專利名稱：提高藻類光合產(chǎn)氫效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及提高藻類光合產(chǎn)氫效率的方法。
背景技術(shù)：
有相當(dāng)一部分的藻類可通過光合作用產(chǎn)生氫氣，因此藻類作為一種能夠產(chǎn)生氫氣的生物被研究。當(dāng)產(chǎn)氫藻類在無氧狀態(tài)下培養(yǎng)一段時間后，其光合作用產(chǎn)生的氧氣被自身的呼吸作用消耗，低氧環(huán)境導(dǎo)致葉綠體基質(zhì)中的產(chǎn)氫酶被誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)氫酶接受來自電子傳遞鏈的電子將水光解產(chǎn)生的氫離子還原生成氫氣。通常，由于光合水解產(chǎn)生氧氣的速率高于呼吸作用消耗氧氣的速率，因此細(xì)胞中氧氣濃度較高，產(chǎn)氫酶活性受到抑制，往往使產(chǎn)氫藻類無法長時間保持產(chǎn)氫狀態(tài)。衣藻為產(chǎn)氫藻類中的一種。已有多個實(shí)驗(yàn)室通過各種方法降低細(xì)胞中氧氣濃度，提高產(chǎn)氫能力，其中包括提高衣藻呼吸速率、使用無硫的培養(yǎng)基和改造放氧復(fù)合體蛋白等。美國加州大學(xué)伯克利分校 的Melis教授發(fā)現(xiàn)硫元素的缺乏可以可逆的抑制光合放氧，但對呼吸速率影響極小。因此在密閉的缺硫培養(yǎng)環(huán)境中，衣藻的光合速率逐漸減低，當(dāng)光合速率小于呼吸速率時，導(dǎo)致培養(yǎng)液中氧氣凈消耗，最終氧氣濃度降到很低的水平。在無氧狀態(tài)下，氫酶基因被誘導(dǎo)表達(dá)，衣藻細(xì)胞產(chǎn)生氫氣。現(xiàn)在衣藻光合產(chǎn)氫最高效的方法是兩步法光合產(chǎn)氫，即第一步在正常條件下生長到較高的細(xì)胞密度，第二步在缺硫無氧培養(yǎng)條件下，進(jìn)行光合產(chǎn)氫，每升藻液每小時產(chǎn)氧 2-2. 5 毫升，最長可持續(xù) 70 小時(Melis, A. (2007). Photosynthetic H2 metabolismin Chlamydomonas reinhardtii (unicellular green algae). Planta 226,1075-1086;Melis, A. , Zhang, L. , Forestier, M. , Ghirardi, M. L. , and Seibert, M. (2000). Sustainedphotobiological hydrogengas production upon reversible inactivation of oxygenevolution in the greenalga Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol 122,127-136)。首先單細(xì)胞綠藻在硫元素、氧氣等生長因子都充分滿足的條件下進(jìn)行正常的光合作用，累積生物量，單細(xì)胞綠藻生長很快，在二氧化碳不成為限制因的飽和光強(qiáng)條件下，4至5天時間內(nèi)就能達(dá)到3-6X IO6個/ml，然后通過更換缺硫的培養(yǎng)基讓藻細(xì)胞處于缺硫的脅迫狀態(tài)，藻細(xì)胞對缺硫的脅迫響應(yīng)表現(xiàn)為改變其光合和細(xì)胞代謝途徑，積極迅速累積細(xì)胞內(nèi)的淀粉，在缺硫的最初24時內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)淀粉的含量提聞了 10倍。缺硫后光合放氧的能力呈準(zhǔn)指數(shù)下降，在缺硫后的最初15到20小時內(nèi)的一半時間點(diǎn)時，已經(jīng)下降到只有其原初正常速率的10% 了。相比而言，細(xì)胞呼吸活動在缺硫的限制條件下，依舊保持原來的穩(wěn)定狀態(tài)，很快光合的整個活動在缺硫24小時后就大大低于呼吸水平，進(jìn)而慢慢停止光合放氧，隨之封閉培養(yǎng)的藻細(xì)胞耗盡藻液內(nèi)的溶氧，即便在持續(xù)光照下，依舊只能是進(jìn)入了無氧狀態(tài)。氫酶于是在這種無氧的條件下被誘導(dǎo)出來，但是如果沒有光照，沒有PSI捕獲光能獲得的能量推動電子傳遞到氫酶，依舊不能產(chǎn)生氫氣，氫酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生只需無氧誘導(dǎo)，與光暗無關(guān)，但產(chǎn)氫卻是一個嚴(yán)格依賴光照的過程。在整個光合放氫過程中，衣藻細(xì)胞形態(tài)也有所變化，由橢圓形變成圓形，在產(chǎn)氫過程中，開初積累的淀粉和蛋白質(zhì)大量消耗，開始負(fù)起提供電子的任務(wù)(Happe等，1994)。NADPH氧化還原酶會將葉綠體內(nèi)的NADPH氧化成NADP+,而NADPH氧化還原酶將所得到的電子傳遞給電子傳遞鏈的光合系統(tǒng)I，繼續(xù)進(jìn)行光合磷酸化作用產(chǎn)生ATP。隨后電子仍會經(jīng)由電子傳遞鏈傳送至光合系統(tǒng)I。兩步法放氫的實(shí)質(zhì)就是巧妙利用PSII的損傷和修復(fù)循環(huán)的可逆阻抑，實(shí)現(xiàn)微藻放氫在時間上的分開，PSII的損傷和修復(fù)循環(huán)在整個光合作用過程中一直不斷運(yùn)轉(zhuǎn)，當(dāng)Dl蛋白修復(fù)的速率和損傷的速率相當(dāng)時，光合活性不會明顯下降，當(dāng)前者跟不上后者時，光合速率明顯下降。Dl蛋白受到損傷后，接著就會被蛋白酶分解掉，目前普遍公認(rèn)能存在兩種降解途徑，其中之一稱之為直接降解途徑，也就是Dl蛋白能夠直接被結(jié)合在膜上的蛋白酶降解，另一種則在Dl蛋白降解過程中形成了 Dl蛋白與其他組分的交聯(lián)產(chǎn)物，被稱之為交聯(lián)降解途徑。目前已經(jīng)證明在Dl蛋白降解的過程中，也伴隨著D2蛋白的降解，只不過其降解的程度較低而已。在損傷的Dl蛋白被降解后，需要合成新的Dl蛋白來代替它。Dl蛋白的合成是由葉綠體基因編碼的，在位于基質(zhì)中并與類囊體膜結(jié)合的70S核糖體上完成。缺硫時，含硫的重要氨基酸缺乏足夠構(gòu)成原料，Dl蛋白合成受阻，因而整個PSII的修復(fù)循環(huán)就逐漸停滯了，PSII的光化學(xué)活性 也就迅速喪失。顯然，缺硫在綠藻的整個生長過程中，扮演了代謝開關(guān)的角色，缺硫選擇性地、可逆地抑制了氧的產(chǎn)生，當(dāng)重新補(bǔ)加硫后，綠藻又開始正常的光合水解放氧、生物量累積的狀態(tài)。在既缺硫又缺氧的雙重脅迫下，綠藻進(jìn)入產(chǎn)氫狀態(tài)?？赡娴剡\(yùn)用有硫、無硫這個代謝開關(guān)，可以讓綠藻在產(chǎn)氫、產(chǎn)氧之間交替轉(zhuǎn)換，讓氫和氧在時間上分隔開來，但又不割斷，讓光合放氧、線粒體呼吸、中間代謝產(chǎn)物分解代謝、耦合氫酶的電子傳遞路徑這些光合放氫必須有的條件一一滿足。此時的放氫保持在放氧的基線水平，在缺硫100個小時后必須補(bǔ)加硫，其氫氣產(chǎn)量只有藻細(xì)胞光合能力的15%,也就是正常光合放氧能力的15%,這個相很低的放氫效率提示有一個限制因子在里面，現(xiàn)在還不清楚。但是這個速率已經(jīng)比黑暗中無氧誘導(dǎo)后光照排氧達(dá)到的放氫速率的兩倍了(Melis, A. , and Happe, T. (2001). HydrogenProduction. Green Algae as a Source of Energy. Plant Physiol. 127, 740-748 ;Melis,A. (2002). Green alga hydrogen production progress, challenges and prospects.International Journal of Hydrogen Energy 27,1217-1228)。衣藻光合產(chǎn)氫的瓶頸在于產(chǎn)氫速度和持續(xù)時間的矛盾上。衣藻在缺硫的培養(yǎng)基中生長，其光合系統(tǒng)II的Dl蛋白的代謝受到影響，光合作用受到抑制，可以降低氧氣濃度，但不可避免的會降低為產(chǎn)氫所需的氫離子和電子，導(dǎo)致不能長時間持續(xù)高效地產(chǎn)氫。雖然可以在產(chǎn)氫過程后期補(bǔ)充含硫培養(yǎng)基，恢復(fù)衣藻細(xì)胞正常的生長，重新釋放氧氣停止產(chǎn)氫，兩步法衣藻光合產(chǎn)氫需要重復(fù)缺硫和供硫培養(yǎng)的交替循環(huán)，更換培養(yǎng)基工藝復(fù)雜，需要額外消耗能量，增加了生產(chǎn)成本，還無法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。鑒于產(chǎn)氫酶是催化氫代謝的核心酶，科學(xué)家們已經(jīng)從包括衣藻在內(nèi)的多種生物中克隆了產(chǎn)氫酶基因，并進(jìn)行了研究。衣藻有兩個產(chǎn)氫酶-HydAl和HydA2，兩者間的氨基酸序列的相似性為68%，并與厭氧菌的產(chǎn)氫酶的催化結(jié)構(gòu)域高度保守(Marc Forestier, P. K.，Liping Zhang, Matthew Posewitz, Sarah Schwarzer, Thomas Happe, Maria L. Ghirardi,Michael Seibert，. (2003). Expression of two [Fe]-hydrogenases in Chlamydomonasreinhardtii under anaerobic conditions. European Journal of Biochemistry 270，2750-2758)。衣藻產(chǎn)氫酶對氧氣高度敏感，而氧氣又是光合作用主要的產(chǎn)物。如果用化學(xué)和物理的方法去除培養(yǎng)基中的氧氣，可以提高衣藻光合產(chǎn)氫效率，但大大增加了生產(chǎn)成本，得不償失。為了提高衣藻光合產(chǎn)氫的效率，研究人員的思路主要有以下幾種(1)利用隨機(jī)插入誘變的方法，篩選高效產(chǎn)氫的突變體并鑒定影響衣藻光合產(chǎn)氫的關(guān)鍵基因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)衣藻的淀粉異構(gòu)酶、產(chǎn)氫酶附屬蛋白、II型NADH脫氫酶和硫轉(zhuǎn)運(yùn)酶能影響衣藻光合產(chǎn)氫效率；(2)利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造產(chǎn)氫酶的氧耐受性，或?qū)⑵渌锓N的氧耐受性強(qiáng)的產(chǎn)氫酶轉(zhuǎn)入到衣藻中；(3)優(yōu)化衣藻的培養(yǎng)工藝，如兩步法培養(yǎng)、細(xì)胞固定化培養(yǎng)等，提高產(chǎn)氫效率。但是盡管在衣藻光合產(chǎn)氫的研究上有了很大進(jìn)展，還無法使衣藻光合產(chǎn)氫同時保持很高的效率和延長持續(xù)時間，較高的成本使得衣藻 光合產(chǎn)氫還無法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。綜上，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出切實(shí)有效的提高衣藻光合產(chǎn)氫能力的方法，以促進(jìn)衣藻光合產(chǎn)氫技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供提高藻類光合產(chǎn)氫效率的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種提高產(chǎn)氫藻類光合產(chǎn)氫效率的方法，所述方法包括在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)丙酮酸氧化酶(POX)。在另一優(yōu)選例中，在產(chǎn)氫藻類的葉綠體中表達(dá)丙酮酸氧化酶。在另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸氧化酶(POX)是外源的。在另一優(yōu)選例中，將丙酮酸氧化酶的編碼基因引入到產(chǎn)氫藻類的基因組中，從而在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)丙酮酸氧化酶。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(I)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包括丙酮酸氧化酶的編碼基因；(2)將⑴的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫藻類；(3)分離出包含有丙酮酸氧化酶的編碼基因的產(chǎn)氫藻類,該產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率提高。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體(較佳地，從5’至3’依次)含有以下元件葉綠體DNA的同源片段(cpDNA)，熱激啟動子，丙酮酸氧化酶的編碼基因。在另一優(yōu)選例中，還在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)過氧化氫酶(CAT)。在另一優(yōu)選例中，在產(chǎn)氫藻類的葉綠體中表達(dá)過氧化氫酶。在另一優(yōu)選例中，所述的過氧化氫酶是外源的。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(I)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包括丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因；(2)將(I)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫藻類；(3)分離出包含有丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因的產(chǎn)氫藻類，該產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率提高；附加條件是丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因位于同一表達(dá)載體或不同表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中,所述的表達(dá)載體是葉綠體表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體中，丙酮酸氧化酶的編碼基因和/或過氧化氫酶的編碼基因整合到藻類基因組中。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體中，丙酮酸氧化酶的編碼基因和/或過氧化氫酶的編碼基因由熱激啟動子啟動表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體還含有其它常規(guī)的元件，如終止子、抗性選擇基因等。在另一優(yōu)選例中，所述的熱激啟動子是HSP70A/RBSC2啟動子。在另一優(yōu)選例中，所述的各元件是操作性相連的。在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)氫藻類是藍(lán)藻和/或綠藻。在另一優(yōu)選例中，所述的藍(lán)藻選自(但不限于)魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena sp.),顫藍(lán)細(xì)菌(Oscillatoria sp.),絲狀藍(lán)細(xì)菌(Calothris sp.),聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcussp.)，黏桿藍(lán)細(xì)菌(Gloebacter sp.)，絲狀異形藍(lán)細(xì)菌(A. cylindrica)或多變魚腥藍(lán)細(xì)菌(A. variabilis);或所述的綠藻選自(但不限于)萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),斜生柵藻(Scenedesmus obliquus),綠球藻(Chlorococcum Iittorale)或亞心形扁藻(Playtmonas subcordiformis)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有葉綠體DNA的同源片段(cpDNA)，熱激啟動子，丙酮酸氧化酶的編碼基因和/或過氧化氫酶的編碼基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種產(chǎn)氫藻類，所述產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞內(nèi)包含丙酮酸氧化酶(POX)的編碼基因。 在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞內(nèi)還包含過氧化氫酶的編碼基因。在另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸氧化酶(POX)和/或過氧化氫酶(CAT)的編碼基因是外源的。在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞中包括所述的載體，或其基因組中整合有丙酮酸氧化酶的編碼基因；或其基因組中整合有丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)氫氣的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述的產(chǎn)氫藻類，從而產(chǎn)生氫氣。在另一優(yōu)選例中，采用熱激的方法處理所述的產(chǎn)氫藻類。在另一優(yōu)選例中，每隔6±2小時40±2°C熱激一次。在另一優(yōu)選例中，在低光(低于50 ii mol photons IrT2S4 ;較佳地低于40 u molphotons m_2s_1 30 u mo I photons m^V1或更低)下下培養(yǎng)所述的衣藻細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供丙酮酸氧化酶和/或過氧化氫酶或它們的編碼基因的用途，用于提高產(chǎn)氫藻類的產(chǎn)氫效率；或用于制備產(chǎn)氫效率提高的產(chǎn)氫藻類。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、用于衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pcg40_HPC的示意圖，其中各個組件分別是:cpDNA-1、cpDNA-2 :衣藻葉綠體DNA的同源片段；aadA :氨基葡萄糖苷腺苷轉(zhuǎn)移酶(Aminoglycoside 3’ -Adenyltransferase)基因；壯觀霉素抗性基因；HSP70A/RBCS2 :熱激啟動子序列；ecoPOX :大腸桿菌的丙酮酸氧化酶基因全長片段；7972CAT :集胞藻PCC7942的過氧化物酶基因全長片段；5’ psbB、3’ psbD :衣藻啟動子序列；3’ rbL :終止子序列； atpB ATP合成酶基因。圖2、用PCR和RT-PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因衣藻。(A)衣藻的連續(xù)熱激(HS)誘導(dǎo)示意圖，“方框(■) ”表示40°C熱激I小時，白色區(qū)段表不光照(低光，具體光強(qiáng)為75umol photons nT2s4)培養(yǎng),灰色區(qū)段表不黑暗培養(yǎng)。每一白色區(qū)段和灰色區(qū)段代表5小時。A，B，C表示三個不同的取樣時間點(diǎn)。(B)PCR 檢測的電泳結(jié)果。其中，Lane I cc503DNA ；Lane 2 ccHPC DNA ；Lane3 cc503cDNA(HS-A) ；Lane4ccHPC cDNA(HS-A) ；Lane5 cc503cDNA(HS-B) ；Lane6 ccHPCcDNA(HS-B) ;Lane7 :cc503cDNA(HS-C) ；Lane8 ccHPC cDNA(HS-C)。用看家基因 atpB(ATP合成酶基因)作為正對照。圖3、連續(xù)光照培養(yǎng)下野生型衣藻cc503和轉(zhuǎn)基因衣藻ccHPC的生長曲線，每隔6小時熱激一次。圖4、用氧電極檢測不同光強(qiáng)下野生型衣藻cc503和轉(zhuǎn)基因衣藻ccHPC的放氧速
率，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。圖5、暗處培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)氫后比較轉(zhuǎn)基因衣藻ccHPC和野生型衣藻cc503培養(yǎng)瓶中氧氣消耗(A和B)和氫氣產(chǎn)量(C和D)。A和C :在弱光(30limol photons IrT2S4)和黑暗交替下培養(yǎng)；B和D :在強(qiáng)光(lOOiimol photons mH和黑暗交替下培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，通過代謝工程技術(shù)改造產(chǎn)氫藻類的代謝過程，在不影響產(chǎn)氫藻類自身正常代謝和生長的情況下，在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶，有效地降低了產(chǎn)氫藻類細(xì)胞內(nèi)的氧濃度，降低了光呼吸作用，大大提高了產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率。本發(fā)明為提高光合產(chǎn)氫效率提供了新的途徑，為生物能源研究和產(chǎn)業(yè)化提供了新的思路。術(shù)語如本文所用，所述的“產(chǎn)氫藻類”是一類能夠光合產(chǎn)氫的藻類的總稱，各種產(chǎn)氫藻類細(xì)胞內(nèi)具有相同的產(chǎn)氫機(jī)制，且產(chǎn)氫的同時會產(chǎn)生氧。具體的產(chǎn)氫藻類包括(但不限于)藍(lán)藻和/或綠藻；例如魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena sp.),顫藍(lán)細(xì)菌(Oscillatoriasp.)，絲狀藍(lán)細(xì)菌(Calothris sp.),聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus sp.),黏桿藍(lán)細(xì)菌(Gloebacter sp.),絲狀異形藍(lán)細(xì)菌(A. cylindrica)或多變魚腥藍(lán)細(xì)菌(A. variabilis)；萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),斜生柵藻(Scenedesmus obliquus),綠球藻(Chlorococcum Iittorale)或亞心形扁藻(Playtmonas subcordiformis)等。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的產(chǎn)氫藻類是衣藻，其是一種單細(xì)胞的綠藻，是進(jìn)行光合作用研究的一種模式生物，其氫酶的產(chǎn)氫效率較高。如本文所用，所述的“產(chǎn)氫效率提高”是指與野生型的產(chǎn)氫藻類相比，本發(fā)明改良的產(chǎn)氫藻類的單位時間的產(chǎn)氫量顯著提高，如按照體積提高20%，較佳地提高40%，更佳地提高60 %，更佳地提高80 %或更高。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點(diǎn)。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。組織或器官特異型啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中。
如本文所用，所述的“可操作(性)地連接”或“操作性連接”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上?；驹肀景l(fā)明人在研究過程中，考慮到氧氣既是光合作用的產(chǎn)物，又是光呼吸和呼吸作用的底物，同時細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度同細(xì)胞自身能量代謝和物質(zhì)代謝也密切相關(guān)，而且有氧代謝和無氧代謝有很大差異；因此將研究重點(diǎn)放在影響產(chǎn)氫藻類光合產(chǎn)氫的關(guān)鍵點(diǎn)——氧氣濃度上，即通過工程改造，降低細(xì)胞中有效氧氣濃度，提高產(chǎn)氫酶的活性，同時降低光化學(xué)，進(jìn)而提高產(chǎn)氫效率。具體地說，本發(fā)明所基于的原理是降低產(chǎn)氫藻類細(xì)胞中氧氣濃度，從而降低產(chǎn)氫藻類的光呼吸，提高二氧化碳的固定效率；同時解除氧氣對產(chǎn)氫酶的抑制作用。在以上理論基礎(chǔ)上，難點(diǎn)在于找到合適的既可降低氧氣濃度又不影響產(chǎn)氫藻類自身生長和代謝的材料或方法。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和反復(fù)的試驗(yàn)，最終找到了合適的代謝工程改造方法，在產(chǎn)氫藻類(特別是其葉綠體)中表達(dá)丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶，有效地降低了產(chǎn)氫藻類細(xì)胞內(nèi)的氧濃度，降低了光呼吸作用，大大提高了產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率。丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶丙酮酸氧化酶(POX)為一種存在于原核生物(如大腸桿菌、鏈霉菌、乳酸菌等)中的蛋白，能催化丙酮酸氧化生成乙酰磷酸，是進(jìn)行有氧呼吸的關(guān)鍵酶，POX催化的反應(yīng)可以消耗大量的氧氣，從而有效地降低產(chǎn)氫藻類在產(chǎn)氫過程中的氧濃度。所述的丙酮酸氧化酶的氨基酸序列是本領(lǐng)域人員已知的，例如可以如GenBank登錄號CAA27725. I所示；丙酮酸氧化酶的編碼基因的序列例如可以如GenBank登錄號X04105. I 所示。由于丙酮酸氧化酶催化的反應(yīng)的產(chǎn)物中有過氧化氫(H2O2)，過氧化氫是強(qiáng)氧化劑，對細(xì)胞有毒害作用，由于產(chǎn)氫藻類基因組有過氧化氫酶基因，內(nèi)源表達(dá)的過氧化氫酶可以消除過氧化氫對細(xì)胞的傷害作用，可以在產(chǎn)氫藻類中只表達(dá)丙酮酸氧化酶。較佳的，本發(fā)明人在產(chǎn)氫藻類中還同時引入了外源過氧化氫酶(Catalase，CAT)，以高效地將細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫分解。所述的過氧化氫酶的氨基酸序列是本領(lǐng)域人員已知的，例如可以如GenBank登錄號BAA09601. I所示；過氧化氫酶的編碼基因的序列例如可以如GenBank登錄號D61378. I所示。保留了丙酮酸氧化酶或過氧化氫酶功能的上述蛋白變異形式也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的丙酮酸氧化酶可選自(a) GenBank登錄號CAA27725. I所示序列的蛋白；或(b)在
(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有丙酮酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白。本發(fā)明的過氧化氫酶可選自(a’)GenBank登錄號BAA09601. I所示序列的蛋白；或(b’)在(a’)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有過氧化氫酶活性的由(a’ )衍生的蛋白所述變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能，例如本發(fā)明的丙酮酸氧化酶或過氧化氫酶可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有活性。丙酮酸氧化酶的編碼基因的序列還包括與GenBank登錄號X04105. I限定的序列簡并的序列；以及在嚴(yán)格條件下與GenBank登錄號X04105. I限定的序列雜交的分子。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指(I)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC,0. 1% SDS, 600C ;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或⑶僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時才發(fā)生雜交。過氧化氫酶的編碼基因的序列還包括與GenBank登錄號D61378. I限定的序列簡并的序列；以及在嚴(yán)格條件下與GenBank登錄號D61378. I限定的序列雜交的分子。丙酮酸氧化酶或過氧化氫酶的編碼基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。應(yīng)理解，本發(fā)明的丙酮酸氧化酶的編碼基因優(yōu)選來源于大腸桿菌，來源于其它原核生物的丙酮酸氧化酶的編碼基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。本發(fā)明的過氧化氫酶的編碼基因優(yōu)選來源于藻類(如聚球藻)，來源于其它生物(如原核生物)的過氧化氫酶的編碼基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。構(gòu)建物和宿主本發(fā)明提供了一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括丙酮酸氧化酶和/或過氧化氫酶的表達(dá)盒。所述的表達(dá)盒具備基因表達(dá)所需的所有元件(包括啟動子、編碼DNA以及終止子等)，從而可完整地表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。丙酮酸氧化酶的表達(dá)盒及過氧化氫酶的表達(dá)盒可以位于同一構(gòu)建物上，也可以位于不同的構(gòu)建物上。較佳地，所述的丙酮酸氧化酶及過氧化氫酶的表達(dá)盒位于同一構(gòu)建物上以簡化轉(zhuǎn)化細(xì)胞的操作。通常，所述的構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還可包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達(dá)載體是葉綠體表達(dá)載體。更優(yōu)選地，所述的表達(dá)載體中，丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因由熱激啟動子啟動表達(dá)。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，所述的重組載體是藻類葉綠體表達(dá)載體pcg40。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達(dá)載體從5’至3’依次含有以下元件葉綠體DNA的同源片段(cpDNA)，熱激啟動子，丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因。所述的各元件是操作性相連的。更優(yōu)選地，所述的熱激啟動子是HSP70A/RBSC2啟動子。包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫藻類細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫藻類可使用基因槍轉(zhuǎn)化等方法。其中，可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實(shí)施以上的方法。本發(fā)明還包括利用前述方法獲得的重組的產(chǎn)氫藻類，所述的產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞中包含丙酮酸氧化酶的編碼基因，較佳的，產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞的基因組中同時包含丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的產(chǎn)氫藻類細(xì)胞中包括以上所構(gòu)建的載體，或其基因組中整合有熱激啟動子，丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因。高產(chǎn)氫氣的方法本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)氫氣的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)氫藻類(基因組中包含丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因)，從而產(chǎn)生氫氣。本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)氫藻類(轉(zhuǎn)化的產(chǎn)氫藻類)可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，在不改變細(xì)胞自身生長和代謝的情況下表達(dá)丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)氫藻類所用的培養(yǎng)基可以是現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的藻類培養(yǎng)基。在適于藻類細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。本發(fā)明人還優(yōu)化了培養(yǎng)所述產(chǎn)氫藻類的一些條件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在密閉環(huán)境下培養(yǎng)所述的產(chǎn)氫藻類。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式，在低光(低于50iimolphotons IrT2S-1 ;較佳地低于 40 u mo I photons nT2s-1 ;如 30 u molphotons nT2s-1 或更低)下培養(yǎng)所述的產(chǎn)氫藻類。此外，本發(fā)明人還優(yōu)化了培養(yǎng)所述產(chǎn)氫藻類的其它條件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的藻類基因組中整合有熱激啟動子，該啟動子啟動丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因的表達(dá)。基于上述構(gòu)建的產(chǎn)氫藻類，米用每隔6±2小時40±2°C熱激一次的方法處理，可大大地提高其產(chǎn)氫效率。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(I)本發(fā)明將丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因引入產(chǎn)氫藻類葉綠體中，在不影響產(chǎn)氫藻類自身正常代謝和生長的情況下，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫藻類的耗氧速率和氫氣產(chǎn)量都大大提高。(2)探索了一條新的思路，在產(chǎn)氫藻類的中引入了可以消耗氧氣的丙酮酸氧化酶，避免了現(xiàn)有技術(shù)中缺硫培養(yǎng)對產(chǎn)氫藻類光合產(chǎn)氫的抑制效果。(3)本發(fā)明有效地提高了產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率，為大規(guī)模產(chǎn)氫藻類光合產(chǎn)氫探索了一條新的途徑，也為生物能源研究和產(chǎn)業(yè)化提供了新的途徑和思路。 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法I、藻種萊茵衣藻，Chlamydomonas reinhardtii, cc503,購自美國杜克大學(xué)藻種中心。2、衣藻培養(yǎng)(I)培養(yǎng)基為 TAP(Tris-Acetate-Phosphate)培養(yǎng)基，配方來自 Gorman, D. S. , andR. P. Levine (1965)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54，1665-1669。這是使用最廣泛的衣藻培養(yǎng)基。首先配制如下母液鹽
權(quán)利要求
1.一種提高產(chǎn)氫藻類光合產(chǎn)氫效率的方法，其特征在于，所述方法包括在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)丙酮酸氧化酶。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，將丙酮酸氧化酶的編碼基因引入到產(chǎn)氫藻類的基因組中，從而在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)丙酮酸氧化酶。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包括丙酮酸氧化酶的編碼基因； (2)將(I)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫藻類； (3)分離出包含有丙酮酸氧化酶的編碼基因的產(chǎn)氫藻類，該產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率提聞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有以下元件葉綠體DNA的同源片段，熱激啟動子，丙酮酸氧化酶的編碼基因。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)過氧化氫酶。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包括丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因； (2)將(I)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫藻類； (3)分離出包含有丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因的產(chǎn)氫藻類，該產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率提高； 附加條件是丙酮酸氧化酶的編碼基因和過氧化氫酶的編碼基因位于同一表達(dá)載體或不同表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的產(chǎn)氫藻類是藍(lán)藻和/或綠藻。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的藍(lán)藻選自魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaenasp.),顫藍(lán)細(xì)菌(Oscillatoria sp.)，絲狀藍(lán)細(xì)菌(Calothris sp.)，聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus sp.)，黏桿藍(lán)細(xì)菌(Gloebacter sp.)，絲狀異形藍(lán)細(xì)菌(A. cylindrica)或多變魚腥藍(lán)細(xì)菌(A. variabilis);或 所述的綠藻選自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),斜生柵藻(ScenedesmusobIiquus),綠球藻(Chlorococcum Iittorale)或亞心形扁藻(Playtmonassubcordiformis)。
9.一種表達(dá)載體,其特征在于,所述表達(dá)載體含有葉綠體DNA的同源片段，熱激啟動子，丙酮酸氧化酶的編碼基因和/或過氧化氫酶的編碼基因。
10.一種產(chǎn)氫藻類，其特征在于，所述產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞內(nèi)包含丙酮酸氧化酶的編碼基因。
11.如權(quán)利要求10所述的產(chǎn)氫藻類，其特征在于，所述產(chǎn)氫藻類的細(xì)胞內(nèi)還包含過氧化氫酶的編碼基因。
12.—種生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于，所述方法包括 培養(yǎng)權(quán)利要求10或11所述的產(chǎn)氫藻類,從而產(chǎn)生氫氣。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，采用熱激的方法處理所述的產(chǎn)氫藻類。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，在低光下下培養(yǎng)所述的衣藻細(xì)胞。
15.丙酮酸氧化酶和/或過氧化氫酶或它們的編碼基因的用途，用于提高產(chǎn)氫藻類的產(chǎn)氫效 率；或用于制備產(chǎn)氫效率提高的產(chǎn)氫藻類。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高藻類光合產(chǎn)氫效率的方法。本發(fā)明在不影響產(chǎn)氫藻類自身正常代謝和生長的情況下，在產(chǎn)氫藻類中表達(dá)丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶，有效地降低了產(chǎn)氫藻類細(xì)胞內(nèi)的氧濃度，降低了光呼吸作用，大大提高了產(chǎn)氫藻類的光合產(chǎn)氫效率。本發(fā)明為提高光合產(chǎn)氫效率提供了新的途徑，為生物能源研究和產(chǎn)業(yè)化提供了新思路。
文檔編號C12P3/00GK102776221SQ20111012026
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者孫宇靜, 徐福橋, 朱新廣 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院