專利名稱：甘藍(lán)型油菜BnPABP3啟動子的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種甘藍(lán)型油菜&1PABP3啟動子(命名為PBnPABP3，以下相同)，同時(shí)還涉及一種甘藍(lán)型油菜&1PABP3啟動子的制備方法。 本發(fā)明還涉及含有該啟動子或其同源核苷酸序列的載體和涉及利用該啟動子在油菜及其它植物基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物啟動子在基因的表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用?；虮磉_(dá)調(diào)控是多種因素綜合作用的結(jié)果。一般按照一個(gè)事件的先后順序，基因的調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控以及蛋白質(zhì)加工水平調(diào)控等?；蚓幋a的蛋白質(zhì)和RNA及其次級代謝產(chǎn)物對于維持生物體的整個(gè)生命活動極其重要。任何基因表達(dá)調(diào)控的錯誤都會對生命造成嚴(yán)重后果。因此，對于基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理研究一直是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控最為重要。啟動子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要組成部分。在某種程度上，啟動子決定了基因表達(dá)的時(shí)空順序以及表達(dá)強(qiáng)度。所以，研究啟動子的功能序列對于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及日漸成熟的植物基因工程具有非常重要的意義。啟動子在構(gòu)建能夠高水平表達(dá)異源表達(dá)載體的過程中起到關(guān)鍵作用，它決定了外源基因的轉(zhuǎn)錄效率和基因的表達(dá)水平。植物轉(zhuǎn)基因育種所用的啟動子可分為組成型和特異型兩類。組成型啟動子驅(qū)動的外源基因在轉(zhuǎn)基因植株的所有發(fā)育時(shí)期和組織中穩(wěn)定表達(dá)。對許多雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，通常都使用含花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子或胭脂氨酸合成酶nos啟動子的質(zhì)粒載體，而在單子葉植物轉(zhuǎn)化中最常用的是含有水稻肌動蛋白Act啟動子，玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子的質(zhì)粒載體(關(guān)麗英等，轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的有效表達(dá)及其安全評價(jià)。首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)。2002,23( :52-56)。但是很多時(shí)候外源基因在受體植物中的持續(xù)高效表達(dá)不僅造成生物體內(nèi)能源的浪費(fèi)，而且在所有組織中的表達(dá)有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉(zhuǎn)基因安全問題(Jia S-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced of Bioengineer. 1997,17(6) :37-42 ；Morris S H,Adley C. C. Irish public perceptions and attitudes to modern biotechnology :an overview with a focus on GM foods. Trends in Biotechnology, 2001,19(2) :43-48)。因此，誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子的研究和應(yīng)用日益受到育種工作者的重視。在轉(zhuǎn)基因植物中鑒定的誘導(dǎo)型啟動子包括熱激啟動子，來源于菠菜硝酸還原酶的誘導(dǎo)型啟動子等(關(guān)麗英等，轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的有效表達(dá)及其安全評價(jià)。首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)。2002,23( :52-56)。但是誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用也具有一定限制，對受體植物進(jìn)行的外在條件處理，如熱激，激素處理等可能引起生物體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)而不利于植株的正常生長。而且化學(xué)調(diào)控系統(tǒng)中用作誘導(dǎo)物的甲基脫S皮質(zhì)醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)禾口四環(huán)素(tetracycline)者β對生態(tài)環(huán)境有害，不宜用于生產(chǎn)實(shí)踐。而使用植物體內(nèi)本身的組織特異性啟動子就可以避免這種問題。顯然，外源基因的組織特異性表達(dá)必將有效提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。近年來在這方面已經(jīng)取得很大成就。在不同組織中特異性表達(dá)的各類啟動子已不斷得到研究(宋揚(yáng)等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術(shù)通報(bào)。2007，(4) :21-24).油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計(jì)民生具有重要影響。 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)基因油菜必然會面臨轉(zhuǎn)基因安全風(fēng)險(xiǎn)的輿論。用在油菜種子中完全不表達(dá)的啟動子來啟動目的基因的表達(dá)是解決這個(gè)問題的一個(gè)可行方法。達(dá)到既提高油菜各方面品質(zhì)，又不引起食用油安全風(fēng)險(xiǎn)的目的。因此，本發(fā)明開發(fā)了一個(gè)甘藍(lán)型油菜內(nèi)源啟動子。通過熒光定量PCR檢測表明該啟動子驅(qū)動的內(nèi)源基因在植株的根、莖、葉片、花蕾、角果中高量表達(dá)。通過檢測報(bào)告基因 ⑶S的表達(dá)特征證明啟動子驅(qū)動的基因在根部、莖部、葉片、花蕾以及角果皮中高量表達(dá)而種子中不表達(dá)。我們的結(jié)果預(yù)示著該基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜PBnPABP3啟動子，該啟動子的時(shí)空表達(dá)模式可用于研究基因的表達(dá)形式，優(yōu)點(diǎn)在于，來源于植物內(nèi)源的組織特異性啟動子能夠精確定位所調(diào)控的基因，驅(qū)動目的基因在轉(zhuǎn)基因植物的特定組織或時(shí)期表達(dá)，避免造成植物自身能源和物質(zhì)的浪費(fèi)，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)效率，限制其表達(dá)部位?？蓱?yīng)用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全轉(zhuǎn)基因研究。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜Pbhpabp3啟動子的制備方法。該方法通過對甘藍(lán)型油菜基因組進(jìn)行基因組步移，獲得甘藍(lán)型油菜？__3序列。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種含有植物高效表達(dá)啟動子的重組載體，其含有所述的啟動子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的標(biāo)記基因 GUS表達(dá)強(qiáng)度高，容易檢測。通過這個(gè)載體轉(zhuǎn)化擬南芥可以獲得GUS基因在植物中高效表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜PBnPABP3啟動子在花藥、花粉粒中的應(yīng)用。Pbhpabp3的功能能夠反映油菜&1PABP3基因的功能，即在發(fā)育過程中具有重要功能；在該啟動子的驅(qū)動下，目的基因主要在植株的花藥、花粉粒中精細(xì)表達(dá)，而種子中完全不表達(dá)。這一具有組織特異性表達(dá)的啟動子在植物創(chuàng)建不育系、人工創(chuàng)建種質(zhì)資源等基因工程和轉(zhuǎn)基因安全(食用、花粉漂流)中具有應(yīng)用價(jià)值。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對油菜發(fā)育過程中的相關(guān)基因進(jìn)行了深入和全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種新的啟動子。該啟動子驅(qū)動的內(nèi)源基因在植物的花藥、花粉粒中高效表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，上述目的可以通過提供一種啟動子來實(shí)現(xiàn)，所述啟動子能夠特異性驅(qū)動基因在植物中高效表達(dá)，所述啟動子含有SEQ ID No. 1核苷酸序列或與SEQ ID No. 1實(shí)質(zhì)上同源的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供含有所述啟動子的核苷酸序列的重組載體來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的微生物來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供用所述微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物來實(shí)現(xiàn)。1、一種甘藍(lán)型油菜啟動子PBnPABP3的制備方法，其步驟是1. 1ΡΒηΡΑΒΡ3驅(qū)動的內(nèi)源基因的表達(dá)模式本發(fā)明所用油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)。供試材料播種于大田，正常
田間管理。從大田生長條件下生長的植株上取根、莖、葉、花蕾，角果每種材料至少取三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。利用Trirol 提取試劑盒的要求進(jìn)行RNA的提取。熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler (博奧生物有限公司)，采用油菜Actin作為內(nèi)標(biāo)基因(登錄號 AFl 11812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 和 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘。PBnPABP3 驅(qū)動的內(nèi)源基因引物為 5 ‘ -GGGAAGATGATAGGAAGGAAA-3'和 5 ‘ -CTGGTGCTCTAATCTGTGAAAA-3‘。熒光定量PCR反應(yīng)每組實(shí)驗(yàn)均完成三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少做三次技術(shù)重復(fù)。分別檢測？__3驅(qū)動的內(nèi)源基因在油菜組織(根、莖、葉、花、角果)中的表達(dá)。用比較Ct法(Δ Δ Ct)計(jì)算基因的相對表達(dá)量。通過2_Δ 估算目的基因的相對表達(dá)量禾口系統(tǒng)誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2_Δ ΔcTMethod. METHODS 25,402-408)。在計(jì)算相對表達(dá)量時(shí)，以花蕾的樣本為參照，即將其值轉(zhuǎn)換成1 (標(biāo)準(zhǔn)值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達(dá)值。1. 2基因組步移克隆PBnPABP3序列利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社)提取基因組DNA，按照基因組步移試劑盒(購自Clontech公司，產(chǎn)品代號Cat. No. 638904)操作程序，進(jìn)行基因組步移。具體步驟為提取基因組DNA 25口1^0.1“8/^0，分別用核酸內(nèi)切酶0儀I、EcoR V、PvuII和Mu I酶切，純化后加入接頭形成四個(gè)不同的基因組DNA庫，用作首次基因組步移第一輪PCR模板，根據(jù)目的基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物GSPl(表幻與基因組步移試劑盒(購自Clontech公司，產(chǎn)品代號Cat. No. 638904)內(nèi)上游接頭引物API (表幻進(jìn)行擴(kuò)增。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物的50倍稀釋液(水稀釋液)為模板，同樣方法設(shè)計(jì)的特異性引物63 2(表幻和接頭引物々 2(表幻進(jìn)行擴(kuò)增，隨后進(jìn)行第二輪基因組步移。所有PCR反應(yīng)均為50 μ L擴(kuò)增體系模板 1 μ L, dNTPs 0. 2mM,引物 0. 5mM, LATaq 酶 1. 25 單位，10XLA-PCMxiffer (含 MgCl2) 5 μ L，補(bǔ)水至 50 μ L。反應(yīng)條件均為94°C 預(yù)變性 Imin ;98°C 10s, 72 °C 6min 7 個(gè)循環(huán)；98°C 10s，67°C 6min 33個(gè)循環(huán)；72 °C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自TaKaRa公司，以下相同)，轉(zhuǎn)化gold菌株 (購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，酶切驗(yàn)證后測序，得到目的基因上游的側(cè)翼序列，此序列包括Pbhpabp3驅(qū)動的內(nèi)源基因的起始密碼子至 GSP2之間的區(qū)段和該基因的啟動子序列。根據(jù)獲得的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增啟動子區(qū)域片段的弓丨物 PBnFABp3S 5 ‘ -CAGAAGCTT (HindiII) AATTAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3 ‘和 PBnFABP3A 5' -GACATCTAGA(XbalI)GCTCGTGCGTTTACCTTTTTAGAGAA-3 ‘，以基因組 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。所有引物的5'端含有Hind III酶切位點(diǎn)，3'端含有)(ba I酶切位點(diǎn)。反應(yīng)體系為 25 μ L 內(nèi)含IXPCR buffer, MgCI 1. 5mmol/L，dNTPO. 2mmol/L(毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L, Pfu酶1. 5單位，模板約lOOng，根據(jù)具體情況設(shè)置循環(huán)參數(shù)。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.0% (質(zhì)量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠檢測，凝膠回收試劑盒回收各目的缺失片段。 按各回收的缺失片段載體(0.3pmol缺失片段0. Ipmol載體片段)=3 1的比例混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，1 X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至25ml，16°C過夜連接反應(yīng)。凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌gold菌(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，96-99)感受態(tài)細(xì)胞中。涂布于含有氨芐青霉素50 μ g/mL的 LB固體培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa 下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三個(gè)，做菌落PCR 檢測(反應(yīng)體系為 25 μ L 內(nèi)含=IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L〔毫摩爾每升〕、引物濃度為0. 5mol/L, Pfu酶1. 5單位，用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版， 根據(jù)具體情況設(shè)置循環(huán)參數(shù))，將陽性重組子接種于含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X 1041 下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)，37°C下200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社)提取質(zhì)粒，Hind IIIAba I 酶切質(zhì)粒lyg，0.8% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測正確的陽性重組克隆， 命名為pMD18-PBnPABP3(將目的片段連入pMDIS-T載體構(gòu)建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，以 Ml3F/M13R 為引物(Ml3 F5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，； M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，)，將 pMD18-PBnFABP3 進(jìn)行序列測定，分析結(jié)果，獲得了 PBnFABP3 其序列為SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。1. 3啟動子序列生物信息學(xué)分析將所克隆序列用BLASTN(http://www. . ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)進(jìn)行同源比對。啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預(yù)測軟件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. html 禾口 PLACE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database (J). Nucleic Acids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/進(jìn)行預(yù)測。得到可能的核心啟動子序列和上游啟動子元件。2、一種甘藍(lán)型油菜啟動子Pbhpabp3在轉(zhuǎn)基因植株的花藥、花粉粒中的應(yīng)用，其步驟是2. 1ΡΒηΡΑΒΡ3植物表達(dá)載體的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(購于上海滬尚生物科技有限公司以下相同)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組載體是將質(zhì)粒pBI121 (購自TaKaRa公司)上的35S啟動子用技術(shù)方案1中克隆得到？__3片段替換而來。為完成此目的，首先用》^ I/Hind III雙酶切克隆載體 pMD18-PBnPABp3 的啟動子片段，同時(shí)用 Xba I/Hind III 酶切 pBI121 (Chen, P. Y.，Wang， C. K. , Soong, S.C. To, K. Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and itsapplication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11, 287-293)質(zhì)粒。酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個(gè)小時(shí)之后，用(質(zhì)量體積比。 以下相同)瓊脂糖膠電泳檢測。將克隆載體PMDIS-Pbiipabp3酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnPABP3酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(150ng小失片段50ng大片段)=3 1 的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4 DNA連接酶5單位，IOX反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的固體LB培養(yǎng)基平板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pBI-PBnPAEP3。利用凍融法(步驟如下1 取0. 2ml感受態(tài)農(nóng)桿菌，于冰水中緩慢融化。2 加入約2 μ g重組質(zhì)粒 DNA,輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細(xì)胞。3 加入 800μ 1不含抗生素YEP液體培養(yǎng)基，28°C輕搖培養(yǎng)4-5h。4 :12000rpm，30s，去上清，細(xì)胞重懸于0. 2mlYEP培養(yǎng)基。5 將培養(yǎng)物均勻涂布在含Rif (50mg/L)，Str (50mg/L)和Kan (50mg/ L)的瓊脂板上培養(yǎng)2天，待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子后挑菌檢測)將pBI-PBnPAEP3轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)，用卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，菌落PCR檢測驗(yàn)證。2. 2PBnPABP3 的功能分析2. 2. 1ΡΒηΡΑΒΡ3植物表達(dá)載體PBI-Pbiipabp3在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化Oiang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1:1-6)。制備含有構(gòu)建好載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50yg/ml、利福平50yg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在1.6-2.0之間時(shí)取出。室溫00-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖(質(zhì)量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet 1-77(購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個(gè)花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個(gè)黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個(gè)月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5 天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0.01% (質(zhì)量比)的升汞分別表面消毒3分鐘和10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固體篩選培養(yǎng)基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機(jī)母液IOml ；MS鐵鹽IOml ； 肌醇IOml ；蔗糖30g ；用IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入8g瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表1)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小時(shí)，溫度白天22°C，暗周期20°C )培養(yǎng)。根據(jù)表達(dá)載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(shí)(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA，進(jìn)行PCR陽性檢測(反應(yīng)體系為25 μ L內(nèi)含IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L，Pfu酶1. 5單位，模板約 lOOng，根據(jù)具體情況設(shè)置循環(huán)參數(shù))，結(jié)果表明獲得了轉(zhuǎn)基因陽性苗。表IMS培養(yǎng)基母液配方
權(quán)利要求
1.一種分離的啟動子/7^ra，其序列為SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的啟動子，其特征在于所述的啟動子含有重組載體 pBI-Aum。
3.權(quán)利要求1所述的一種甘藍(lán)型油啟動子的制備方法，其步驟是A、油菜啟動子引物設(shè)計(jì)利用SDS裂解法提取油菜DNA，按照基因組步移試劑盒操作程序，進(jìn)行基因組步移，步移進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，克隆獲得油菜ΡΒηΡΑΒΡ3，步移所用引物是APl 5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ；GSPl 5' - TTGATCAGCCGCAACCACTGGAGATTG -3，；ΑΡ2 5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3，；GSP2 5' - TGATCAATCATTGTCGACGGTGCAACCC -3，；B、甘藍(lán)型油菜啟動子制備是根據(jù)基因組步移試劑盒說明，取5μ 1 DNA用々ra I酶切，檢測其純度，體系如下DNA 5 μ 1, Dra I 1. 6 μ 1, IOXbuffer 2 μ 1，無菌水補(bǔ)齊至 20 μ 1，37°C，過夜，用 1 %質(zhì)量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，分別用產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)切酶々raljcoTtYIraII 和StoI在100 μ 1體系內(nèi)酶切2. 5μ g的基因組DNA，四種限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)體系如下 DNA 2.5 yg ,限制性內(nèi)切酶 8 μ 1, IOXbuffer 10 μ 1，無菌水補(bǔ)齊至 100 μ 1,37°C 過夜，酶切完成后純化，純化步驟如下向酶切液中加入10 μ 1的3Μ NaOAc和50 μ 1的 95%體積比乙醇，-20°C下沉淀3小時(shí)，然后12000rpm離心15分鐘，70%體積比乙醇洗滌兩遍，12000 rpm離心5分鐘，室溫下晾干，用20 μ 1無菌水溶解，純化完成后加入特異性接頭，反應(yīng)體系如下10XT4 ligase buffer 2.0 μ 1，上述酶切處理的DNA 8.0 μ 1，Τ4 Iigase 1 μ 1，特異性接頭14.0 μ 1，無菌水補(bǔ)至20 μ 1，16°C過夜，將連接液用雙蒸水稀釋10倍，保存于-20°C，建立了四個(gè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理并連有特異性接頭的DNA庫，以其為模板進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，第一輪PCR反應(yīng)以GSPl和APl為引物，體系如下10 Xbuffer 5 μ l,dNTPs mixture 1.0 μ 1，GSPl 2.5 μ Ι,ΑΡΙ 2.5 μ l,Taq 酶 0· 2 μ 1，稀釋的DNA庫 0. 1μ 1，無菌水補(bǔ)至50μ 1，反應(yīng)程序如下94°C Imin ；98°C IOs，72°C 2min，共7個(gè)循環(huán)； 980C 10s，68°C 2min，共33個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，第二輪PCR以第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物50倍稀釋液做為模板，以GSP2和AP2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下=IOXbuffer 5 μ 1，dNTPs mixture 1. O μ 1,GSP2 2.5 μ 1, AP2 2.5 μ 1, Taq 酶 0· 2 μ 1，稀釋模板溶液 1.0 μ 1， 無菌水補(bǔ)至50 μ 1，反應(yīng)程序同第一輪PCR，完成后回收純化第二輪PCR產(chǎn)物，并與T載體連接，經(jīng)測序獲得P臓ΒΡ3全長序列。
4.權(quán)利要求書1所述的一種分離的啟動子在花藥中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求書1所述的一種分離的啟動子在花粉粒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)型油菜BnPABP3啟動子(PBnPABP3)啟動子的制備方法及其應(yīng)用。利用基因組步移方法克隆PBnPABP3序列應(yīng)用SDS裂解法提取基因組DNA，在不同體系中，分別用核酸內(nèi)切酶DraI、EcoRⅤ、PvuII和StuI酶切DNA，和接頭片斷連接后，以其為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物的50倍稀釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PBnPABP3。PBnPABP3在植物花藥、花粉粒中的應(yīng)用。該啟動子具有驅(qū)動外源基因表達(dá)的功能，其表達(dá)部位在植物的花藥、花粉粒中，在油菜食用油安全性和提高作物品質(zhì)方面，人工創(chuàng)建不育系、恢復(fù)系，豐富種質(zhì)資源等方面，該啟動子具有應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N15/113GK102220325SQ20111012210
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者劉勝毅, 劉越英, 石磊, 董彩華, 黃軍艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所