雜交親本的花期調(diào)節(jié)和提高作物產(chǎn)量。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明克隆了一種控制水稻抽穗期的基因0sELF3，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO :1所不,它編碼的蛋白質(zhì)的氣基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所不。本發(fā)明的還提供了一種利用0sELF3基因調(diào)控水稻抽穗期的方法。該方法包括利用含有和SEQ ID NO :1或2所示的基因或該基因的部分類似功能片段構(gòu)建植物表達(dá)載體，該載體可以表達(dá)由上述核苷酸序列編碼的多肽或同源類似物。利用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞。本發(fā)明克隆的0sELF3基因可用于與其它調(diào)控元件，如組成型啟動(dòng)子(如ubiquintin啟動(dòng)子)融合構(gòu)建基因表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、反義RNA或RNAi等技術(shù)，通過控制0sELF3基因在水稻中的表達(dá)量來調(diào)節(jié)水稻抽穗，從而控制水稻的抽穗期，達(dá)到水稻品種適應(yīng)不同地域和不同季節(jié)的目的。本發(fā)明克隆的水稻0sELF3基因，在TOS17插入失活的突變體中表現(xiàn)為在長日照條件下晚抽穗，在短日照條件下抽穗期沒有變化(見實(shí)施例1)，正常功能的0sELF3基因轉(zhuǎn)化該突變體后植株恢復(fù)正常的表型(見實(shí)施例3)。本發(fā)明克隆的基因的應(yīng)用對(duì)闡明了 0sELF3基因的生物學(xué)功能具有重要意義，對(duì)以水稻為代表的短日照植物光周期途徑控制開花的分子機(jī)理研究將起到很大的推動(dòng)作用。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下I、利用水稻插入突變體庫和標(biāo)簽側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫獲得0sELF3基因的突變體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法并通過組織培養(yǎng)創(chuàng)建的水稻T-DNA插入突變體庫(突變體庫的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開發(fā)表論文，見Wu等，Development of enhancer trap lines forfunctional analysis of the rice genome,Plant Journal, 2003, 35 :418-427 ;Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genomehierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from anenhancer-trap mutant library, Plant Journal，2007，49 :947-959)。Tosl7 為水稻基因組內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，它的轉(zhuǎn)座活性在水稻愈傷組織培養(yǎng)過程中發(fā)生，在再生植株中沒有活性。由于在構(gòu)建水稻T-DNA插入突變體過程中涉及組織培養(yǎng)過程，因此在突變體庫中很多突變表型為Tosl7插入所致。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在從T-DNA插入突變體庫中分離T-DNA的側(cè)翼序列同時(shí)也分離Tosl7的側(cè)翼序列，從而創(chuàng)建了標(biāo)簽側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫(http://rmd. ncpgr. cn/)。本發(fā)明利用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的水稻T-DNA插入突變體庫及標(biāo)簽側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫，針對(duì)水稻OsELF3基因篩選鑒定其對(duì)應(yīng)的遺傳突變體材料，從而鑒定OsELF3基因的功能。2. oself3突變體等開花相關(guān)基因突變體的表型鑒定根據(jù)側(cè)翼序列數(shù)據(jù)分析，結(jié)合生物信息學(xué)的功能預(yù)測，從Ttl代突變體庫中選出377份種子(T1代)，其中每份種子對(duì)應(yīng)的是有預(yù)測基因被插入失活，其中的失活基因被預(yù)測參與水稻的開花調(diào)控。在武漢的夏天即長日條件下，將這些種子于正常大田條件下種植，每份種植30株(稱為I個(gè)家系)。觀察突變體抽穗期，共觀察到約23個(gè)家系有明顯的抽穗期變化。其中一個(gè)突變家系(其在水稻T-DNA插入突變體庫中的原始編號(hào)為04Z11ED48)因?yàn)椴迦胧Щ畹幕蚺c擬南芥基因AtELF3同源，所以將該突變體稱為oself3(本發(fā)明所述的突變體在突變體數(shù)據(jù)庫http://rmd. ncpgr. cn/中的編號(hào)為04Z11ED48,該突變體可向華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室索取，索取流程請(qǐng)參照上述網(wǎng)站提供的說明，該突變體為一種公開對(duì)外發(fā)放的生物材料)，水稻中對(duì)應(yīng)的基因命名為0sELF3。該突變體有明顯的晚抽穗表型。3.確定突變位點(diǎn)，分析候選基因本發(fā)明鑒定的0sELF3基因的突變體為Tosl7插入導(dǎo)致。水稻0sELF3基因位于第6染色體，TIGR核苷酸數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu. edu/)中對(duì)應(yīng)的基因L0C_0s06g05060,插入該基因第二個(gè)內(nèi)含子中，距離該基因起始編碼位點(diǎn)ATG有2，825bp，生物信息學(xué)分析表明該基因與擬南芥抽穗期基因AtELF3有75%的同源性，如圖3(A)。同源基因AtELF3，在擬南芥中是影響擬南芥開花時(shí)間的一個(gè)基因，它在影響開花的光周期路徑中，屬于光輸入路徑，該基因在擬南芥中開花調(diào)控路徑中位于GI的上游。4. oself3突變體晚抽穗的表型和Tosl7的插入共分離根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物做共分離驗(yàn)證。在插入位點(diǎn)的兩邊設(shè)計(jì)一對(duì)引物Pl和P2(引物的序列見后所述)，及Tosl7上設(shè)計(jì)一條引物P3(引物的序列見后所述)，如圖3，P1表示在插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，P2表示在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)的引物，P3表示根據(jù)Tosl7內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物。在Tl代植株中，Tos17純合植株只有Pl和P3配對(duì)可以擴(kuò)增的出，因?yàn)橛蠺osl7插入Pl與P2配對(duì)的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有Tosl7的插入，只有Pl和P2配對(duì)可以得到產(chǎn)物，雜合植株則Pl和P3配對(duì)以及Pl和P2配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。本發(fā)明中所有oself3突變體用引物Pl和P2配對(duì)均擴(kuò)不出條帶，表明該位點(diǎn)為純和Tosl7插入，且表現(xiàn)為晚抽穗表型，是隱性突變體。5. T2代遺傳分析進(jìn)一步驗(yàn)證表型與基因型共分離為了驗(yàn)證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進(jìn)一步驗(yàn)證共分離情況，本發(fā)明又對(duì)T2代遺傳表型進(jìn)行了檢測。T1代純合突變體，它的子代全部是晚抽穗表型；0sELF3位點(diǎn)不帶有Tosl7插入的野生型單株的下一代沒有出現(xiàn)分離，仍然表現(xiàn)正常抽穗期；對(duì)于T1代中的雜合子(即Tosl7只是在同源染色體中的一條上插入)，子代出現(xiàn)晚抽穗的突變表型，且符合3 I分離，同時(shí)PCR檢測表明Tosl7的插入與突變表型共分離。由此證明，這個(gè)突變體是由于這個(gè)Tosl7插入造成的單位點(diǎn)隱性突變。以上表型都是在武漢夏天長日照自然條件下觀測到的。6. oself3突變體的光周期表現(xiàn)為了進(jìn)一步鑒定0sELF3基因突變后，突變體oself3的表型。把野生型和突變體分別在長日照條件(14L/10D，光/暗)，短日照條件(10L/14D，光/暗)條件下生長，觀察抽穗期，結(jié)果如表I。發(fā)現(xiàn)在長日照條件下，突變體比野生型抽穗晚18天；在短日照條件下，突變體和野生型之間的抽穗期沒有明顯的變化。表I野生型和突變體分別在長日照短日照條件下的抽穗期結(jié)果
權(quán)利要求
1. OsELF3基因在水稻抽穗期控制中的應(yīng)用，其特征在于，所述的0SELF3基因的核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO :I所不，其編碼的氣基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻抽穗期的基因OsELF3的分離克隆及應(yīng)用。通過基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明，OsELF3基因具有控制水稻抽穗期的功能，利用基因工程技術(shù)提高或減弱OsELF3基因的表達(dá)量能夠調(diào)控植物抽穗期，從而改良品種的抽穗期，達(dá)到適應(yīng)不同區(qū)域和季節(jié)的目的。本發(fā)明克隆的基因及其編碼蛋白可廣泛應(yīng)用于調(diào)控植物的開花特性、改良植物品種的生育期，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102776201SQ20111011800
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者吳昌銀, 楊瑩 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)