專利名稱：一種單克隆抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及檢測識別分泌抗原特異抗體的單個(gè)B細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和PCR的方法擴(kuò)增出抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)同源重組構(gòu)建于包含恒定區(qū)基因的載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備單克隆抗體。
背景技術(shù)：
抗體是機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞合成、分泌所產(chǎn)生，能夠與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白，是介導(dǎo)體液免疫重要的免疫效應(yīng)分子?？贵w具有中和病毒、激活補(bǔ)體系統(tǒng)、介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性包括抗體的調(diào)理與抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒等作用，是機(jī)體抵抗外來病原體入侵的重要機(jī)制。抗體單體分子是由兩條相同、相對分子量較大的重鏈和兩條相同、相對分子量較小的輕鏈，四條多肽鏈通過二硫鍵連接和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成，呈“Y”字形結(jié)構(gòu)。每條重鏈、輕鏈由可變區(qū)與恒定 區(qū)組成，抗體的可變區(qū)內(nèi)的核苷酸序列變化較大，是抗原決定簇的所在，抗體的L鏈可變區(qū)可分為C、V、J三部分，H鏈可分為C、V、D、J四個(gè)部分?？贵w的恒定區(qū)核苷酸序列相對保守，根據(jù)重鏈恒定區(qū)的不同，又抗體可分為IgM(P)UgG(Y)UgA(Q)UgD(S)和IgE ( ε )，其中IgG是目前應(yīng)用最廣泛的抗體類別。大多數(shù)抗原分子具有多個(gè)抗原表位，每一種表位均可刺激機(jī)體一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體。傳統(tǒng)制備抗體的方法是將抗原免疫動(dòng)物制備出抗血清，再經(jīng)純化得到抗體。由于抗原刺激多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對不同抗原表位的多種抗體。因此，所獲得的抗體實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體(Polyclonal antibody, pAb)。由于這種抗體是針對多種抗原表位，特異性不高，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，其應(yīng)用也受到限制。1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler采用細(xì)胞雜交技術(shù)創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)(Monoclonal antibody),由此獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。該技術(shù)是將永生的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞在聚乙二醇作用下融合，形成雜交瘤細(xì)胞。融合后的雜交瘤細(xì)胞采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡，而未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和克隆增殖。由于不是所有的雜交瘤細(xì)胞是分泌特異性單克隆抗體，因此還需要篩選和克隆化。該方法制備單克隆抗體周期長、操作繁雜，雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)抗體產(chǎn)量低等缺點(diǎn)。Aishun Jin等人發(fā)明經(jīng)微孔芯片法擴(kuò)增人外周血抗原特異的B細(xì)胞抗體基因。該技術(shù)采用的硅微孔芯片的微孔直徑約20 μ m,高約20 μ m,剛好容納一個(gè)細(xì)胞，因此是單細(xì)胞芯片。該技術(shù)在微孔表面包被抗人二抗，捕獲B細(xì)胞分泌的抗體，加入生物化抗原、熒光素標(biāo)記的親和素孵育后，形成抗體-生物素化二抗-熒光素標(biāo)記的親和素復(fù)合物，分泌抗體陽性細(xì)胞孔在熒光顯微鏡呈現(xiàn)熒光信號。通過顯微操作，將單個(gè)細(xì)胞移至PCR管內(nèi)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，將基因克隆于含有恒定區(qū)的抗體表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)抗體。該技術(shù)具有高通量、操作快速的特點(diǎn)，能夠在兩周內(nèi)完成單克隆抗體的制備，但該技術(shù)中的微孔芯片制備及芯片檢測信號的讀取需要專門的儀器，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用及條件要求高不能為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的制備單克隆抗體方法，能夠以較高通量、較低成本、快速制備出單克隆抗體，該方法由五個(gè)步驟組成，(a)動(dòng)物免疫；(b)有限稀釋免疫動(dòng)物血液細(xì)胞，置細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中培養(yǎng)，每孔一個(gè)淋巴細(xì)胞；(C)使用固相化抗原載體篩選出分泌特異抗體的靶淋巴B細(xì)胞；(d)采用抗體可變區(qū)引物組合，通過反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)和核苷酸聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到抗體可變區(qū)序列；(e)將抗體可變區(qū)序列克隆到包含恒定區(qū)基因的抗體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞制備單克隆抗體抗體。本發(fā)明提供了一種方法，通過有限稀釋法將單個(gè)B細(xì)胞分布于細(xì)胞培養(yǎng)微孔板內(nèi)，于微孔內(nèi)加入包被特異抗原的磁顆粒以捕獲分泌的抗體，通過磁力吸引將磁顆粒從細(xì)胞培養(yǎng)板中分離轉(zhuǎn)入另一微球檢測微孔板對應(yīng)孔內(nèi)，加入生物素化二抗、親和素化HRP及 化學(xué)發(fā)光底物，檢測化學(xué)發(fā)光信號，確定陽性信號的B細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增抗原特異的抗體基因。本發(fā)明不同于Aishun Jin等人的微孔芯片法在于，該技術(shù)制備了僅能容納一個(gè)細(xì)胞的固相化抗原微孔芯片，進(jìn)行后面反應(yīng)時(shí)要小心避免懸浮生長的B細(xì)胞跑掉，在獲取目的細(xì)胞時(shí)要采用顯微操作，這不能為一般實(shí)驗(yàn)室所使用，而本發(fā)明采用固相化抗原磁顆粒球在細(xì)胞周圍形成包裹層，通過磁力分離培養(yǎng)細(xì)胞和磁顆粒球，使操作在宏觀下進(jìn)行成為可能。本發(fā)明提供了一種方法，是將抗原經(jīng)共價(jià)鍵固定于磁顆粒表面，磁顆粒表面活性基團(tuán)可為氨基、羧基、環(huán)氧基及巰基，直徑范圍為1-10 μ m,優(yōu)選直徑為2. 0-5. Oym0磁顆粒是由各種含活性功能基團(tuán)的有機(jī)高分子材料與無機(jī)磁性物質(zhì)復(fù)合制備而成的，目前使用最多的是F e20 3，外面包裹的高分子材料為聚苯乙烯，活化的磁顆粒表面帶有氨基、羧基、環(huán)氧基、甲苯磺?；?、巰基、羥基等，已被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測。本發(fā)明對磁顆粒的封閉液進(jìn)行了優(yōu)化，組分為O. 02M PH 7. 4PBS I % BSA-V I % Triton X-100。此外對包涵體復(fù)性蛋白標(biāo)記條件進(jìn)行了優(yōu)化，包涵體用6M鹽酸胍、I % SDS溶解后可進(jìn)行環(huán)氧基磁顆粒的標(biāo)記。本發(fā)明提供了一種方法，是通過有限稀釋法將單個(gè)B細(xì)胞分布于細(xì)胞培養(yǎng)微孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的微孔體積為O. 1-2 μ I。研究表明，一個(gè)人抗體分泌細(xì)胞(ASC) —天可以分泌的Ipg抗體，而工業(yè)化生產(chǎn)細(xì)胞PER. C6細(xì)胞一天最高可以分泌10pg。為了提高檢測檢測靈敏度，本發(fā)明對生物素二抗、親和素化過氧化物酶或堿性磷酸酶的酶聯(lián)免疫系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，檢測靈敏度達(dá)fg水平。本發(fā)明對微孔體積、磁顆粒進(jìn)行了優(yōu)化，較佳的微孔體積在O. 1-2 μ 1，每孔加入磁顆粒微球數(shù)目為40-200個(gè)，優(yōu)選的磁顆粒微球直徑為 2. 8-4. 5 μ m。本發(fā)明對擴(kuò)增兔抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)的RT-PCR、PCR引物及組合進(jìn)行了優(yōu)化，抗體重鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)，序列如SEQ ID NO :1，第一次PCR上游引物序列如SEQ IDNO :2-3，下游引物序列如SEQ ID NO :4，Nest PCR上游引物序列如SEQ ID N0:5_ll，下游引物序列如SEQ ID N0:12?？贵wK輕鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)，序列如SEQ ID N0:13，第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO: 14，下游引物序列如SEQ ID NO 15, Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO :16，下游引物序列如SEQ ID NO :17。抗體λ輕鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)，序列如SEQ ID NO : 18，第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO : 19，下游引物序列如SEQIDNO 20, Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO :21，下游引物序列如SEQ ID NO :22。這些上述抗體基因擴(kuò)增引物也可重新組合后進(jìn)行抗體基因的擴(kuò)增，如重鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)第一次PCR下游引物為RT引物，Nest PCR下游引物為第二次PCR的下游引物。本發(fā)明采用Infusion同源重組技術(shù)將抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)重組至抗體表達(dá)載體如Invivogen公司的 pFUSE2-CLIg-rkl、pFUSE2_CLIg_rK2 與 pFUSE-CHIg-rG 或者是包含抗體 leader 和FC基因的腺病毒、慢性毒載體，相比傳統(tǒng)內(nèi)切酶方法聯(lián)接提高連接效率。本發(fā)明提供單克隆抗體制備方法，抗原特異B細(xì)胞來源可是經(jīng)抗原致敏的任何部位的B細(xì)胞包括脾與外周血淋巴細(xì)胞。本發(fā)明提供的方法可用于單克隆抗體基因的擴(kuò)增和抗體制備


圖I是通量擴(kuò)增抗原特異的單B細(xì)胞抗體基因技術(shù)流程。圖2是細(xì)胞微孔培養(yǎng)板和檢測板示意圖。圖3是磁顆粒分離示意4是磁顆粒-微孔化學(xué)放光法測定兔單B細(xì)胞分泌的抗體。實(shí)施方式具體實(shí)施例I抗原致敏的兔淋巴B細(xì)胞制備將純化后的hbub3蛋白溶解在1XPBS，取適量的蛋白溶液與弗氏完全佐劑(Sigma)混勻乳化，取體重2Kg的新西蘭大耳白兔，背部皮下多點(diǎn)注射抗原。3周后，取適量的蛋白溶液與弗氏不完全佐劑(Sigma)混勻乳化，在大耳白兔的背部皮下，進(jìn)行第二次免疫，隔3周，進(jìn)行第三免疫，免疫后3-7天，取外周血淋巴細(xì)胞。具體實(shí)施例2抗體分泌陽性細(xì)胞的篩選(I)抗原偶聯(lián)取3mg直徑為2. 8 μ m表面為環(huán)氧基基團(tuán)的磁顆粒干粉(Dynabeads M_270Epoxy,Invitrogen公司)，加入200 μ I的O. IM PB, pH 7. 4，震蕩混懸后靜止10分鐘，置磁力架上2min聚集磁顆粒，去液體，重復(fù)洗2次加入。取60 μ I體積Img hbub3抗原(可溶性抗原溶解于PB，包涵體于SDS中復(fù)溶，SDS終濃度為I % )，加入60 μ I O. IM PB, pH 7. 4懸浮的磁顆粒，震蕩混勻。再向管內(nèi)加入60μ1 3Μ(MM)2SO4(溶于O. IM PB, pH 7. 4)，混勻，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)37°C 20h。反應(yīng)完畢后，置磁力架上4min，分離磁顆粒，用O. 1% BSAPBS洗兩次。(2)抗體檢測取外周血淋巴細(xì)胞與磁顆粒混勻，記數(shù)后稀釋至O. 9個(gè)細(xì)胞/10個(gè)磁顆粒/I μ 1，I U I/孔于1536細(xì)胞培養(yǎng)板微孔內(nèi)培養(yǎng)3小時(shí),磁顆粒通過磁力器吸至化學(xué)發(fā)光微孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)板凍存于_80°C。向化學(xué)發(fā)光微孔板內(nèi)加入6μ I 100ng/ml生物素化山羊抗兔二抗(0.02M PH 7. 4PBS1% BSA-V 1% Triton X-100)，室溫 lh，再加入洗滌液(O. 02M PH7. 4PBS, 1% Triton X-100)，洗滌 3 次，加入 6 μ 1100ng/ml 親和素-HRP (0. 02M PH 7. 4PBSI % BSA-V 1% Triton X-100)，室溫 30min，再加入洗滌液(0. 02M PH 7. 4PBS, 1% TritonX-100)，洗滌3次。加入6 μ I化學(xué)發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光儀讀值。RLU值為陰性對照孔RLU值的2. I倍為陽性。具體實(shí)施例3抗體可變區(qū)基因擴(kuò)增將細(xì)胞培養(yǎng)板從_80°C移至室溫(以下操作按RNA操作進(jìn)行)，將陽性孔內(nèi)細(xì)胞裂解液移至RT-PCR管內(nèi)，加入O. 5μ I RNasin0以位于抗體恒定區(qū)的引物作為特異引物，采用SuperScript III First-Strand Synthesis (Invitrogen 公司)合成抗體重鏈、輕鏈 CDNA。以上為位5’端Leader及FRI區(qū)的引物為上游引物，以位于抗體恒定區(qū)的引物為下游引物進(jìn)行nest PCR擴(kuò)增出抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因。擴(kuò)增兔抗體重鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)，序列如SEQ ID NO :1，第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO :2_3，下游引物序列如SEQIDNO :4，Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO :5_11，下游引物序列如SEQ ID NO 120抗體K輕鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)，序列如SEQ ID NO : 13，第一次PCR上游引物序列如SEQIDNO : 14，下游引物序列如SEQ ID NO :15，Nest PCR上游引物序列如SEQ ID N0:16，下游引物序列如SEQ ID NO 17o抗體λ輕鏈RT引物位于抗體恒定區(qū)，序列如SEQ ID Ν0:18，第 一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO :19，下游引物序列如SEQ ID NO :20，Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO :21，下游引物序列如SEQ ID NO :22。具體實(shí)施例4抗體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)(I)抗體表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴(kuò)增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因片段，通過clonetch公司Infusion重組技術(shù)連接到抗體表達(dá)質(zhì)粒上如Invivogen公司的pFUSE2_CLIg_rkl、pFUSE2_CLIg-rK2與pFUSE-CHIg-rG或者是包含抗體leader和FC基因的腺病毒、慢性毒載體。(2)轉(zhuǎn)染、永生化篩選利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 (Invitrogen),將構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。5小時(shí)后加入含10% FBS培養(yǎng)過夜，O. 5mg/mL G418，每周換兩次液，三周后亞克隆，培養(yǎng)一段時(shí)間后westerblot或ELISA檢測細(xì)胞分泌抗體IgG識別hbub3的特異性。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體制備方法，其特征在于該方法由六個(gè)步驟組成(a)動(dòng)物免疫；(b)有限稀釋免疫動(dòng)物血液細(xì)胞，置細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中培養(yǎng)，每孔一個(gè)淋巴細(xì)胞；(c)向細(xì)胞培養(yǎng)微孔中加入固相化抗原的磁顆粒微球，捕獲靶淋巴B細(xì)胞分泌的特異抗體；(d)磁力分離出磁顆粒微球，免疫熒光法或化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法檢測，確定陽性孔細(xì)胞；(e)單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)和核苷酸聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到抗體可變區(qū)序列；(f)抗體可變區(qū)序列克隆到抗體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)微孔板微孔的容積為O.Ol μ 1-100 μ 1，優(yōu)選微孔的容積為O. 05 μ 1-2 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁顆粒，其特征在于磁顆粒表面活性基團(tuán)可為氨基、羧基、環(huán)氧基、甲苯磺酰基及巰基中的任意一種，優(yōu)選為環(huán)氧基，抗原共價(jià)鍵固定于磁顆粒表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于通過磁力吸引將抗原固相化的磁顆粒吸引至另一微孔板對應(yīng)的微孔中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫熒光法方法，其特征在于采用生物素化二抗、熒光素標(biāo)記親和素的免疫熒光系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法，其特征在于采用了生物素二抗、親和素化過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兔抗體基因逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，其特征在于以位于抗體重鏈、輕鏈恒定區(qū)核苷酸序列的特異引物為RT-PCR引物，以位于5’端Leader及FRl區(qū)的引物為上游引物，以位于抗體恒定區(qū)的引物為下游引物進(jìn)行nest PCR擴(kuò)增出抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的兔抗體基因RT-PCR引物，其特征在于抗體重鏈RT引物序列如SEQ ID ΝΟ:1，抗體K輕鏈RT引物序列如SEQ ID NO:13，抗體λ輕鏈RT引物序列如SEQ IDNO 18ο
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物及組合，其特征在于抗體重鏈第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO :2-3，下游引物序列如SEQ ID NO 4,Nest PCR上游引物序列如SEQ ID NO :5-11，下游引物序列如SEQ ID NO :12。抗體κ輕鏈第一次PCR上游引物序列如SEQ ID NO :14，下游引物序列如SEQ ID NO :15，Nest PCR上游引物序列如SEQID NO :16，下游引物序列如SEQ ID NO :17?？贵wλ輕鏈第一次PCR上游引物序列如SEQID NO :19，下游引物序列如SEQ ID NO :20，Nest PCR上游引物序列如SEQ ID Ν0:21，下游引物序列如SEQ IDNO : 22。
10.一種高通量制備單克隆抗體的方法，其特征在于使用了權(quán)利要求I所述的基本方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單克隆抗體制備方法。該方法采用向淋巴B細(xì)胞培養(yǎng)微孔中加入固相化抗原的磁顆粒微球，磁力分離磁顆粒微球至對應(yīng)微孔板，免疫化學(xué)發(fā)光法或免疫熒光方法檢測出分泌特異抗體的單個(gè)B細(xì)胞，通過單細(xì)胞RT-PCR及巢式PCR的方法擴(kuò)增出抗體輕、重鏈可變區(qū)基因并重組至包含抗體恒定區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)單克隆抗體。
文檔編號C12N15/63GK102776200SQ201110119289
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者于軍, 馮杰, 王緒敏, 邵長君, 高靜 申請人:中國科學(xué)院北京基因組研究所, 舟山同生生物科技有限公司