專利名稱：Prr11和fam33a基因雙向啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PRRll和FAM33A基因雙向啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動子(Promoter)是指位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游、能夠與RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游目的基因轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率的一段DNA序列。啟動子在用于設(shè)計(jì)和制備基因工程產(chǎn)品和基因治療藥物等方面，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。雙向啟動子 (Bidirectional Promoter)，屬于一種特殊類別的啟動子，該類啟動子能夠同時(shí)驅(qū)動其兩側(cè)鄰近的排列方向相反的兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。與傳統(tǒng)的單向啟動子相比，雙向啟動子在具體應(yīng)用時(shí)，不僅可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)外源基因的表達(dá)，還可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)外源基因的同時(shí)表達(dá)，因此在用于設(shè)計(jì)和制備基因工程產(chǎn)品和基因治療藥物等方面具有更為重要的價(jià)值。目前，要實(shí)現(xiàn) “采用一個(gè)載體同時(shí)高效表達(dá)兩個(gè)外源基因”主要有如下三種策略(1)使用一個(gè)啟動子，通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列anternal Ribosome Entry Site, IRES)連接兩個(gè)外源基因；使用兩個(gè)獨(dú)立的單向啟動子分別驅(qū)動兩個(gè)外源基因同時(shí)表達(dá)；C3)使用一個(gè)雙向啟動子同時(shí)驅(qū)動兩個(gè)外源基因表達(dá)。在生物醫(yī)學(xué)研究和生物技術(shù)領(lǐng)域，采用一個(gè)載體同時(shí)高效表達(dá)兩個(gè)外源基因其有重要和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。例如同時(shí)表達(dá)兩個(gè)功能或結(jié)構(gòu)上相同或不同的外源基因以用于基因治療等目的；同時(shí)表達(dá)一個(gè)二聚體蛋白質(zhì)的兩個(gè)亞基以使其在細(xì)胞內(nèi)組裝成有活性的蛋白質(zhì)；共表達(dá)目的基因與報(bào)告基因，通過報(bào)告基因追蹤目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)；作為多價(jià)DNA疫苗的表達(dá)載體，以獲得對多種抗原良好的免疫應(yīng)答以及提高核酸疫苗免疫效率。PRRll (Proline-rich protein 11，PRR11)基因是我們實(shí)驗(yàn)室最近在惡性腫瘤相關(guān)新基因挖掘與篩選研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的腫瘤相關(guān)基因，我們實(shí)驗(yàn)室率先在國內(nèi)外開展該基因的生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制等相關(guān)研究。關(guān)于該基因的生物學(xué)功能，我們的初步研究結(jié)果表明，其可能參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞癌變等多種生物學(xué)過程。PRRll基因的上游緊鄰基因?yàn)镕AM33A (family with sequence similarity 33A)，該基因則是一個(gè)最近鑒定的參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的腫瘤相關(guān)基因。有趣的是，PRRll基因和其上游緊鄰基因FAM33A基因的轉(zhuǎn)錄方向恰好相反。在我們的前期研究工作中，我們已經(jīng)初步鑒定了 PRRll和FAM33A基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并對其啟動子區(qū)域進(jìn)行了初步分析。在前期工作中， 我們采用PCR定向克隆等技術(shù)，構(gòu)建了多個(gè)相互重疊并覆蓋PRRll基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近約2. Okb區(qū)域的PRRll和FAM33A基因啟動子的熒光素酶報(bào)告基因重組體。通過對這些重組體進(jìn)行啟動子活性分析，初步對PRRll和FAM33A基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行了粗略定位，同時(shí)這些結(jié)果也提示PRRll和FAM33A基因可能共享一個(gè)雙向啟動子，即PRRll和FAM33A基因之間可能存在一段啟動子序列能夠雙向調(diào)節(jié)這對基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明就是在該前期工作基礎(chǔ)之上，對這段可能的雙向啟動子序列進(jìn)行了鑒定和分析。通過啟動子活性分析，結(jié)果表明，在PRRll和FAM33A基因之間，確實(shí)存在一段雙向啟動子序列，即該雙向啟動子在正向或反向兩個(gè)方向均能驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄，可用于基因工程產(chǎn)品和基因治療藥物的設(shè)計(jì)和制備等。而且，這段雙向啟動子序列的大致區(qū)域被初步鎖定于PRRll和FAM33A基因之間688bp的區(qū)域(即SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列)，并通過系列刪除體分析，將這段雙向啟動子序列的核心區(qū)域進(jìn)一步鎖定于PRRll和FAM33A基因之間80bp的最小區(qū)域內(nèi)(即SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供PRRll和FAM33A基因雙向啟動子的序列，以及進(jìn)一步提供該雙向啟動子序列在設(shè)計(jì)和制備基因工程產(chǎn)品和基因治療藥物中的應(yīng)用。PRRll和FAM33A基因的雙向啟動子的序列，其特征在于它包括(1)具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或(2)與(1)所述的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列；或(3)與(1)或⑵所述的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列；或(4)是⑴、⑵或(3)的核酸序列的類似物的核酸序列；或(5)與(1), (2), (3)或(4)的核酸序列，在雜交條件下雜交的核酸序列。上述的任意一種PRRll和FAM33A基因雙向啟動子的核苷酸序列可用于設(shè)計(jì)和制備基因工程產(chǎn)品和基因治療藥物。具體地講，將該啟動子下游或上游連接其它外源基因，并與不同的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞，使外源基因表達(dá)，以制備基因工程產(chǎn)品或基因治療藥物等；或者將該啟動子的上游和下游各連接一個(gè)外源基因，并與不同的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞，使兩個(gè)外源基因同時(shí)表達(dá)，以制備基因工程產(chǎn)品或基因治療藥物等。本發(fā)明中所述的核酸序列可以是其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸發(fā)生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分離序列的人工突變體，它還具有它的啟動子功能。還可以是所述的核苷酸序列與其它的啟動子序列的融合序列。本發(fā)明中所述的其它外源基因是指具有編碼某種蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)功能的任何一段核酸序列，包括RNA或DNA序列。在正常情況下，該序列與PRRl 1和FAM33A基因的雙向啟動子不相互結(jié)合。本發(fā)明中所述的表達(dá)載體是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何一種載體。本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)化是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)牒线m的宿主細(xì)胞的任何一種方法。本發(fā)明中所述的宿主細(xì)胞是指任何用于基因工程產(chǎn)品制備或基因治療藥物等的接受外源基因的細(xì)胞。術(shù)語“核酸序列”是指含有天然存在的堿基，糖和糖之間(支鏈)的鍵的核苷酸或核苷單體的序列。該序列也包括含有發(fā)揮相似功能的非天然存在的單體或其部分的修飾的或取代的序列。


圖1為PRRll和FAM33A基因啟動子報(bào)告基因重組體的構(gòu)建示意2為各PRRll和FAM33A基因啟動子報(bào)告基因重組體在H1299細(xì)胞中的活性結(jié)果圖3為各PRRll和FAM33A基因啟動子報(bào)告基因重組體在HeLa細(xì)胞中的活性結(jié)果具體實(shí)施說明實(shí)施例1 :PRR11和FAM33A基因啟動子報(bào)告基因重組體的構(gòu)建PRRll和FAM33A基因啟動子報(bào)告基因重組體的構(gòu)建參見圖1。其中，TSS即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)CTranscription Start Site，TSS) ；PRRll基因的首個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基被定位為+1 ；圖中各重組體的命名為“基因名稱-P長度(起始位點(diǎn)/終止位點(diǎn))”，下文中的重組體名稱則簡寫為“基因名-P長度”。1、FAM33A-P688 的構(gòu)建采用PCR介導(dǎo)的定向克隆的方法。首先使用I^rimer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)出一對引物，分別含Kpn I/Nhe I限制性酶切位點(diǎn)(PRR11-PF1269-2 5' -CTAGGCTAGCAGGAGGAGGGAACTCGACTCTGG-3‘PRR 11-PR1956-2 5' -GGGGTACCGATTCGCTCTTCGGATGGTGTA-3‘)，以pGUb-PRRll-P1496(100ng/y 1)重組質(zhì)?；蛉苏；蚪MDNA為模板，采用 Invitrogen公司的高保真酶platinum Taq進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和程序參照 Invitrogen公司的高保真酶platinum Taq的說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物的回收采用TIANGEN公司的普通膠回收產(chǎn)物純化試劑盒，具體方法參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。再分別對PCR回收產(chǎn)物和pGL3-basiC vector進(jìn)行Kpn I/Nhe I 雙酶切，酶切反應(yīng)結(jié)束后分別用天根普通PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒和天根膠回收試劑盒回收，具體方法參照試劑盒使用說明書。然后，將PCR回收產(chǎn)物和pGL3-basiC Vector的Kpn I/Nhe I雙酶切純化回收產(chǎn)物采用TAKARA公司的DNA Ligation Kit進(jìn)行連接，具體方法參照試劑盒使用說明書。最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆均經(jīng)DNA測序確認(rèn)無誤。2、PRR11-P688之外的其它重組體的構(gòu)建均采用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變的方法，采用Τ0Υ0Β0公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit，具體方法參照試劑盒使用說明書。所有陽性克隆均經(jīng)DNA測序確認(rèn)無誤。各重組體采用的模板和引物序列如下表所示
權(quán)利要求
1.PRRll和FAM33A基因的雙向啟動子，其特征在于它包括(1)具有SEQID NO 1和SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列；或(2)與(1)所述的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列；或(3)與(1)或( 所述的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核酸序列的類似物的核酸序列；或(5)與(1)、O)、(3)或⑷的核酸序列，在雜交條件下雜交的核酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的任意一種PRRll和FAM33A基因雙向啟動子序列在設(shè)計(jì)和制備基因工程產(chǎn)品和基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及PRR11和FAM33A基因雙向啟動子及其應(yīng)用。PRR11和FAM33A基因雙向啟動子在正向或反向兩個(gè)方向均能驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在基因工程和基因治療等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/113GK102226179SQ20111011882
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者劉竹, 卜友泉, 宋方洲, 楊正梅, 艾青 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)