專利名稱：一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及乙型肝炎病毒基因的分型檢測，特別涉及一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率高，我國的乙型肝炎肝炎病毒攜帶者和患者共計(jì)約9300萬，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬。被HBV感染后，能逐漸演變?yōu)楦鼮閲?yán)重的肝病，如肝硬化、肝癌等，由此導(dǎo)致的死亡人數(shù)每年達(dá)50萬。近年來的研究表明由基因突變導(dǎo)致的不同的HBV基因型，呈地理區(qū)域性分布，且不同基因型致病性不同，基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有密切的關(guān)系。然而目前缺乏有效而準(zhǔn)確的檢測方法來對(duì)HBV進(jìn)行早期的檢測與分型，這種技術(shù)上的缺失給HBV的早期治療和術(shù)后檢查帶來了許多不便。目前的乙型肝炎分型方法有很多，主要是針對(duì)基因突變所引起的差別的檢查。當(dāng)前的分型方法包括全基因測序、表面抗原基因(S基因)序列分析、聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)基因分型、單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)基因分型法、特異性引物-PCR法、PCR微板核酸雜交-ELISA法、線性探針分析(LiPA)基因分型法、實(shí)時(shí)定量PCR 一解鏈曲線分析(Real-time PCR and melting curve analysis)。但是這些方法對(duì)于醫(yī)療系統(tǒng)而言，都存在著不同程度的難以普及性、成本昂貴以及周期長的問題。所以，在目前的醫(yī)療系統(tǒng)中，對(duì)乙型肝炎患者常規(guī)下僅作感染性檢查，極少采用分型檢測，對(duì)該病的早期診斷、預(yù)后檢查以及個(gè)體化用藥均甚為不利?；蛐酒鳛榻瓿霈F(xiàn)的兼具快速和通量高優(yōu)點(diǎn)的檢測工具，結(jié)合了測序原理， 是通過在固相載體上固定具針對(duì)性的核酸探針或蛋白質(zhì)，進(jìn)而與檢測組分雜交結(jié)合，后引入發(fā)光信號(hào)(如熒光、生物素、放射性同位素等)進(jìn)行分析檢測來分析樣品。但目前核酸雜交芯片配備設(shè)備復(fù)雜、昂貴，加之同時(shí)存在假陰性、假陽性率，故核酸分子基因芯片的質(zhì)量控制難以被掌握。固相PCR技術(shù)是利用PCR原理，在固相載體上如毛細(xì)管、硅膠片、磁珠、玻璃片上等固定修飾的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，其特點(diǎn)是反應(yīng)簡單，準(zhǔn)確性高。但就實(shí)際操作而言， 對(duì)于引物修飾及固定需要較為復(fù)雜的化學(xué)處理，如在硅膠片或毛細(xì)管上不僅需要對(duì)載體表面處理，同時(shí)需要對(duì)探針或引物進(jìn)行修飾，以及同固相載體的配套的PCR儀器并不能推廣應(yīng)用，這樣不僅使得制作程序復(fù)雜，同時(shí)引起實(shí)驗(yàn)重復(fù)性降低，導(dǎo)致常規(guī)固相PCR只能在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下完成科研工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒及檢測方法，以基因芯片為基礎(chǔ)進(jìn)行通量檢測，實(shí)現(xiàn)了高特異性且快速的對(duì)乙型肝炎病毒的基因分型和突變檢測。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因S區(qū)和PreS2區(qū)的引物對(duì)、表面固定有分型檢測探針和對(duì)照探針的固相檢測陣列、包含 DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑；所述的引物對(duì)的5、端增加生物素標(biāo)記；所述的分型檢測探針包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因型乙型肝炎病毒的檢測探針，其長度為15 25nt，其中針對(duì)檢測突變多態(tài)性的位點(diǎn)設(shè)置在探針5、端5nt之后，并在檢測探針
端進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；所述的顯色試劑包括含親和素-堿性磷酸酶的親和反應(yīng)液和含NBT/BCIP的顯色反應(yīng)液。所述的擴(kuò)增引物所擴(kuò)增的片段長度不超過IOOObp ；在檢測探針上還加入PNA、LNA 或硫基提高檢測特異性的修飾。針對(duì)A型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 2 ；針對(duì)B型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 3 SEQ IDNO 4 ；針對(duì)C型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 5 SEQ IDNO 6 ；針對(duì)D型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 7 SEQ IDNO 8 ；針對(duì)E型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 9 SEQ IDNO 10 ；針對(duì)F型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 11 SEQID NO 12 ；針對(duì)G型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 13 SEQID NO 14 ；針對(duì)H型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 15 SEQID NO :16。所述的對(duì)照探針包括陰性對(duì)照探針和陽性對(duì)照探針，其所設(shè)計(jì)的序列均與待檢測的序列無互補(bǔ)性，陽性對(duì)照探針的5、端還被生物素標(biāo)記。所述的進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾是在分型檢測探針5、端進(jìn)行polyT、 polyC、polyT+polyC 或 spacer 6 15C 序列的延長修飾；所述的固相檢測陣列的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，分型檢測探針5、 端的輔助固定修飾為在分型檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。所述的親和素反應(yīng)液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應(yīng)液組成為ImL顯色緩沖液、6. 5 μ INBT和3. 5 μ 1 BCIP0一種基于上述試劑盒的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法，包括以下步驟1)以包含待測乙型肝炎病毒基因組的DNA為模板，以引物對(duì)為擴(kuò)增引物，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理后，置于固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中，然后再加入固相檢測陣列，進(jìn)行固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)；其反應(yīng)程序?yàn)锳 在不低于探針Tm值5°C 的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環(huán)數(shù)至少大于1 ；最后72°C延伸至少 3min ；3)固相核酸擴(kuò)增完成后，取出固相檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結(jié)合，用親和反應(yīng)液覆蓋固相檢測陣列并進(jìn)行孵育，再次洗脫后用ddH20沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，直至看到顯色斑點(diǎn)后用ddH20終止反應(yīng)；
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6)顯色斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的分型結(jié)果即為所檢測的乙型肝炎病毒的基因型，根據(jù)顯色斑點(diǎn)與分型檢測探針?biāo)槍?duì)的基因型，判定乙型肝炎病毒的基因型。所述的固相檢測陣列在使用前還在體積濃度為2% 5%的BSA中37°C封閉至少 15min。所述的變性處理為熱變性處理95 °C以上至少放置5min，再在0 °C至少放置 3min ；或者，所述的變性處理為堿變性處理將質(zhì)量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出固相檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；然后將固相檢測陣列覆蓋親和反應(yīng)液后37°C孵育至少 IOmin后，再依次放入洗脫液A、洗脫液B中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出固相檢測陣列用ddH20沖洗，最后覆蓋顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，至看到顯色斑點(diǎn)后終止反應(yīng)；所述的洗脫液A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明提供的用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測，是基于固相載體上核酸擴(kuò)增的基因突變檢測，將檢測探針固定在固相檢測陣列上，與PCR擴(kuò)增的待測基因片段進(jìn)行雜交，當(dāng)擴(kuò)增的片段被檢測探針識(shí)別后，能夠進(jìn)行序列的延長(固相核酸擴(kuò)增)，使得被生物素標(biāo)記的擴(kuò)增片段固定在膜陣列上而不被洗脫，而不能被探針識(shí)別的序列，就不能進(jìn)行序列的延長，不能通過檢測探針被固定，進(jìn)而被洗脫掉；這樣通過設(shè)計(jì)多個(gè)檢測探針呈矩陣式的分布，通過一次就可以檢測出待檢測基因位點(diǎn)的突變性質(zhì)。本發(fā)明通過以基因芯片為基礎(chǔ)、PCR反應(yīng)技術(shù)為原理的高通量、高特異性、快速、并且易于推廣的檢測方法，通過在以硝酸纖維素膜為代表的固相介質(zhì)上進(jìn)行特異性探針引發(fā)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，將攜帶生物素標(biāo)記的靶序列與膜陣列上探針結(jié)合后，通過生物素-親和素-堿性磷酸酶-BCIP/NBT反應(yīng)，可以觀察到明顯藍(lán)紫色斑點(diǎn)，從而進(jìn)行肉眼判讀。2、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒基因分型的檢測，檢測準(zhǔn)確性高包括通過特異性的探針設(shè)計(jì)、利用已經(jīng)成熟PCR技術(shù)的退火溫度以阻止非特異的結(jié)合、以及利用Taq酶
外切酶活性阻止錯(cuò)配之后的延伸，完全可以達(dá)到對(duì)核酸序列單堿基差異的良好分辨力，保障了檢測的準(zhǔn)確性；并且對(duì)實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備的要求不高在普通實(shí)驗(yàn)室PCR儀上即可完成整體實(shí)驗(yàn)，無需特殊和昂貴設(shè)備；操作簡單；主要操作以PCR技術(shù)為核心，常規(guī)操作，成本低廉，易于推廣。3、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒基因分型的檢測，針對(duì)乙型肝炎病毒基因S區(qū)和 PreS2區(qū)進(jìn)行，因?yàn)楦鶕?jù)生物信息學(xué)分析比對(duì)此基因區(qū)在HBV基因組內(nèi)具有最高的保守性， 故選擇了 8個(gè)HBV基因型的型內(nèi)保守序列作為待測目的片段。另外為了保證檢測的準(zhǔn)確性， 每個(gè)基因型設(shè)計(jì)了 2個(gè)探針。其檢測結(jié)果可靠、精確；而且解決了現(xiàn)有方法的檢測速度慢、 分辨率不高、配套儀器昂貴、檢測過程復(fù)雜等技術(shù)問題，可以顯著的改善現(xiàn)有只對(duì)乙型肝炎患者做感染性檢查而很少考慮到分型檢測的現(xiàn)狀。4、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒基因分型的檢測，所提供的分型檢測探針能夠靈活組合，以適應(yīng)不同的檢測人群和檢測目的，比如將A、B、C、D和E、F、G、H八個(gè)基因型設(shè)計(jì)為 2個(gè)分別的芯片陣列，有利于臨床檢驗(yàn)的靈活應(yīng)用。因?yàn)橹袊就涟l(fā)現(xiàn)的HBV基因型以A、 B、C、D占絕大多數(shù)，E、F、G、H基因型多為國外輸入。


圖1為擴(kuò)增片段與固定在固相載體上的分型檢測探針結(jié)合、延伸、顯色的程序示意圖；其中①為硝酸纖維素膜，②為5、端延長修飾的ClO鏈，③為分型檢測探針，④為擴(kuò)增片段靶序列互補(bǔ)區(qū)，⑤為Taq酶，⑥為生物素標(biāo)記，⑦為親和素-堿性磷酸酶，⑧為BCIP/NBT 顯色；圖2為乙型肝炎病毒分型探針的特異性鑒定芯片陣列分布示意圖；圖3為乙型肝炎病毒分型檢測用檢測探針和對(duì)照探針的芯片陣列分布示意圖；圖4為乙型肝炎病毒C型分型探針的特異性鑒定顯色結(jié)果圖；圖5為乙型肝炎病毒分型檢測的顯色結(jié)果圖；圖fe 圖5d分別為檢測出的HBV 的A型、B型、C型、D型的顯色結(jié)果圖，圖k 圖證分別為檢測出的HBV的E型、F型、G 型、H型的顯色結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的乙型肝炎病毒分型檢測中檢測片段的擴(kuò)增和檢測探針的設(shè)計(jì)，檢測探針與固相載體的固定，檢測探針與擴(kuò)增片段在固相載體上雜交、擴(kuò)增，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。參見圖1，基于固相載體上核酸擴(kuò)增的基因突變檢測方法，所提供的一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因S區(qū)和ft~eS2區(qū)的引物對(duì)、表面固定有分型檢測探針和對(duì)照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑。利用ClustalX和Bioedit軟件進(jìn)行對(duì)已報(bào)道的乙肝病毒HBV 8個(gè)型的47個(gè)序列進(jìn)行多重比對(duì)，找出S區(qū)和PreS2區(qū)的型內(nèi)保守序列作為待測目的片段，其擴(kuò)增采用通常的 PCR體外擴(kuò)增，要求循環(huán)數(shù)25 40，擴(kuò)增片段的長度建議不超過lOOObp，而擴(kuò)增引物對(duì)上親和素的標(biāo)記既可以在正向引物也可以在反向引物上，具有由待測的突變位點(diǎn)在擴(kuò)增片段的位置關(guān)系來決定；檢測探針的長度設(shè)計(jì)為15 25nt，檢測探針上針對(duì)檢測突變多態(tài)性的位點(diǎn)設(shè)置在5、端5nt之后。所述的分型檢測探針包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因型乙型肝炎病毒的檢測探針，可以是包含所有針對(duì)已知的A G共8種基因型的分型檢測探針，其中有下劃線標(biāo)注的位點(diǎn)為檢測的基因型的特異性序列位點(diǎn)；針對(duì)A型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 2 ；針對(duì)B型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 3 SEQ IDNO 4 ；針對(duì)C型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 5 SEQ IDNO 6 ；針對(duì)D型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 7 SEQ IDNO 8 ；
針對(duì)E型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 9 SEQ IDNO 10 ；針對(duì)F型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 11 SEQID NO 12 ；針對(duì)G型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 13 SEQID NO 14 ；針對(duì)H型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 15 SEQID NO 16 ；并且在其5、端添加pOlyT(10)+pOlyC(10)的修飾。在所提供的分型檢測探針中，每個(gè)基因型的兩種檢測探針可以單獨(dú)使用，也可以將兩種探針混合后固定在同一個(gè)分布位點(diǎn)上?？紤]到HBV基因型呈地理區(qū)域性分布，具體基因型的選擇可以根據(jù)所針對(duì)的檢測人群，進(jìn)行適當(dāng)?shù)暮Y選；比如我國感染E、F、G、H型HBV的患者極端稀少，可以直接進(jìn)行分布有A、B、C、D四型檢測的常用探針陣列進(jìn)行首次檢測，在需要時(shí)，進(jìn)行分布有E、F、G、H四型檢測的檢測探針進(jìn)行再次檢測；也可以將A H共8種的分型檢測探針集合分布在一個(gè)陣列上進(jìn)行一次檢測。對(duì)照探針包括陰性對(duì)照探針和陽性對(duì)照探針，陰性對(duì)照探針和陽性對(duì)照探針的序列設(shè)計(jì)可以相同或不相同，原則是其序列不能與擴(kuò)增片段有交叉互補(bǔ)性。陽性對(duì)照探針的
端被生物素標(biāo)記，能夠被顯色，用以監(jiān)測顯色系統(tǒng)是否正常；陰性對(duì)照探針用以監(jiān)測雜交和固相核酸擴(kuò)增的特異性。具體的對(duì)照探針的序列可以設(shè)計(jì)為P曰t生胃,吧·歹[J Biotin-acagcactaa ggcaagctat tctg ；陰性對(duì)照序列 acagcactaa ggcaagctat tctg。分型檢測探針5、端的修飾包括減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；其中減少空間位阻的序列延長修飾是出于減少核酸擴(kuò)增錯(cuò)配和擴(kuò)增后的序列與固相載體的附著、顯色的考慮，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6 15C等多種序列的延長修飾。端的輔助固定修飾一般與固相載體結(jié)合考慮，固相載體可以為硝酸纖維素膜、 尼龍膜或者載玻片，通過在檢測探針的5、端添加氨基、巰基、羥基或醛基的輔助固定修飾與其固定，為了檢測探針更好的固定和將來的顯色效果，固相載體可以進(jìn)行多種表面修飾。比如，以硝酸纖維素膜為固相載體，通過在SSC溶液中浸泡再烘干之后，可以使得顯色斑點(diǎn)不擴(kuò)散；通過檢測探針5、端的羥基，經(jīng)紫外光照后與硝酸纖維素膜固定。對(duì)于探針特異性的修飾可使用PNA、LNA、巰基等方法，增加探針的Tm值或通過聚合酶空間構(gòu)象的改變提高探針結(jié)合并延伸的特異性。固相核酸擴(kuò)增即檢測探針與目的基因片段在固相載體上雜交、擴(kuò)增，是探針特異性識(shí)別的核心，其中，擴(kuò)增體系采用常規(guī)的PCR反應(yīng)液，其獨(dú)特之處就在于以包含檢測位點(diǎn)的分型檢測探針作為引物，能夠與目的基因互補(bǔ)雜交并進(jìn)行核酸擴(kuò)增，且通過檢測探針被固定在固相載體上不被洗脫；同時(shí)，為了保證雜交的特異性，退火溫度一般設(shè)置在不低于探針Tm值的5°C范圍內(nèi)。洗脫過程是為了將未與固相載體結(jié)合的擴(kuò)增片段洗脫掉，洗脫液可以為一般常用的緩沖液，結(jié)合離心洗脫效果比較好。顯色通過親和素-堿性磷酸酶液+NBT/BCIP的顯示方式，其優(yōu)勢在于底色不明顯， 反應(yīng)精確，結(jié)果容易判定，效果比較好；而且實(shí)現(xiàn)方便，親和素-堿性磷酸酶液和NBT/BCIP顯色液均可采用現(xiàn)有的試劑盒。下面結(jié)合乙肝病毒的基因分型檢測過程，對(duì)試劑盒及其檢測方法進(jìn)行具體的說明1)檢測用擴(kuò)增產(chǎn)物的制備設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)，并對(duì)反向擴(kuò)增引物的5、端增加生物素(Biotin)標(biāo)記，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)P具體為正向引物ctgctggtgg ctccagtt18;反向弓丨物:Biotin-gcactagtaa actgagcca 19 ；從乙肝患者血清中利用病毒提取試劑盒提取出乙肝病毒HBV的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，能夠獲得長度為630bp的擴(kuò)增片段。2)檢測探針的設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)并人工合成了乙肝病毒HBV的A G八種分型檢測探針，每型2個(gè)探針，探針 Tm值設(shè)計(jì)為59 士 1°C，探針長度為16 Mnt，同時(shí)在探針序列端進(jìn)行加上polyT (Tltl)、 PolyC(C10)的序列延長修飾，進(jìn)行減少空間位阻的延長修飾是為了利于靶序列與固定在基膜上的探針進(jìn)行結(jié)合，具體的檢測探針序列為SEQ ID NO :1 SEQ ID N0:16所示，可以選擇每種基因型針對(duì)的探針的一種，也可以是兩種混合，點(diǎn)樣時(shí)分布在一起；探針上檢測多態(tài)性的位點(diǎn)設(shè)置均在探針5、端5nt之后。3)檢測探針在檢測陣列上的固定將硝酸纖維素膜在2 X SSC溶液(檸檬酸三鈉15mM，氯化鈉150mM，pH7. 0)中浸泡 30min后取出，在37°C孵箱內(nèi)烘干2小時(shí)，再將分型檢測探針和對(duì)照探針用點(diǎn)膜儀噴涂至膜上(1滴500nl，間隔1mm，呈矩陣分布)，裁減至4mmX6mm大小，將點(diǎn)完探針的硝酸纖維素膜放入80°C烘箱烘干30分鐘，2Mnm波長紫外光照6分鐘，通過紫外光照將探針與硝酸纖維素膜固定連接，得到固定有檢測探針和對(duì)照探針的固相檢測陣列。在干燥條件下，固相檢測陣列可長期儲(chǔ)備待用，使用前將該膜浸入2% BSA液37°C封閉15min。為了檢測分型檢測探針對(duì)不同基因型的特異性檢測、顯示，設(shè)計(jì)如下兩種陣列分布為了檢測分型探針鑒定的特異性，具體以B、C型探針作為檢測示意，其探針分布如圖2所示，其中①為B型探針的兩種探針出1和似)的等比例混合物，②為陽性對(duì)照探針， ③ ④分別為C型的探針一和探針二(C1、C2)；為了檢測每種分型探針鑒定的特異性、準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)如圖3所示的探針分布其中 ①、②為對(duì)照探針，③ ⑥分別為分型檢測探針；而且以中國地區(qū)常見的基因型做了陣列分布的區(qū)分陣列一的③ ⑥分別為針對(duì)HBV的A型、B型、C型、D型的檢測探針；陣列二的 ③ ⑥分別為針對(duì)HBV的E型、F型、G型、H型的檢測探針；每個(gè)位點(diǎn)均包含同型兩個(gè)探針的等比例混合物。4)固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)首先對(duì)第一步獲得的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序號(hào)標(biāo)記，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熱變性處理95°C水浴5min，然后冰上放置^iin ；再將變性后的擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ 1、PCR反應(yīng)液(欣百諾公司，TagMixMaster) 20 μ UddH2O 10 μ 1放入干凈的PCR反應(yīng)管中混勻，將制備好的檢測陣列放入，固相檢測陣列的膜背面靠管壁，進(jìn)行固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)；設(shè)計(jì)反應(yīng)程序:A :57°C 退火30s ；B :72°C延伸30s ；A-B循環(huán)數(shù)為10 ；最后72°C延伸3min。其中分型探針的特異性鑒定是以擴(kuò)增C型乙型肝炎病毒的基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物作為檢測對(duì)象；陣列一檢測的是分別包含A D型乙型肝炎病毒的一種的基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物作為檢測對(duì)象；陣列二檢測的是分別包含F(xiàn) H型乙型肝炎病毒的一種的基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物作為檢測對(duì)象。5)洗脫與顯色固相PCR反應(yīng)完成后，取出檢測陣列進(jìn)行洗脫，將未與檢測陣列固定的片段洗脫掉，全部洗脫過程均在37°C條件下完成，具體為將檢測陣列取出，放入洗脫液A(100mmol/LpH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和4mmol/L Mg2Cl)中離心洗脫(轉(zhuǎn)速為30rpm，洗脫lmin)，取出檢測陣列后，用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的親和反應(yīng)液(ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液，購自碧云天公司，堿性磷酸酯酶標(biāo)記為Sti^ptavidin)覆蓋后，37°C條件下孵育IOmin ；孵育完成后將檢測陣列放入干凈的洗脫液A進(jìn)行洗脫(轉(zhuǎn)速30rpm，洗脫lmin)，取出后再放入洗脫液B (100mmol/LpH =9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 禾口 4mmol/L Mg2Cl)中，再離心洗脫(轉(zhuǎn)速 30rpm，洗脫 lmin)；取出檢測陣列，用清水對(duì)膜塊表面沖洗，并利用吸水紙去除膜塊上的液體，將膜塊覆蓋顯色反應(yīng)液(ImL顯色緩沖液、6. 5μ INBT和3. 5μ 1 BCIP，購自碧云天公司，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒)，30秒后肉眼可看到斑點(diǎn)后，即用清水中止反應(yīng)。6)基因型分析乙型肝炎病毒C型分型探針的特異性鑒定顯色結(jié)果圖如圖4所示，其中陽性對(duì)照探針②正常顯色，而包含B型探針Bl和探針Β2的①?zèng)]有顯色，包含C型探針Cl和探針C2 的③、④均特異性的顯示，這表明分型檢測探針的特異性，每種基因型的探針均針對(duì)其檢測的基因型特異性的顯色，其他的檢測探針無交叉反應(yīng)C型的兩個(gè)探針位點(diǎn)均特異性的顯色，而B型探針并無顯色。并且對(duì)Α、B、D的探針進(jìn)行了類似圖2設(shè)計(jì)的探針分布的特異性鑒定，且均顯示特異性非常好。陣列一的檢測結(jié)果如圖fe 圖5d所示，分別為檢測出的HBV的A型、B型、C型、 D型的顯色結(jié)果圖，其中①為陽性對(duì)照，②為陰性對(duì)照，可以看到被生物素標(biāo)記的陽性對(duì)照均正常顯色，說明顯色系統(tǒng)工作正常；陰性對(duì)照不顯色，說明固相擴(kuò)增的特異性好，沒有非特異性雜交和核酸擴(kuò)增；圖fe 圖5d中只有③、④、⑤、⑥位點(diǎn)固定的檢測探針均分別與 HBV病毒靶序列特異結(jié)合并顯色，陣列當(dāng)中只有一種探針針對(duì)待測的某種型乙肝病毒顯色， 進(jìn)行結(jié)果指示，膜陣列中其他探針并無顯色；這表明這四種基因型的探針能夠特異性的識(shí)別出待測乙肝基因組的基因型，而且其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，彼此之間無雜交染色。而陣列二的檢測結(jié)果如圖k 圖證所示，分別為檢測出的HBV的E型、F型、G 型、H型的顯色結(jié)果圖，其中①為陰性對(duì)照，②為陽性對(duì)照，可以看到被生物素標(biāo)記的陽性對(duì)照均正常顯色，說明顯色系統(tǒng)工作正常；陰性對(duì)照不顯色，說明固相擴(kuò)增的特異性好，沒有非特異性雜交和核酸擴(kuò)增；圖fe 圖5d中只有③、④、⑤、⑥位點(diǎn)固定的檢測探針均分別與HBV病毒靶序列特異結(jié)合并顯色，陣列當(dāng)中只有一種探針針對(duì)待測的某種型乙肝病毒顯
10色，進(jìn)行結(jié)果指示，膜陣列中其他探針并無顯色；這表明這四種基因型的探針能夠特異性的識(shí)別出待測乙肝基因組的基因型，而且其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，彼此之間無雜交染色。結(jié)合以上陣列的檢測結(jié)果，本發(fā)明所提供的分型檢測探針被固定形成陣列分布的檢測陣列后，每種檢測探針均能針對(duì)待測的某種型乙肝病毒顯色，進(jìn)行結(jié)果指示，其顯色明顯、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。注對(duì)于中國人群感染HBV極為稀少的基因型，尚未在患者提取的標(biāo)本當(dāng)中獲得病毒株，為了驗(yàn)證探針的檢測效果，在陣列檢測中使用了人工合成DNA模板。準(zhǔn)確性和重復(fù)性考證對(duì)100例中國乙型肝炎病毒患者的血清中HBV擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，用NCBI的 genotyping tool進(jìn)行分型，其中A型為人工合成序列1例，B型25例，C型67例，D型7 例，再同上述方法檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，該方法檢測準(zhǔn)確率為99%。其中1例誤檢因在設(shè)計(jì)探針的位點(diǎn)旁邊堿基產(chǎn)生突變引起。
權(quán)利要求
1.一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，其特征在于，包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因S區(qū)和ft~eS2區(qū)的引物對(duì)、表面固定有分型檢測探針和對(duì)照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑；所述的引物對(duì)的5、端增加生物素標(biāo)記；所述的分型檢測探針包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因型乙型肝炎病毒的檢測探針，其長度為 15 25nt，其中針對(duì)檢測突變多態(tài)性的位點(diǎn)設(shè)置在探針5、端5nt之后，并在檢測探針5、 端進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；所述的顯色試劑包括含親和素-堿性磷酸酶的親和反應(yīng)液和含NBT/BCIP的顯色反應(yīng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，其特征在于，所述的擴(kuò)增引物所擴(kuò)增的片段長度不超過IOOObp ；在檢測探針上還加入PNA、LNA或硫基提高檢測特異性的修飾。
3.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，其特征在于，針對(duì)A 型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 2 ；針對(duì)B型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 3 SEQ IDNO 4 ； 針對(duì)C型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 5 SEQ IDNO 6 ； 針對(duì)D型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 7 SEQ IDNO 8 ； 針對(duì)E型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 9 SEQ IDNO 10 ； 針對(duì)F型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 11 SEQID NO 12 ； 針對(duì)G型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 13 SEQID NO 14 ； 針對(duì)H型乙型肝炎病毒的分型檢測探針的序列為SEQ ID NO 15 SEQID NO :16。
4.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，其特征在于，所述的對(duì)照探針包括陰性對(duì)照探針和陽性對(duì)照探針，其所設(shè)計(jì)的序列均與待檢測的序列無互補(bǔ)性，陽性對(duì)照探針的5、端還被生物素標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，其特征在于， 所述的進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾是在分型檢測探針5、端進(jìn)行p0lyT、p0lyC、 polyT+polyC或spacer 6 15C序列的延長修飾；所述的固相檢測陣列的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，分型檢測探針5、端的輔助固定修飾為在分型檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。
6.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒，其特征在于，所述的親和反應(yīng)液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應(yīng)液組成為ImL顯色緩沖液、6. 5 μ INBT 禾口 3. 5 μ 1 BCIP0
7.一種基于權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)以包含待測乙型肝炎病毒基因組的DNA為模板，以引物對(duì)為擴(kuò)增引物，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理后，置于固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中，然后再加入固相檢測陣列，進(jìn)行固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)；其反應(yīng)程序?yàn)棣?在不低于探針Tm值5°C的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環(huán)數(shù)至少大于1 ；最后72°C延伸至少^iin ；3)固相核酸擴(kuò)增完成后，取出固相檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結(jié)合，用親和反應(yīng)液覆蓋固相檢測陣列并進(jìn)行孵育，再次洗脫后用ddH20沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，直至看到顯色斑點(diǎn)后用ddH20終止反應(yīng)；6)顯色斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的分型結(jié)果即為所檢測的乙型肝炎病毒的基因型，根據(jù)顯色斑點(diǎn)與分型檢測探針?biāo)槍?duì)的基因型，判定乙型肝炎病毒的基因型。
8.如權(quán)利要求7所述的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法，其特征在于，所述的固相檢測陣列在使用前還在體積濃度為2% 5%的BSA中37°C封閉至少15min。
9.如權(quán)利要求7所述的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法，其特征在于，所述的變性處理為熱變性處理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置^iin ；或者，所述的變性處理為堿變性處理將質(zhì)量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。
10.如權(quán)利要求7所述的乙型肝炎病毒基因分型的檢測方法，其特征在于，所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出固相檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；然后將固相檢測陣列覆蓋親和反應(yīng)液后37°C孵育至少IOmin后，再依次放入洗脫液A、洗脫液B中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出固相檢測陣列用ddH20沖洗，最后覆蓋顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，至看到顯色斑點(diǎn)后終止反應(yīng)；所述的洗脫液 A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/ L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于乙型肝炎病毒基因分型的檢測試劑盒及檢測方法，試劑盒包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因S區(qū)和PreS2區(qū)的引物對(duì)、表面固定有分型檢測探針和對(duì)照探針的固相檢測陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑。本發(fā)明通過以基因芯片為基礎(chǔ)，PCR反應(yīng)技術(shù)為原理的高通量、高特異性、快速、且易于推廣的檢測方法，將檢測探針固定在檢測陣列上，與PCR擴(kuò)增的待測基因片段進(jìn)行雜交，當(dāng)目的片段被固相載體上的探針識(shí)別后，能夠進(jìn)行核酸序列的合成延長，使得被生物素標(biāo)記的擴(kuò)增片段固定在檢測陣列上而不被洗脫，進(jìn)而顯色顯示，一次就可以檢測出待檢測乙肝病毒的基因型。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102212621SQ20111011828
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者劉永蘭, 包晗, 汪欽, 趙錦榮, 郭晏海, 顏真 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)