專利名稱：：基于自聚集短肽誘導的酶聚集體的蛋白質(zhì)純化方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及重組蛋白的表達及純化，具體地說，涉及一種基于自聚集短肽誘導的酶聚集體的蛋白質(zhì)純化方法。
背景技術：
：重組蛋白的生產(chǎn)，無論在工業(yè)領域還是實驗室規(guī)模都十分重要，而重組蛋白的分離與純化成本約占其全部成本的60%-80%(陳浩，陳于紅，朱德煦，劉建寧，重組蛋白純化技術，中國生物工程雜志，2002，22(5):p.87-92.)。重組蛋白的純化可以分為樣品制備、捕獲、中度純化和精細純化等4步，其中中度純化可以達到適中的樣品純度，其處理后的蛋白樣品可以被用于多種實驗分析目的如N端序列分析、抗原抗體反應等。目前可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)中度純化的方法包括傳統(tǒng)的離子交換層析、疏水性相互作用層析、親和層析，以及近期的研究熱點如自切割自聚集功能的融合標簽表達等。離子交換層析和疏水性相互作用層析由于對樣品起始條件有一定的要求，通用性和效率不及親和層析。親和純化通?？梢垣@得超過90%的高收率，使其成為目前最常用的重組蛋白中度純化方法之一。實驗室中常用的親和純化技術包括多組氨酸標簽(his-tag)或谷胱甘肽轉移酶標簽(GST-tag)與目的蛋白的融合表達，為不同目的蛋白的生產(chǎn)提供了通用的純化手段(Arnau，J.，C.Lauritzen等,Currentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteins.ProteinExpressionandPurification,2006.48(1):p.1-13.)。然而昂貴純化柱的使用和為了移除融合表達標簽而需要蛋白酶的加入，這兩個主要缺點使親和純化成本較高，不利于工業(yè)領域的應用。設計具有自聚集自切割功能的融合標簽以克服上述缺點。來自典型性豬瘟病毒(CSFV)N-端的具有蛋白酶活性且有強烈的形成不可溶聚集體趨勢的Npm，就具備了將聚集純化和蛋白質(zhì)剪切集于一身的特點。但是利用Npm方法需要對目的蛋白進行復性和進一步的精細純化來去除產(chǎn)物中的Npm融合片段(Achmuller，C.，W.Kaar等，N-profusiontechnologytoproduceproteinswithauthenticNterminiinE-coli.NatureMethods，2007.4:p.1037-1043.)。將具有誘導聚集功能的類彈性蛋白(Elastin-LikePolypeptide,ELP)與具有自切割功能的內(nèi)含肽(Intein)結合，構建出的新融合標簽可以產(chǎn)生與Npm相似的功效。與這一標簽融合表達的蛋白可以通過控制溫度或鹽度，在分離后的溶液和沉淀之間不斷轉換，從而達到純化目的(Meyer，D.Ε.andA.Chilkoti.，Purificationofrecombinantproteinsbyfusionwiththermally-responsivepolypeptides.NatureBiotechnology,1999.17(11):p.1112-1115.；Banki,Μ.R.,L.A.Feng等，Simplebioseparationsusingself-cleavingelastin-likepolypeptidetags.NatureMethods,2005.2(9):p.659-661.；Ge,X.,D.S.C.Yang，等，Self-cleavablestimulusresponsivetagsforproteinpurificationwithoutchromatography.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2005.127(32):p.11228-11229.)。但是反復進行的溫度或鹽度調(diào)節(jié)，有可能影響純化蛋白活性，并且多步操作不利于簡化工藝流程。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有蛋白純化技術中成本高、使用蛋白酶、操作步驟較多等不足，提供一種具有自聚集自切割功能的融合標簽，以及利用該融合標簽進行重組蛋白快速純化的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種基于自聚集短肽誘導的酶聚集體的蛋白質(zhì)純化方法，1)將目的蛋白、含可切割位點的肽段和自聚集短肽的融合蛋白融合表達，所述的融合蛋白的連接順序為目的蛋白-含可切割位點的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位點的肽段-目的蛋白；2)將表達上述融合蛋白的宿主細胞破碎后，離心和/或過濾獲得沉淀，然后利用與可切割位點對應的切割方式，誘導切割位點斷裂釋放可溶目的蛋白，最后進行離心和/或過濾，得上清。前述的蛋白質(zhì)純化方法，步驟1)中所述自聚集短肽具有SEQIDNo:3、SEQIDNo4、SEQIDNo:5或SEQIDNo6所示的氨基酸序列(含Linker)。前述的蛋白質(zhì)純化方法，步驟1)中所述的與可切割位點對應的切割方式為具有自切割功能的內(nèi)含肽的自切害I]、酶法或化學法等，優(yōu)選為具有自切割功能的內(nèi)含肽的自切割。所述內(nèi)含肽如DnaB或MxeGyrA，優(yōu)選為MxeGyrA內(nèi)含肽。前述的蛋白質(zhì)純化方法，步驟2、中所述宿主細胞為原核微生物或真菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母等。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術措施來進一步實現(xiàn)。將具有誘導聚集功能的短肽與有自切割功能的內(nèi)含肽以及目的純化蛋白按從左到右或從右到左兩種順序融合表達。誘導聚集功能的短肽會使融合蛋白三聯(lián)體在微生物胞內(nèi)表達時形成不可溶的聚集體體，可以利用簡單的離心或過濾手段使融合蛋白三聯(lián)體與細菌裂解液中的雜質(zhì)成分分離。內(nèi)含肽是一段具有蛋白酶活性的特殊序列多肽，在誘導其蛋白酶活性產(chǎn)生后可以在設計位點的特定氨基酸殘基切割，從而釋放可溶的目的蛋白到溶液中。大部分融合蛋白三聯(lián)體可以在表達時以酶聚集體形式表達，在離心分離細胞破碎液后，可以在沉淀中大量獲得。之后通過更換緩沖液誘導內(nèi)含肽剪切相應的識別位點，從而將目的蛋白釋放到溶液里，而內(nèi)含肽-自聚集短肽部分仍然在沉淀之中。最后利用簡單的離心或過濾分離溶液和不溶物，從而在溶液中獲得較高純度的目的蛋白。具體地，包括以下步驟1)通過聚合酶鏈式反應(PCR)、限制性酶切和粘性末端連接技術，構建表達三聯(lián)體融合蛋白的基因序列，并將其連接入含有抗性基因的表達載體中，將所述表達載體導入宿主中，培養(yǎng)宿主并誘導表達，得到所述融合蛋白三聯(lián)體。2)將表達融合蛋白三聯(lián)體的宿主菌液破碎，之后利用離心的方法分離沉淀和上清，其中融合蛋白三聯(lián)體在沉淀中。洗滌后利用內(nèi)含肽對應的切割緩沖液重懸融合蛋白三聯(lián)體，保持一定溫度并在一定時間后離心分離緩沖液和沉淀，目的蛋白即存在于緩沖液中。其中，步驟1)中所述宿主可為大腸桿菌(Escherichiacoli)，所述含有抗性基因的表達載體為可在上述宿主中表達的載體，如pET-30a(+)。所述融合蛋白三聯(lián)體中有誘導聚集功能的短肽序列可為下述氨基酸序列之一a.SEQIDNo3；b.SEQIDNo4；c.SEQIDNo5；d.SEQIDNo:6。步驟2)中所述內(nèi)含肽可以是kpDnaB或MxeGyrA等，優(yōu)選為MxeGyrA，對應的切割緩沖液優(yōu)選為20mMTris-HCl(pH8.0)，500mMNaCl,40mM二硫蘇糖醇(DTT)，ImMEDTA；步驟2)中所述切割時間和溫度分別為3-24h和4°C-20°C，優(yōu)選為M小時和4°C。本發(fā)明還提供含有目的蛋白、含可切割位點的肽段和自聚集短肽的融合蛋白，其連接順序為目的蛋白-含可切割位點的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位點的肽段-目的蛋白。優(yōu)選地，所述的自聚集短肽，其具有SEQIDNo:1或SEQIDNo2所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供上述融合蛋白表達形成的酶聚集體。本發(fā)明還提供編碼上述自融合蛋白基因。本發(fā)明提供了2條短肽鏈，ELK16(SEQIDNo1)和18A(SEQIDNo:2)，它們分別與目的蛋白進行融合表達可以誘導融合蛋白形成高活性聚集體，表明其融合表達對蛋白質(zhì)結構影響較小。將短肽與含可切割位點的肽段(優(yōu)選為內(nèi)含肽)和目的蛋白按從左到右或從右到左的順序融合表達成三聯(lián)體，可以實現(xiàn)對目的蛋白的快速純化。本發(fā)明提供的重組蛋白純化方法，無需使用昂貴的親和柱和蛋白酶，操作步驟簡單易行，即可獲得較高純度的重組蛋白。可大幅度降低蛋白質(zhì)純化的成本，一方面可用于實驗室規(guī)模的高通量蛋白純化，另一方面由于其較高的經(jīng)濟性，克服了工業(yè)領域應用的瓶頸。圖1為融合蛋白三聯(lián)體結構示意圖，從左至右分別為目的蛋白、含可切割位點的肽段(采用優(yōu)選的內(nèi)含肽)和自聚集短肽。圖2為融合蛋白三聯(lián)體表達、切割及純化的流程示意圖。圖3A-圖3C為自聚集短肽ELK16在融合蛋白C末端(SEQIDNo3)表達，分別以枯草芽胞桿菌脂肪酶A、煙曲霉amadoriaseII、短小芽孢桿菌木糖苷酶為例的純化實驗結果；4條道從左到右分別是融合蛋白三聯(lián)體表達菌株裂解液沉淀部分、過夜切割后的沉淀部分、過夜切割后的緩沖液部分、蛋白Marker。圖4A-圖4C為自聚集短肽18A在融合蛋白C末端(SEQIDNo:4)表達，分別以枯草芽胞桿菌脂肪酶A、煙曲霉amadoriaseII、短小芽孢桿菌木糖苷酶為例的純化實驗結果；4條道從左到右分別是融合蛋白三聯(lián)體表達菌株裂解液沉淀部分、過夜切割后的沉淀部分、過夜切割后的緩沖液部分、蛋白Marker。從過夜切割后的緩沖液部分可以得知，18A誘導的聚集體在切割后的內(nèi)含肽-自聚集短肽融合蛋白會部分溶解，但其與目的蛋白條帶總計純度扔超過90%，可利用后續(xù)精制純化分離出目的蛋白。圖5為自聚集短肽18A在融合蛋白N末端(SEQIDNo6)表達，以枯草芽胞桿菌脂肪酶A為例的純化實驗結果；4條道從左到右分別是融合蛋白三聯(lián)體表達菌株裂解液沉淀部分、過夜切割后的沉淀部分、過夜切割后的緩沖液部分、蛋白Marker。從SDS-PAGE上可看出融合蛋白三聯(lián)體采用kpDnaB時，內(nèi)含肽誘導自切割量很少。因此優(yōu)選MxeGyrA內(nèi)含肽構建融合蛋白三聯(lián)體。圖6為質(zhì)粒pET-30a(+)_LipA_ELK16和pET_30a(+)_LipA_18A的結構。圖7為質(zhì)粒pET_30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET_30a(+)-LipA-Mxe_18A的結構。圖8為質(zhì)粒pET_30a(+)-AMA-ELK16的結構。圖9為質(zhì)粒pET_30a(+)-XynB-ELK16的結構。圖10為質(zhì)粒pET-30a(+)-18A_LipA的結構。具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見((MolecularCloning:ALaboratoryManual))(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。Mffi弓L均由大連寶生物CTakaRa)或英俊生物(Invitrogen)合成。實施例1以野生型枯草芽胞桿菌脂肪酶A(LipA)作為目的蛋白(融合在N末端)的三聯(lián)體融合蛋白表達及其純化菌株EscherichiacoliBL21(DE3)載體pET_30a(+)培養(yǎng)基IB/Karf，每升培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.Og5NaCl10.Og,若為固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基添加瓊脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。1、構建三聯(lián)體融合蛋白表達載體pET-30a(+)-LipA-Mxe_ELK16和pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A使用Tiangen公司的高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取pET_30a(+)_LipA_ELK16質(zhì)粒(ELK16在C末端與LipA融合，質(zhì)粒結構如圖6所示。其構建方法為選擇商用質(zhì)粒Novogen公司的pET-30a(+)質(zhì)粒，用在線工具DNAworks設計Linker和ELK16核苷酸序列，利用重疊PCR的方法將來自枯草芽孢桿菌脂肪酶A的LipA基因和帶Linker的ELK16基因按LipA基因在N端的順序合成出來，再將此段基因插入pET-30a(+)質(zhì)粒的NdeI和BioI位點間，形成pET-30a(+)-LipA-ELK16質(zhì)粒)、pET_30a(+)-LipA_18A質(zhì)粒(18A在C末端與LipA融合，質(zhì)粒結構如圖6所示，其構建方法為選擇商用質(zhì)粒Novogen公司的pET_30a(+)質(zhì)粒，用在線工具DNAworks設計Linker和18A核苷酸序列，利用重疊PCR的方法將來自枯草芽孢桿菌脂肪酶A的LipA基因和帶Linker的18A基因按LipA基因在N端的順序合成出來，再將此段基因插入pET-30a(+)質(zhì)粒的NdeI和BioI位點間，形成pET_30a(+)_LipA_18A質(zhì)粒)和NewEnglandBiolab(NEB)公司的pTWim質(zhì)粒，利用如下兩套正向引物和反向引物，按照常規(guī)方法進行PCR擴增兩個基因片段，分別是LipA基因片段和MxeGyrA內(nèi)含肽基因片段第一套上游引物5'-GCGATACATATGCACCATCACCATCA-3‘(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NdeI識別位點)和下游引物5，-GCATCTCCCGTGATGCACATTCGCATATTCGTATTCTGGCCCC-3，，第二套上游引物5，-GGGGCCAGAATACGAATATGCGAATGTGCATCACGGGAGAT-3，和下游引物5，-ATTTTAAAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII識別位點)。PCR反應使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反應條件為先94°C2min；然后94°Clmin,57°Clmin,72°C40sec，共30個循環(huán)，；最后72°CIOmin0反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出2條正確大小的條帶，與預期結果相符。之后將兩個片段進行凝膠分離回收，在以兩個片段作為模板，進行重疊PCR反應先在不加入引物的情況下94°Canin；然后94°Clmin,70°Clmin，72°C80sec，共10個循環(huán)；最后72°CIOmin0再進行94°C2min；然后加入引物5‘-GCGATACATATGCACCATCACCATCA-3‘和5，-ATTTTAAAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3，，PCR程序94°Clmin,57°Clmin,72°C40sec,共17個循環(huán)；最后72°ClOmin。反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶。將重疊PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind111進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET-30a(+)-LipA-ELK16和pET_30a(+)_LipA_18A分別進行連接，將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的LipA基因序列正確(SEQIDNo7)02、融合蛋白三聯(lián)體LipA-Mxe_ELK16和LipA-Mxe_18A的表達與切割純化將構建好的菌株接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，加入0.2mMIPTG，在30°C下誘導6小時，收獲細胞，取IOOD細胞用Iml裂解緩沖液重懸，破壁，離心分離上清和沉淀。將沉淀用裂解緩沖液洗滌2次后，使用切割緩沖液QOmMTris-HCKpH8.0)，500mMNaCl，40mM二硫蘇糖醇，ImMEDTA)重懸充分，置于4°C過夜Mh。之后將懸濁液離心分離，得到的上清和沉淀與切割前的沉淀一起進行SDS-PAGE檢測(結果如圖3A和圖4A所示，分別為泳道1切割前的細胞裂解物沉淀，可檢測到清晰的融合蛋白三聯(lián)體表達成的酶聚集體；泳道2切割后分離的沉淀；泳道3切割后分離的上清，可檢測到清晰的目的蛋白條帶；泳道4標準蛋白分子量Marker)和LipA的脂肪酶酶活性測定。其中，脂肪酶活性的定量測定方法如下測定LipA對棕櫚酸對硝基苯脂(p-nitrophenylpalmitate，pNPP)的活性。對pNPP測量方法詳見文獻(Winkler,U.K.，M.Stuckmann,Glycogen,Hyaluronate,andSomeOtherPolysaccharidesGreatlyEnhancetheFormationofExolipasebySerratiamarcescens,J0URNAL0FBACTERIOLOGY,1979,138(3):663-670)。活性定義為在測定條件下，1分鐘內(nèi)水解上述底物產(chǎn)生Inmol的對硝基苯酚(p-nitrophenol)或是脂肪酸(fattyacid)所需要的酶量定義為1個活性單位。對SDS-PAGE結果應用Bio-Rad的QuantityOne軟件檢測，利用不同濃度的BSA標準品制成的標準曲線估算對應條帶的濃度，從而計算出純化的LipA濃度、比活力、切割效率、質(zhì)量回收率(切割后上清目的蛋白質(zhì)量/切割前沉淀中目的蛋白理論總質(zhì)量)。對于自聚集短肽ELK16構建的體系分別為99士8yg/ml、133.4士2.OU/mg、(73士1)%和(59士4)%；對于自聚集短肽18A構建的體系分別為145士4μβ/πι1、72.8士3.9U/mg、(78士2)%禾口(68士7)%。實施例2煙曲霉AmadoriaseII(AMA)作為目的蛋白(融合在N末端)的三聯(lián)體融合蛋白表達及其純化。菌株EscherichiacoliBL21(DE3)載體PET-3Oa(+)培養(yǎng)基IB/Karf，每升培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.Og5NaCl10.Og,若為固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基添加瓊脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。1、構建三聯(lián)體融合蛋白表達載體pET_30a(+)-AMA-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-AMA-Mxe-18A使用Tiangen公司的高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取pET_30a(+)-LipA-Mxe_ELK16質(zhì)粒(構建方法請見實施例1，圖7)、pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A(構建方法請見實施例1，圖7)和pET-30a(+)-AMA-ELK16質(zhì)粒(ELK16在C末端與AMA融合，質(zhì)粒結構如圖8所示，其構建方法為選擇商用質(zhì)粒Novogen公司的pET_30a(+)質(zhì)粒，用在線工具DNAworks設計Linker和ELK16核苷酸序列，利用重疊PCR的方法將來自煙曲霉AmadoriaseII的AMA基因和帶Linker的ELK16基因按AMA基因在N端的順序合成出來，再將此段基因插入pET-30a(+)質(zhì)粒的NdeI和BioI位點間，形成pET_30a(+)-AMA-ELK16質(zhì)粒)，利用如下正向引物和反向引物，按照常規(guī)方法進行PCR擴增AMA基因片段上游引物5’-TTCTGGACATATGGCGGTAACCAATCATC-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NdeI識別位點)和下游引物5’_GGTGGTACTAGTGCATCTCCCGTGATGCACATTCGCATTAACTTGGAAATATCTCTATA-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SpeI識別位點)。PCR反應使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反應條件為先94°C2min；然后94°Clmin,57°Clmin,72°CIOOsec，共30個循環(huán)；最后72°CIOmin0反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出1條正確大小的條帶，與預期結果相符。之后將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI和SpeI進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET_30a(+)-LipA_Mxe-18A分別進行連接，將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的AMA基因序列正確。2、融合蛋白三聯(lián)體AMA-Mxe_ELK16和AMA_Mxe_18A的表達與切割純化將構建好的菌株接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，加入0.2mMIPTG，在30°C下誘導6小時，收獲細胞，取100D細胞用Iml裂解緩沖液重懸，離心分離上清和沉淀。將沉淀用裂解緩沖液洗滌2次后，使用切割緩沖液QOmMTris-HCKpH8.0)，500mMNaCl，40mM二硫蘇糖醇，ImMEDTA)重懸充分，置于4°C過夜Mh。之后將懸濁液離心分離，得到的上清和沉淀與切割前的沉淀一起進行SDS-PAGE檢測(結果分別如圖:3B和圖4B所示，分別為泳道1切割前的細胞裂解物沉淀，可檢測到清晰的融合蛋白三聯(lián)體表達成的酶聚集體；泳道2切割后分離的沉淀；泳道3切割后分離的上清，可檢測到清晰的目的蛋白條帶；泳道4標準蛋白分子量Marker)和AMA的酶活性測定。AMA的活性測量方法詳見文獻(SakaueR,KajiyamaN,Thermostabilizationofbacterialfructosyl-aminoacidoxidasebydirectedevolution.ApplEnvironMicrobiol2003,69(1):139-145).活性定義為在測定條件下，1分鐘內(nèi)水解底物產(chǎn)生1μmol的H2A所需要的酶量定義為1個活性單位。對SDS-PAGE結果應用Bio-Rad的QuantityOne軟件檢測，利用不同濃度的BSA標準品制成的標準曲線估算對應條帶的濃度，從而計算出純化的AMA濃度、比活力、切割效率、質(zhì)量回收率(切割后上清目的蛋白質(zhì)量/切割前沉淀中目的蛋白理論總質(zhì)量)。對于自聚集短肽ELK16構建的體系分別為48士lyg/ml、1.8士0.3U/mg、(65士2)%禾口(27士3)%；對于自聚集短肽18A構建的體系分別為111士Hyg/mlJ.3士0.5U/mg、(80士1)%和(62士3)%。實施例3短小芽孢桿菌木糖苷酶(XynB)作為目的蛋白的三聯(lián)體融合蛋白(融合在N末端)表達及其純化菌株EscherichiacoliBL21(DE3)載體PET-3Oa(+)培養(yǎng)基IB/Karf，每升培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.Og5NaCl10.Og,若為固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基添加瓊脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。1、構建三聯(lián)體融合蛋白表達載體pET_30a(+)-XynB-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-XynB-Mxe-18A使用Tiangen公司的高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取pET_30a(+)-LipA-Mxe_ELK16質(zhì)粒(構建方法請見實施例1，質(zhì)粒結構如圖7所示)、pET-30a⑴-LipA_Mxe-18A(構建方法請見實施例1，質(zhì)粒結構如圖7所示)和pET-30a(+)-XynB-ELK16質(zhì)粒(ELK16在C末端與XynB融合，質(zhì)粒結構如圖9所示，其構建方法為選擇商用質(zhì)粒Novogen公司的pET-30a(+)質(zhì)粒，用在線工具DNAworks設計Linker和ELK16核苷酸序列，利用重疊PCR的方法將來自短小芽孢桿菌木糖苷酶的XynB基因和帶Linker的ELK16基因按XynB基因在N端的順序合成出來，再將此段基因插入pET-30a(+)質(zhì)粒的NdeI和BioI位點間，形成pET-30a(+)-XynB-ELKie質(zhì)粒)，利用如下正向引物和反向引物，按照常規(guī)方法進行PCR擴增AMA基因片段上游引物5，-ATGAGCACATATGAAGATTATCAATCCAGTGCTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NdeI識別位點)和下游引物5，-CGAGCAACTAGTGCATCTCCCGTGATGCACATTCGCATTTCGTCTGTTTCCTCATAAC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SpeI識別位點)。PCR反應使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反應條件為先94°C2min；然后94°Clmin,57°Clmin,72°C120sec，共30個循環(huán)；最后72°CIOmin0反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出1條正確大小的條帶，與預期結果相符。之后將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI和SpeI進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET_30a(+)-LipA_Mxe-18A分別進行連接，將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌fecherichiacoliBL21(DE!3)感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的AMA基因序列正確。2、融合蛋白三聯(lián)體XynB-Mxe-ELK16和XynB-Mxe_18A的表達與切割純化將構建好的菌株接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，加入0.2mMIPTG，在30°C下誘導6小時，收獲細胞，取100D細胞用Iml裂解緩沖液重懸，破壁，離心分離上清和沉淀。將沉淀用裂解緩沖液洗滌2次后，使用切割緩沖液QOmMTris-HCKpH8.0)，500mMNaCl，40mM二硫蘇糖醇，ImMEDTA)重懸充分，置于4°C過夜Mh。之后將懸濁液離心分離，得到的上清和沉淀與切割前的沉淀一起進行SDS-PAGE檢測(結果分別如圖3C和圖4C所示，分別為泳道1切割前的細胞裂解物沉淀，可檢測到清晰的融合蛋白三聯(lián)體表達成的酶聚集體；泳道2切割后分離的沉淀；泳道3切割后分離的上清，可檢測到清晰的目的蛋白條帶；泳道4標準蛋白分子量Marker)和XynB的酶活性測定。XynB的活性測量方法詳見文獻(SiaoWL,WiegelJ，Purificationandcharacterizationofathermostablebeta-xylosidasefromthermoanaerobacter-ethanolicus.JBacteriol1992,174(18):5848_5853.)。舌個生定義為在測定條件下，1分鐘內(nèi)水解底物產(chǎn)生1μmol的對硝基苯酚(p-nitrophenol)所需要的酶量定義為1個活性單位。對SDS-PAGE結果應用Bio-Rad的QuantityOne軟件檢測，利用不同濃度的BSA標準品制成的標準曲線估算對應條帶的濃度，從而計算出純化的XynB濃度、比活力、切割效率、質(zhì)量回收率(切割后上清目的蛋白質(zhì)量/切割前沉淀中目的蛋白理論總質(zhì)量)。對于自聚集短肽ELK16構建的體系分別為41士lyg/ml、1.5士0.lU/mg、(57士2)%禾口(23士1)%；對于自聚集短肽18A構建的體系分別為沈士3μg/ml、2.6士0.3U/mg、(69士3)%和(14士1)%。實施例4野生型枯草芽胞桿菌脂肪酶A(LipA)作為目的蛋白(融合在C末端)的三聯(lián)體融合蛋白表達及其純化。菌株EscherichiacoliBL21(DE3)載體PET-3Oa(+)培養(yǎng)基IB/Karf，每升培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10.Og，酵母浸膏粉5.Og5NaCl10.Og,若為固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基添加瓊脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。1、構建三聯(lián)體融合蛋白表達載體pET-30a(+)-18A-Ssp_LipA使用Tiangen公司的高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取pET-30a(+)-18A-LipA質(zhì)粒(18A在N末端與LipA融合，質(zhì)粒結構如圖10所示，其構建方法為選擇商用質(zhì)粒Novogen公司的pET-30a(+)質(zhì)粒，用在線工具DNAworks設計18A和Linker核苷酸序列，利用重疊PCR的方法將來自枯草芽孢桿菌脂肪酶A的LipA基因和帶Linker的18A基因按LipA基因在C端的順序合成出來，再將此段基因插入pET-30a(+)質(zhì)粒的NdeI和HindIII位點間，形成pET-30a(+)-18A-LipA質(zhì)粒)和NewEnglandBiolab(NEB)公司的pTWim質(zhì)粒，利用如下兩套正向引物和反向引物，按照常規(guī)方法進行PCR擴增兩個基因片段，分別是LipA基因片段和kpDnaB內(nèi)含肽基因片段第一套上游引物5‘-CGCGAGGAATTCGCTATCTCTGGCGATAGTCTGA-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識別位點)和下游引物5'-CGACTGGATTGTGTTCGGCGCGCCCGTTGTGTACAATGA-3‘，第二套上游引物5‘-TCATTGTACACAACGGGCGCGCCGAACACAATCCAGTCGTTAT-3‘和下游引物5‘-GGCCGCAAGCTTATTCGTATTC-3‘(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII識別位點)。PCR反應使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反應條件為先94°C2min；然后94°Clmin,57°Clmin,72°C40sec，共30個循環(huán)；最后72°CIOmin0反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出2條正確大小的條帶，與預期結果相符。之后將兩個片段進行凝膠分離回收，在以兩個片段作為模板，進行重疊PCR反應先在不加入引物的情況下94°C2min；然后94°Clmin,70°Clmin，72°C80sec,共10個循環(huán)；最后72°CIOmin0再進行94°C2min；然后加入引物5'-CGCGAGGAATTCGCTATCTCTGGCGATAGTCTGA-3'和5‘-GGCCGCAAGCTTATTCGTATTC-3‘，PCR程序94"Clmin,570Clmin,72°C40sec，共17個循環(huán)；最后72°CIOmin0反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶。將重疊PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET-30a(+)-18A-LipA進行連接，將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌hcherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的LipA基因序列正確(SEQIDNo7)02、融合蛋白三聯(lián)體18A-kp-LipA的表達與切割純化將構建好的菌株接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，加入0.2mMIPTG，在30°C下誘導6小時，收獲細胞，取100D細胞用Iml裂解緩沖液重懸，破壁，離心分離上清和沉淀。將沉淀用裂解緩沖液洗滌2次后，使用切割緩沖液QOmMTris-HCKpH6.0)，500mMNaCl,lmMEDTA)重懸充分，置于25°C過夜Mh。之后將懸濁液離心分離，得到的上清和沉淀與切割前的沉淀一起進行SDS-PAGE檢測(結果如圖5所示，分別為泳道1切割前的細胞裂解物沉淀，可檢測到清晰的融合蛋白三聯(lián)體表達成的酶聚集體；泳道2切割后分離的沉淀；泳道3切割后分離的上清；泳道4標準蛋白分子量Marker)和LipA的脂肪酶酶活性測定。其中，脂肪酶活性的定量測定方法同實施例1中的描述。脂肪酶活性測定顯示切割后分離的上清具有一定的活性，但SDS-PAGE檢測不到目的蛋白的條帶(約21kDa)。從SDS-PAGE上也可看出融合蛋白三聯(lián)體的內(nèi)含肽誘導自切割量很少，因此優(yōu)選MxeGyrA內(nèi)含肽構建融合蛋白三聯(lián)體。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。權利要求1.一種基于自聚集短肽誘導的酶聚集體的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，1)將目的蛋白、含可切割位點的肽段和自聚集短肽的融合蛋白融合表達，所述的融合蛋白的連接順序為目的蛋白-含可切割位點的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位點的肽段-目的蛋白；2)將表達上述融合蛋白的宿主細胞破碎后，離心和/或過濾獲得沉淀，然后利用與可切割位點對應的切割方式，誘導切割位點斷裂釋放可溶目的蛋白，最后進行離心和/或過濾，得上清。2.根據(jù)權利要求1所述的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，步驟1)中所述自聚集短肽具有SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo5或SEQIDNo6所示的氨基酸序列。3.根據(jù)權利要求1所述的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，步驟1)中所述的與可切割位點對應的切割方式為具有自切割功能的內(nèi)含肽的自切割、酶法或化學法。4.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，步驟1)中所述的與可切割位點對應的切割方式為具有自切割功能的內(nèi)含肽的自切割。5.根據(jù)權利要求4所述的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，所述的具有自切割功能的內(nèi)含肽為SspDnaB或MxeGyrA。6.根據(jù)權利要求5所述的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，所述的具有自切割功能的內(nèi)含肽為MxeGyrA。7.根據(jù)權利要求1-6任一項所述的蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，步驟幻中所述宿主細胞為原核微生物或真菌。8.含有目的蛋白、含可切割位點的肽段和自聚集短肽的融合蛋白，其連接順序為目的蛋白-含可切割位點的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位點的肽段-目的蛋白。9.根據(jù)權利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述的自聚集短肽的氨基酸序列如SEQIDNo:1或SEQIDNo2所示。10.編碼權利要求8或9所述的融合蛋白的基因。11.權利要求8或9所述的融合蛋白表達形成的酶聚集體。全文摘要本發(fā)明提供了一種基于自聚集短肽誘導的酶聚集體的蛋白質(zhì)純化方法，其是將目的蛋白、含可切割位點的肽段(優(yōu)選為內(nèi)含肽)以及具有自聚集功能的短肽按從左至右或從右之左的順序融合表達為三聯(lián)體，在表達過程中形成酶聚集體，可通過離心或過濾方法與細胞裂解液中大部分可溶雜質(zhì)分離；之后通過誘導可切割位點處的切割將目的蛋白從聚集體釋放到溶液中，從而達到純化目的。該方法具有成本低，流程簡單的特點，可用于實驗室規(guī)模的高通量蛋白純化，也有利于工業(yè)規(guī)模的蛋白生產(chǎn)。文檔編號C12N15/80GK102226172SQ20111011887公開日2011年10月26日申請日期2011年5月9日優(yōu)先權日2011年5月9日發(fā)明者吳偉,林章凜,邢磊申請人:清華大學