專利名稱：：培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領域：
，尤其涉及一種培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法。
背景技術(shù)：
：蛋氨酸是人類和動物所必需氨基酸之一。大豆(Glycinemax(L.)Merr.)作為優(yōu)質(zhì)高蛋白作物，其含硫氨基酸尤其是蛋氨酸含量偏低。通過常規(guī)育種方法進行高蛋氨酸品種培育存在較大的困難，因此需要借助分子育種手段來解決這一瓶頸問題。擬南芥CGS基因編碼蛋氨酸合成過程中的關鍵酶一胱硫醚Y-合成酶，可促進游離蛋氨酸的合成。擬南芥D-AyCGS基因是CGS基因的氮端部分缺失形式，它具有對反饋抑制的不敏感性，通過對該基因在擬南芥中的過表達，能夠大幅度提高植株游離蛋氨酸的含量。葉片是蛋氨酸合成的主要場所，因此，通過D-AtCGS的組成型表達，可使葉片中蛋氨酸大量合成，擴大了蛋氨酸的“源”，更利于大豆籽?！皫臁敝械鞍彼岬姆e累。同時也有報道認為大豆籽粒中也可進行游離蛋氨酸的合成，提高籽粒中蛋氨酸的含量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物為如下I)或2):所述轉(zhuǎn)基因植物籽粒中的游離氨基酸含量高于所述目的植物；所述轉(zhuǎn)基因植物籽粒中的總氨基酸含量高于所述目的植物。所述游離氨基酸為游離蛋氨酸、游離丙氨酸(Alanine)、游離纈氨酸(Valine)、游離絲氨酸(Serine)、游離亮氨酸(Leucine)、游離蘇氨酸(Threonine)、游離異亮氨酸(Isoleucine)、游離脯氨酸(Proline)、游離甘氨酸(Glycine)、游離高絲氨酸(Homoserine)、游離蛋氨酸(Methionine)、游離天冬氨酸(Aspartate)、游離苯基丙氨酸(Phenylalanine)、游離半胱氨酸(Cysteine)、游離谷氨酸鹽(Glutamate)、游離高半胱氨酸(Homocysteine)、游離天冬酰胺酸(Asparagine)、游離賴氨酸(Lysine)、游離酪氨酸(Tyrosine)和/或游離色氨酸(Tryptophan)。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體為pLEG-DCGS；所述pLEG-DCGS按照如下方法構(gòu)建I)將啟動子leguminB4插入pGPTV-Bar的HindIII和NcoI酶切位點間得到中間載體；2)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟I)得到的中間載體的NcoI和XbaI酶切位點間得到的重組載體。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。大豆為自貢冬豆、吉林小粒I號大豆。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I;所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物為所述轉(zhuǎn)基因植物葉片中的游離蛋氨酸的含量高于所述目的植物。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體按照如下方法制備DpBIN-TMTL經(jīng)HindIII和BamHI，回收750bp小片段；2)將步驟I)得到的750bp小片段插入pET-28a的HindIII和BAmHI識別位點間，得到中間載體A;3)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟2)得到的中間載體A的NcoI和XbaI識另Ij位點，得到中間載體B;4)將中間載體B經(jīng)HindIII和XbaI酶切得到3.3kb的片段插入pTFlOl.I的HindIII和XbaI識別位點間得到的重組載體。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。大豆品種為自貢冬豆或吉林小粒I號。本發(fā)明的實驗證明，通過分別構(gòu)建含有擬南芥D-AtCGS基因的種子特異性植物表達載體和組成型植物表達載體，采用農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法，將氮端部分缺失的擬南介CGS基因?qū)爰中×號和晚熟大ii品種自貝冬ii中，以實現(xiàn)大ii桿粒游尚蛋氣酸含量的提高，并獲得大豆全株蛋氨酸含量提高的大豆品系。通過草丁膦涂抹和PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株進行鑒定，并對轉(zhuǎn)基因后代進行了相應的草丁膦抗性實驗和分子檢測，獲得了生長正常的轉(zhuǎn)基因陽性植株，為大豆分子育種工作提供優(yōu)異育種材料。圖I為pLEG-DCGS質(zhì)粒部分結(jié)果示意2為pET-DCGS亞克隆的構(gòu)建流程圖3為pTF-DCGS載體的構(gòu)建流程圖4為農(nóng)桿菌介導的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化流程圖5為T2代轉(zhuǎn)D-AtCGS自貢冬豆植株(pLEG-DCGS)草丁膦涂抹檢測結(jié)果圖6為T2代轉(zhuǎn)D-AtCGS吉林小粒I號植株(pLEG-DCGS)草丁膦涂抹檢測結(jié)果圖7為轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測圖8為SouthernBlot檢測結(jié)果圖9為SouthernBlot檢測結(jié)果圖10為WesternBlot檢測結(jié)果圖11為轉(zhuǎn)D-AtCGS基因植株的種子游離蛋氨酸含量圖12為轉(zhuǎn)D-AtCGS植株的種子總蛋氨酸含量圖13為Ttl代轉(zhuǎn)D-AtCGS吉林小粒I號植株(pTF_DCGS)涂抹實驗圖14為草丁膦陽性Ttl代轉(zhuǎn)D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)的PCR檢測圖15為PCR檢測陽性Ttl代轉(zhuǎn)D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)成熟期的短日處理圖16為T1代轉(zhuǎn)D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)涂抹實驗圖17為T1代轉(zhuǎn)D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)PCR檢測圖18為T1代轉(zhuǎn)D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)RT-PCR檢測圖19為組成型轉(zhuǎn)基因植株的WesternBlot結(jié)果圖20為組成型轉(zhuǎn)基因植株的蛋氨酸含量具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、種子特異性表達載體和組成型的轉(zhuǎn)化載體的獲得大豆受體材料轉(zhuǎn)化實驗采用的大豆(Glycinemax(L.)Merr.)受體品種為自貢冬豆、吉林小粒I號；吉林小粒I號記載在鄭惠玉，楊兆宇，韓春鳳，孫運嶺，利用野生大豆(G.soja)種質(zhì)育成小粒大豆新品種“吉林小粒I號”的選育報告，吉林農(nóng)業(yè)科學，1991，03-0029-11中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。自貢冬豆(Zigongdongdou)記載在DongCao,WenshengHou,ShikuiSong,HongboSun，CunxiangWu,YongshengGao,TianfuHan.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacteriumrhizogenes-mediatedtransformationofsoybean.PlantCellTissueOrganCulture(2009)96:45-52中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。菌株實驗使用的大腸桿菌菌株為DH5a(購于百泰克公司)。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHAlOl記載在HoodEE.，HelmerGL，F(xiàn)raleyRT，ChiltonM-D.ThehypervirulenceofAgrobacteriumtumefaciensA281isencodedinaregionofpTiBo542outsideofT-DNA[J].JBacteriol，1986，168:1291-1301.中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens)EHA105記載在PazMM，MartinezJC，KalvigAB，F(xiàn)ongerTM，KanW.ImprovedcotyledonarynodemethodusinganalternativeexplantderivedfrommatureseedforefficientAgrobacterium-mediated[J].PlantCellRep,2006,25:206-213.中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。I、種子特異性表達載體pLEG-DCGS將擬南芥CGS基因的氮端部分缺失即為D-AtCGS基因，其核苷酸序列為序列表中的序列1，其氨基酸序列為序列表中的序列2，可人工合成。啟動子為leguminB4(accessionnoX03677的第1534-2766位核音酸。)，插ApGPTV-Bar(DetlefBecker,ElkeKemper,JeffSchellandRobertMasterson.NewplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftT-DNAborder.1992.PlantMolecularBiology20:1195-1197,公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。)的HindIII和NcoI酶切位點間，得到中間載體。再將D-AtCGS基因插入中間載體的NcoI和XbaI酶切位點間，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送去測序，結(jié)果為將序列表中的序列I(序列表中的序列I)插入pGPTV-Bar的NcoI和XbaI酶切位點間得到的載體，將該載體命名為pLEG-DCGS，該載體中含有目的基因D-AtCGS及基于Bar基因的植物抗性篩選標記表達盒。pLEG-DCGS的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所/Jno2、組成型的轉(zhuǎn)化載體pTF-DCGS將pBIN_TMTL(記載在王慶中，轉(zhuǎn)BoTMT基因大豆的獲得及鑒定，中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文，2006中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。)經(jīng)HindIII和BamHI，回收750bp的小片段，即為啟動子D35S::Q。將啟動子D35S::Q與經(jīng)過HindIII和BamHI酶切的pET_28a(Novagen公司，cat.NO.69864-3)連接，得到pET_D35S::Q；將pLEG-DCGS經(jīng)NcoI和XbaI酶切，得到2.4kb的目的片段(D-AtCGS)，將該片段與經(jīng)過同樣酶切的pET-D35S::Q載體骨架連接，得到PET-D35S-DCG，構(gòu)建流程如圖2所示；將pET-D35S-DCG經(jīng)HindIII和XbaI酶切，得到3.3kb的片段(D35S::Q、中間序列和D-AtCGS)，將該片段與經(jīng)過同樣酶切的pTFlOl.I(記載在Paz，M.，Martinez,J.C.,Kalvig,A.,Fonger,T.,Wang,K.ImprovedcotyledonarynodemethodusinganalternativeexplantderivedfrommatureseedforefficientAgrobacterium-mediatedsoybeantransformation.PlantCe11Reports,25:206-213(2006)中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。)載體骨架連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒用HindIII和XbaI酶切，得到3.3bp目的片段的片段的為陽性質(zhì)粒。將陽性質(zhì)粒送去測序,結(jié)果為將含有序列表中的序列I的DNA分子(該DNA分子由D35S::Q啟動子、中間序列和D-AtCGS組成)插入pTFlOl.I的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體，將該載體命名為PTF-DCGS，構(gòu)建流程如圖3所示，中間序列為序列表中的序列3自5’末端第7-98位核苷酸。實施例2、轉(zhuǎn)D-AtCGS大豆的獲得及功能研究I、自貢冬豆和吉林小粒I號種子滅菌分別挑選無病害、無裂痕、飽滿的自貢冬豆(以下稱為野生型自貢冬豆)和吉林小粒I號大豆(以下稱為野生型吉林小粒I號)種子，將種子平鋪于干燥器中的培養(yǎng)皿中。干燥器中放置裝有IOOml次氯酸鈉溶液的燒杯，沿壁緩緩加入4ml12mol/L的鹽酸，迅速關閉干燥器頂蓋，使大豆種子在氯氣中滅菌12h。滅菌后的種子放入超凈工作臺釋放殘余氯氣，并將種子接種于發(fā)芽培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，不封口，放入培養(yǎng)間，溫度24°C，光照時數(shù)18h，自貢冬豆發(fā)芽4天，吉林小粒I號發(fā)芽5天，得到自貢冬豆外植體和吉林小粒I號外植體，用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化相關培養(yǎng)基I)發(fā)芽培養(yǎng)基(GM)GamborgB5basesalt+Sucrose20mg/L，pH5.8，Agar7.6g/L02)共培養(yǎng)培養(yǎng)基(CCM)l/10GamborgB5basesalt+GamborgB5Vitamin+MES3.9g/L+BAPI.6mg/L+GA30.25ml/L+AS0.04g/L+DTT150mg/L+Cys400mg/L+Sucrose30g/L+Washedagar8g/L，pH5.4。3)芽誘導培養(yǎng)基(SIM)GamborgB5salt+BAPI.6mg/L+Sucrose20g/L+MES3mM+PhytageI3g/L，pH5.I,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo4)伸長培養(yǎng)基(SEM)MSbasesalt+GamborgB5Vitamin+MES3mM+Asplml/L+Glulml/L+IAA300ug/L+Zeatin-Rlmg/L+GA3500ug/L+Sucrose20mg/L+Phytagel3g/L,pH5.I,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo5)生根培養(yǎng)基(RM)MSbasesalt+GamborgB5Vitamin+MES3mM+Asplml/L+Glulml/L，Agar8g/L，pH5.6,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo6)大腸桿菌培養(yǎng)基(LB)Yeastextract5g/L+TryptonelOg/L+Nacl10g/L，(Agar15g/L)，pH7.0。7)農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(YEP)YeastextractlOg/L+TryptonelOg/L+Nacl5g/L，(Agar15g/L)，pH7.0。培養(yǎng)基組成如下表I所示表I培養(yǎng)基各成分權(quán)利要求1.一種培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物為如下I)或2):所述轉(zhuǎn)基因植物籽粒中的游離氨基酸含量高于所述目的植物；所述轉(zhuǎn)基因植物籽粒中的總氨基酸含量高于所述目的植物。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述游離氨基酸為游離蛋氨酸、游離丙氨酸、游離纈氨酸、游離絲氨酸、游離亮氨酸、游離蘇氨酸、游離異亮氨酸、游離脯氨酸、游離甘氨酸、游離高絲氨酸、游離蛋氨酸、游離天冬氨酸、游離苯基丙氨酸、游離半胱氨酸、游離谷氨酸鹽、游離高半胱氨酸、游離天冬酰胺酸、游離賴氨酸、游離酪氨酸和/或游離色氨酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體為pLEG-DCGS；所述pLEG-DCGS按照如下方法構(gòu)建1)將啟動子leguminB4插入pGPTV_Bar的多克隆位點得到中間載體；2)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟I)得到的中間載體的多克隆位點得到的重組載體。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。7.一種培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I;所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物為所述轉(zhuǎn)基因植物葉片中的游離蛋氨酸的含量高于所述目的植物。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體按照如下方法制備DpBIN-TMTL經(jīng)HindIII和BamHI，回收750bp小片段；2)將步驟I)得到的小片段插入pET-28a的多克隆位點間，得到中間載體A;3)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟2)得到的中間載體A的多克隆位點，得到中間載體B;4)將中間載體B經(jīng)HindIII和XbaI酶切得到3.3kb的片段的片段插入pTFlOl.I的多克隆位點間得到的重組載體。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。全文摘要本發(fā)明公開了一種培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的培育高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因植物方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明通過分別構(gòu)建含有擬南芥D-AtCGS基因的種子特異性植物表達載體和組成型植物表達載體，采用農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法，將氮端部分缺失的擬南芥CGS基因?qū)爰中×?號和晚熟大豆品種自貢冬豆中，以實現(xiàn)大豆籽粒游離蛋氨酸含量的提高，并獲得大豆全株蛋氨酸含量提高的大豆品系。文檔編號C12N15/84GK102776230SQ20111011817公開日2012年11月14日申請日期2011年5月9日優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日發(fā)明者于洋,伊塔瑪·高朵,依法特·馬提亞胡,侯文勝,吳存祥,宋時奎,瑞徹爾·埃米爾,韓天富申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所