專利名稱：一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法及其開放式發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法及其開放式發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種嚴(yán)格好氧的革蘭氏陽性菌，生命力極強，代謝旺盛，枯草芽孢桿菌在成熟期以孢子狀態(tài)存在，具有極強的抗逆能力，是我國農(nóng)業(yè)部列為安全使用的兩種芽孢桿菌之一?？莶菅挎邨U菌具有促進(jìn)動物營養(yǎng)的消化吸收；頡頏致病微生物，調(diào)節(jié)消化道健康； 刺激動物免疫器官生長發(fā)育，提高機體免疫力等作用，所以，該菌在動物飼養(yǎng)和飼料工業(yè)應(yīng)用廣泛。除上述作用外，枯草芽孢桿菌還能通過代謝產(chǎn)生性能良好的微生物絮凝劑；以細(xì)胞壁吸附、富集水中的重金屬離子；消耗水中氨氮，亞硝酸鹽和硫化物，減輕水體富營養(yǎng)程度； 以及分解水中的大分子有機質(zhì)為光合細(xì)菌、藻類以及其他浮游生物提供營養(yǎng)。因此，該菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖時，還表現(xiàn)出對水質(zhì)的凈化作用。此外，枯草芽孢桿菌還是生物發(fā)酵床技術(shù)的主要作用菌株。因此，由枯草芽孢桿菌為主制成的微生態(tài)制劑，在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中有廣泛的應(yīng)用發(fā)展前景。目前，枯草芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)常用液體發(fā)酵法。因為該菌為嚴(yán)格好氧菌，在液體缺氧環(huán)境下，很短時間內(nèi)就會全部死亡，所以為方便運輸使用，必須將該菌培養(yǎng)至抗逆性強的孢子狀態(tài)，菌體與輔料混合干燥后制成微生態(tài)制劑產(chǎn)品。這一過程中微生態(tài)制劑產(chǎn)品的活菌含量大幅降低，提高了單位菌數(shù)的生產(chǎn)成本和銷售價格；同時，枯草芽孢桿菌的孢子需要萌發(fā)后才能發(fā)揮生理作用，使用效果也不如活菌制劑。而實際上，無論飼料生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖還是發(fā)酵墊料用戶，在使用枯草芽孢桿菌時，希望使用活菌數(shù)高的新鮮菌劑，單位活菌數(shù)的價格越低越好。這一需求的最佳解決方案就是直接發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過12-M小時培養(yǎng)，接種的枯草芽孢桿菌數(shù)量可提高數(shù)萬至數(shù)億倍。但枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵過程需要滅菌、 接種和通氣密閉發(fā)酵過程，枯草芽孢桿菌制劑的用戶通常都不具備上述儀器和生產(chǎn)能力。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法及其開放式發(fā)酵方法。本發(fā)明根據(jù)菌株的特性，將枯草芽孢桿菌菌種與培養(yǎng)基成分混合制成枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑；然后將采用開放式液體培養(yǎng)方法進(jìn)行小規(guī)?？莶菅挎邨U菌的發(fā)酵培養(yǎng)， 無需滅菌、接種和密閉培養(yǎng)條件，不僅方便枯草芽孢桿菌制劑用戶的使用，更能大幅降低單位活菌數(shù)的生產(chǎn)成本，促進(jìn)我國枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在飼料和水產(chǎn)行業(yè)的使用，加速我國發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的推廣。該方法操作方便、無需嚴(yán)格的生產(chǎn)環(huán)境和昂貴的發(fā)酵設(shè)備，順應(yīng)枯草芽孢桿菌制劑的市場需求，具有廣闊的發(fā)展前景。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法，其特征是，包括下述步驟a枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的制備以三角瓶盛裝不高于總?cè)萘?0%的適于細(xì)菌生長的培養(yǎng)基(如LB培養(yǎng)基酵母粉5g，蛋白胨粉10g，氯化鈉10g，加水定容至1000ml，以 NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH7. 2)，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫；b枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的發(fā)酵將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，接種至所述步驟a制備的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中，37°C 150rpm搖床振蕩培養(yǎng)8-12小時，制成大罐發(fā)酵菌種；c枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備發(fā)酵罐空消后，加入不高于總?cè)莘e70% 的枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(一切適用于枯草芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基或以葡萄糖、玉米粉、豆粕粉和無機鹽類為主要成分的培養(yǎng)基)，121°C實消滅菌30min以上， 冷卻至室溫；d枯草芽孢桿菌菌種的液體發(fā)酵將步驟b中發(fā)酵完成的大罐發(fā)酵菌種接種至步驟c中制備的枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0. 05% -0. 15% ；發(fā)酵罐中37°C發(fā)酵M小時，發(fā)酵過程中保持通氣比彡2，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，溶氧相對值不低于20，以NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH7. 0-8. 0，罐壓在
0.04-0. 06Mpa ；發(fā)酵完成后的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液即為制備好的枯草芽孢桿菌制劑中的枯草芽孢桿菌菌種；液體培養(yǎng)物應(yīng)盡快使用，短暫儲存時必須保持鼓風(fēng)通氣狀態(tài)，以降低菌體死亡比例；e枯草芽孢桿菌菌種干粉的生產(chǎn)為加工存儲方便，也可將步驟d中發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液加入麥芽糊精或其他輔料以噴霧干燥的方法制成菌種干粉；f枯草芽孢桿菌制劑中培養(yǎng)基成分的配置包括任何可以用于枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成，如LB培養(yǎng)基(按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)酵母粉20%、蛋白胨40%、氯化鈉40% )， 或玉米豆粕無機鹽培養(yǎng)基(按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，玉米52%、豆粕40%、硫酸錳0. 05%、硫酸鎂
1.25%、氯化鈉1 %，磷酸二氫鈉1 %、磷酸氫二鈉4. 7% )，于粉碎攪拌機中粉碎為120目以上的粉狀顆粒并攪拌均勻后裝袋；g枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中培養(yǎng)基成分的滅菌采用高壓蒸汽滅菌法(121°C高壓蒸汽滅菌30分鐘以上，冷卻干燥，使培養(yǎng)基成分降至室溫，含水量降低至12%以下，待用) 或者Co60輻照滅菌法(以15-25Gy的劑量Co60輻照滅菌)對所述步驟f中的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌后待用；h枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑混合包裝產(chǎn)品的生產(chǎn)將步驟d中的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與步驟g中滅菌后的培養(yǎng)基成分，按照8 92的質(zhì)量比混合，控制含水量< 15%，然后， 分裝為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的真空包裝產(chǎn)品，保質(zhì)期4-9月為3個月，10-3月為6個月；i將步驟e中的菌種干粉與步驟g中滅菌后的培養(yǎng)基，按照1 99的質(zhì)量比混合， 控制含水量< 8%，然后分裝為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的真空包裝產(chǎn)品，保質(zhì)期可達(dá)1年以上?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)制劑開放式發(fā)酵方法開放式培養(yǎng)器消毒后，加入總?cè)莘e 60-70 %的自來水并保持鼓風(fēng)通氣狀態(tài)，倒入自來水重量5 %的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑攪拌均勻，加熱至發(fā)酵液沸騰后，根據(jù)培養(yǎng)基泡沫情況，向培養(yǎng)器中加入體積為發(fā)酵液體積的 0. 05-0. 25%的消泡劑；然后快速冷卻至65°C，并于60_65°C通氣培養(yǎng)18_24h，即達(dá)到微生態(tài)菌劑使用標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)結(jié)束后，活菌濃度達(dá)到50-100億/ml，且培養(yǎng)物中無大腸桿菌和沙門氏菌等致病菌污染。
所述培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵產(chǎn)物用作動物飼料微生態(tài)添加劑時，添加劑量為5L/噸； 用于發(fā)酵墊料時，添加量為500ml/m3或者墊料干重的0. 1-0. 5% ；用于水產(chǎn)養(yǎng)殖時每7_10 天使用一次，池塘成品養(yǎng)殖凈水每畝每次添加1-5L，工廠化高密度養(yǎng)殖添加量為每立方水體每次添加10-20ml。綜上，本發(fā)明首創(chuàng)了一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法及其開放式發(fā)酵方法。 通過實驗研究，提出了枯草芽孢桿菌開放式培養(yǎng)制劑的生產(chǎn)和使用技術(shù)，為降低發(fā)酵墊料、 動物飼料微生態(tài)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面對低成本、高活性枯草芽孢桿菌菌劑的需求提供了一種操作方法。該方法操作簡單方便，培養(yǎng)設(shè)備要求低，采用該方法能夠有效降低枯草芽孢桿菌單位活菌數(shù)的生產(chǎn)和使用成本，并且培養(yǎng)物大腸桿菌和沙門氏菌等致病菌污染，其有益效果主要包括以下四點1、將菌種與培養(yǎng)基混合制成枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑，使用該制劑培養(yǎng)枯草芽孢桿菌操作簡便無需菌種培養(yǎng)和接種操作，而且對培養(yǎng)設(shè)備要求低，一般使用發(fā)酵墊料的養(yǎng)殖戶、飼料廠和水產(chǎn)養(yǎng)殖戶都能滿足要求，順利使用；2、采用含菌培養(yǎng)基液體發(fā)酵的方法，將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中的活菌數(shù)量提高數(shù)萬甚至上億倍，極大的降低了單位活菌數(shù)的生產(chǎn)和使用成本；3、以在用戶處就地培養(yǎng)的方法，在發(fā)酵結(jié)束后立即使用，最大限度的保留了枯草芽孢桿菌的活性，降低了枯草菌制劑由于加工、運輸和存儲導(dǎo)致的活性降低；4、利用枯草芽孢桿菌生長代謝旺盛，孢子能耐受10(TC高溫和在較高溫度下快速增殖的特性，先與培養(yǎng)基快速煮沸，然后在60-65°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)物無大腸桿菌或沙門氏菌等致病菌的污染。


圖1為本發(fā)明的生產(chǎn)及使用流程圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體事例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將隨著描述更加清晰。但這些實例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明的技術(shù)細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實例1 液體菌種與玉米豆粕型培養(yǎng)基混合生產(chǎn)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑1. 1枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中菌種發(fā)酵液的制作1. 1. 1枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的制備以IOOOml三角瓶盛裝200ml LB培養(yǎng)基 (酵母粉lg，蛋白胨粉2g，氯化鈉2g，加水補足至200ml, ρΗ7· 2)，121°C高壓滅菌30分鐘， 冷卻至室溫；1. 1. 2枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的發(fā)酵將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，接種至所述步驟ι. ι. 1中制備的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中，37°c 150rpm搖床振蕩培養(yǎng)12小時；1. 1. 3枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備250L發(fā)酵罐空消后，加入160L枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母粉1kg，蛋白胨粉1. m^g，氯化鈉1. Wcg，加水補足至160L， ρΗ7· 2)，121 °C實消滅菌30min以上，冷卻至室溫；1. 1. 4枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中發(fā)酵菌種制備將步驟1. 1. 2中發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基全部接種至步驟ι. 1. 3中制備的枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)M小時，發(fā)酵過程中，保持通氣比在2以上，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，溶氧相對值不低于20，以NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH7. 2，罐壓在0. 04-0. 06MPa之間，發(fā)酵完成后即制備好枯草芽孢桿菌制劑中的菌種成分，液體培養(yǎng)物必須保持鼓風(fēng)通氣狀態(tài)并盡快使用，以降低菌體死亡比例；1. 2高壓蒸汽滅菌法制作培養(yǎng)菌劑中的玉米豆粕型培養(yǎng)基成分1.2. 1玉米豆粕型培養(yǎng)基的配置分別稱取玉米粉沈01^、豆粕200kg、硫酸錳 250g、硫酸鎂6. 25kg、氯化鈉^g，磷酸二氫鈉^g、磷酸氫二鈉23. ^g，充分?jǐn)嚢杈鶆?，并粉碎?20目-200目，配置成500kg的玉米豆粕型培養(yǎng)基；1. 2. 2枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中培養(yǎng)基成分的滅菌所述步驟1. 2. 1中的培養(yǎng)基 121 °C高壓滅菌30分鐘以上，冷卻至室溫，干燥至含水量< 12%，待用；1. 3枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的生產(chǎn)將發(fā)酵完成的新鮮菌種與滅菌后的培養(yǎng)基成分，按照8 92的質(zhì)量比混合，分裝為Ikg/包，即制成開放式枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑。質(zhì)保期，4-9月為3個月，10-3月為6個月；此方法無需液體菌種的干燥過程，工藝簡單，生產(chǎn)設(shè)備要求低，但培養(yǎng)制劑含水量略高，保質(zhì)期相對較短。實例2 =LB培養(yǎng)基與菌種干粉混合生產(chǎn)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑2. 1枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中菌種粉的制作2. 1. 1枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的制備以IOOOml三角瓶盛裝200ml LB培養(yǎng)基 (酵母粉lg，蛋白胨粉2g，氯化鈉2g，加水補足至200ml, ρΗ7· 2)，121°C高壓滅菌30分鐘， 冷卻至室溫；2. 1. 2枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的發(fā)酵將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，接種至所述步驟a中制備的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中，37°C 150rpm搖床振蕩培養(yǎng)12小時；2. 1.3枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備200L發(fā)酵罐空消后，加入130L枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母粉0. 7kg,蛋白胨粉1. 5kg,氯化鈉1. 3kg，加水補足至 130L，ρΗ7· 2)，121 °C實消滅菌30min以上，冷卻至室溫；2. 1. 4枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中發(fā)酵菌液的制備將步驟2. 1. 2中發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基全部接種至步驟2. 1. 3中制備的枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)M小時，發(fā)酵過程中，保持通氣比在2以上，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，溶氧相對值不低于20，以NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度至pH7. 2，罐壓在0. 04-0. 06MPa之間；2. 1. 5發(fā)酵菌液的噴霧干燥2. 1. 4中發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌菌液，加入枯草芽孢桿菌菌液重量10%的麥芽糊精攪拌均勻后，立即進(jìn)行噴霧干燥，條件為發(fā)酵液溫度 65°C，進(jìn)口溫度為170°C，出口溫度為85°C，噴霧壓力15MPa，噴嘴直徑1. 0mm，將發(fā)酵菌種制成干粉；2. 2Co60輻照法制作培養(yǎng)菌劑中LB培養(yǎng)基成分2. 2. ILB發(fā)酵培養(yǎng)基干粉的配置分別稱取蛋白棟200kg、酵母粉100kg、氯化鈉200kg,充分?jǐn)嚢杈鶆?，并粉碎?20目-200目，配置成500kg的LB培養(yǎng)基干粉；2. 2. 2LB培養(yǎng)基干粉的輻照滅菌所述2. 2. 1中配置好的的培養(yǎng)基以15_25Gy的劑量Co60輻照滅菌；2. 3枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的生產(chǎn)將2. 1. 5中制備的發(fā)酵菌粉與2. 2. 2中輻照滅菌的LB培養(yǎng)基成分，按照1 99的比例混合，分裝為Ikg/包，即制成粉狀枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑。質(zhì)保期12個月；該方法需要噴霧干燥設(shè)備，但生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑含水量低，保質(zhì)期長達(dá)一年以上。實例3 在簡易培養(yǎng)器中以枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑進(jìn)行開放式發(fā)酵3. 1培養(yǎng)器的消毒。開放式發(fā)酵采用具有加熱和控溫功能的開放式培養(yǎng)器，發(fā)酵前以二氧化氯消毒劑對開放式發(fā)酵器進(jìn)行消毒，然后將發(fā)酵器沖洗干凈。3. 2培養(yǎng)制劑的稀釋配置。向30L培養(yǎng)器中加入20L的自來水，以通氣泵向水中鼓風(fēng)，加入Ikg枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑攪拌均勻，加熱至培養(yǎng)基沸騰后盡快使培養(yǎng)液冷卻至 65°C，并根據(jù)培養(yǎng)基泡沫情況，向培養(yǎng)器中加入30-50ml消泡劑；3. 3枯草芽孢桿菌的開放式發(fā)酵。將配置好的培養(yǎng)制劑在60_65°C通氣培養(yǎng)18h， 活菌濃度達(dá)到50-100億/ml時，即達(dá)到微生態(tài)菌劑使用標(biāo)準(zhǔn)。此時，培養(yǎng)物中無大腸桿菌和沙門氏菌等致病菌污染；實例4 無特定設(shè)備情況下，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的開放式發(fā)酵4. 1培養(yǎng)器的消毒以二氧化氯消毒劑對容積為50L的不銹鋼桶進(jìn)行消毒，然后沖洗干凈。4. 2培養(yǎng)制劑的配置和煮沸向不銹鋼桶中加入30L的自來水，以導(dǎo)管連接小型鼓風(fēng)機向水中鼓風(fēng)，加入1. 5kg枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑攪拌均勻，將不銹鋼桶轉(zhuǎn)移至火爐上加熱至沸騰，關(guān)火使培養(yǎng)液冷卻至65°C，并加入50ml消泡劑；4. 3枯草芽孢桿菌的開放式發(fā)酵間歇加熱，使培養(yǎng)制劑保持在60_65°C下通氣培養(yǎng)18h，活菌濃度達(dá)到50-100億/ml時，即可使用。此時，培養(yǎng)物中無大腸桿菌和沙門氏菌等致病菌污染；實例5 枯草芽孢桿菌開放式發(fā)酵產(chǎn)物的使用5. 1用作動物飼料微生態(tài)添加劑在配置雞、鴨、豬等動物的全價飼料時，每噸飼料同時添加5L新鮮發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物，即可起到促進(jìn)動物營養(yǎng)的消化吸收、 調(diào)節(jié)消化道健康和提高動物機體免疫力等作用；5. 2用作發(fā)酵墊料接種劑將5L新鮮發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物與950L水混合，然后加入430kg鋸末+430kg稻殼+140kg豬或雞的糞便中充分?jǐn)嚢杈鶆?，堆積成1. 2 米高的料堆發(fā)酵，使堆料中心的溫度在65°C以上保持7天，之后即可用作豬雞舍內(nèi)發(fā)酵墊料；5. 3用于水產(chǎn)養(yǎng)殖時，池塘成品養(yǎng)殖凈水為每畝3L，工廠化高密度養(yǎng)殖添加量為每立方水體15ml，均為每7天使用一次，并同時配合使用增氧泵?？善鸬较乃邪钡喯跛猁}和硫化物，減輕水體富營養(yǎng)程度，凈化水質(zhì)，以及分解水中的大分子有機質(zhì)為光合細(xì)菌、藻類以及其他浮游生物提供營養(yǎng)的作用。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法，其特征是，包括下述步驟a枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的制備以三角瓶盛裝不高于總?cè)萘?0%的適于細(xì)菌生長的培養(yǎng)基，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫；b枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的發(fā)酵將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，接種至所述步驟a制備的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中，370C 150rpm搖床振蕩培養(yǎng)8_12小時，制成大罐發(fā)酵菌種；c枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備發(fā)酵罐空消后，加入不高于總?cè)莘e70%的枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C實消滅菌30min以上，冷卻至室溫；d枯草芽孢桿菌菌種的液體發(fā)酵將步驟b中發(fā)酵完成的大罐發(fā)酵菌種接種至步驟c 中制備的枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 0. 05% -0. 15% ；發(fā)酵罐中37°C發(fā)酵M小時；發(fā)酵完成后的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液即為制備好的枯草芽孢桿菌制劑中的枯草芽孢桿菌菌種；或者將發(fā)酵完成的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液加入輔料以噴霧干燥的方法制成菌種干粉；e枯草芽孢桿菌制劑中培養(yǎng)基成分的配置配置用于枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，于粉碎攪拌機中粉碎為120目以上的粉狀顆粒并攪拌均勻后裝袋；f枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑中培養(yǎng)基成分的滅菌采用高壓蒸汽滅菌法或者Co60輻照滅菌法對所述步驟e中的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌后待用；g枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑混合包裝產(chǎn)品的生產(chǎn)將步驟d中的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與步驟f中滅菌后的培養(yǎng)基，按照8 92的質(zhì)量比混合，控制含水量<15%，然后分裝為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的真空包裝產(chǎn)品；或者將步驟d中的菌種干粉與步驟f中滅菌后的培養(yǎng)基，按照1 99的質(zhì)量比混合，控制含水量<8%，然后分裝為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的真空包裝產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法，其特征是，所述步驟d發(fā)酵過程中保持通氣比> 2，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，溶氧相對值不低于20，以NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至 pH7. 0-8. 0，罐壓在 0. 04-0. 06Mpa。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法，其特征是，所述步驟e用于枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基或玉米豆粕無機鹽培養(yǎng)基；所述LB培養(yǎng)基組成為按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)酵母粉20 %、蛋白胨40 %、氯化鈉40 % ；所述玉米豆粕無機鹽培養(yǎng)基組成為按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)玉米52%、豆粕40%、硫酸錳0. 05%、硫酸鎂1. 25%、氯化鈉1%， 磷酸二氫鈉1%、磷酸氫二鈉4. 7%。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法，其特征是，所述步驟 a適于細(xì)菌生長的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，所述LB培養(yǎng)基為酵母粉5g，蛋白胨粉10g，氯化鈉 10g，加水定容至1000ml，以NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH7. 2。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法，其特征是，所述步驟 f高壓蒸汽滅菌法為121°C高壓蒸汽滅菌30分鐘以上，冷卻干燥，使培養(yǎng)基成分降至室溫， 含水量降低至12%以下，待用；所述Co60輻照滅菌法為以15-25Gy的劑量Co60輻照滅菌。
6.權(quán)利要求1或2制備的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的開放式發(fā)酵方法，其特征是，開放式培養(yǎng)器消毒后，加入總?cè)莘e60-70 %的自來水并保持鼓風(fēng)通氣狀態(tài)，倒入自來水重量5 %的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑攪拌均勻，加熱至發(fā)酵液沸騰后，向培養(yǎng)器中加入體積為發(fā)酵液體積0. 05-0. 25%的消泡劑；然后冷卻至65°C，并于60_65°C通氣培養(yǎng)18_24h，得到枯草芽孢桿菌開放式液體發(fā)酵制劑。
7.如權(quán)利要求6所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的開放式發(fā)酵方法，其特征是，其特征是，所述枯草芽孢桿菌開放式液體發(fā)酵制劑用于動物飼料、發(fā)酵墊料或用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。
8.如權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的開放式發(fā)酵方法，其特征是，所述枯草芽孢桿菌開放式液體發(fā)酵制劑用于動物飼料作為微生態(tài)添加劑，添加劑量為5L/噸。
9.如權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的開放式發(fā)酵方法，其特征是，所述枯草芽孢桿菌開放式液體發(fā)酵制劑用于發(fā)酵墊料，添加量為500ml/m3或者發(fā)酵墊料干重的 0. 1-0. 5%。
10.如權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的開放式發(fā)酵方法，其特征是，所述枯草芽孢桿菌開放式液體發(fā)酵制劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，每7-10天使用一次，池塘成品養(yǎng)殖凈水每畝每次添加1-5L，工廠化高密度養(yǎng)殖添加量為每立方水體每次添加10-20ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑生產(chǎn)方法及其開放式發(fā)酵方法。該生產(chǎn)方法包括以下步驟種子培養(yǎng)基的制備、種子培養(yǎng)基的發(fā)酵、液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、菌種的液體發(fā)酵、枯草芽孢桿菌制劑中培養(yǎng)基成分的配置及滅菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的生產(chǎn)。本發(fā)明根據(jù)菌株的特性，將枯草芽孢桿菌菌種與培養(yǎng)基成分混合制成枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑，采用無需滅菌、接種和密閉培養(yǎng)條件的開放式液體培養(yǎng)方法進(jìn)行小規(guī)模枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，不僅方便枯草芽孢桿菌制劑用戶的使用，更能大幅降低單位活菌數(shù)的生產(chǎn)成本，促進(jìn)我國枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在飼料和水產(chǎn)行業(yè)的使用，加速我國發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的推廣。
文檔編號C12R1/125GK102220266SQ201110122449
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者井慶川, 劉瑞亭, 劉雪蘭, 李福偉, 武彬, 石天虹, 閻佩佩, 魏祥法, 黃保華 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所