專利名稱：一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及非洲菊灰霉病離體抗性鑒定的方法。
背景技術(shù)：
非洲菊(fer力era )是世界五大重要切花之一，其盆花的應(yīng)用也越來越流行， 具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。灰霉菌(徹iiriis是一種空氣傳播、適宜溫度范圍大 (4°C -25°C)、侵染200多種寄主的腐生菌，由灰霉菌引起的軟腐病，嚴(yán)重危害非洲菊的生產(chǎn)、貯藏、運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)，尤其是在非洲菊切花采后貯藏、運輸過程中，由于高濕、溫度波動大產(chǎn)生結(jié)露等環(huán)境條件，給灰霉菌的滋生繁殖提供了良好的條件，灰霉菌引起的軟腐病成為非洲菊切花采后質(zhì)量保持的限制因子之一，灰霉菌侵染引起的軟腐病給非洲菊切花導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，直接的影響是侵染產(chǎn)品被拒絕進(jìn)入采后供應(yīng)鏈，間接的影響是被感染產(chǎn)品的觀賞性狀降低，極大的影響了產(chǎn)品的銷售價格。大田生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，在非洲菊不同栽培品種中存在對灰霉菌軟腐病的抗性差異。雖然可以通過控制栽培條件來降低灰霉菌軟腐病的危害，但隨著能源成本的升高，培育抗性品種是非洲菊育種、生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要出路?？剐再Y源的準(zhǔn)確鑒定篩選是抗性品種培育的首要條件，現(xiàn)有技術(shù)中對非洲菊灰霉病抗性鑒定常采用大田活體植株接種法，存在供試植株感染病害、鑒定周期長、結(jié)果易受環(huán)境條件影響的缺陷和不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的大田活體植株接種法對非洲菊灰霉病抗性鑒定存在供試植株感染病害、鑒定周期長、結(jié)果易受環(huán)境條件影響的缺陷和不足，其目的是提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確和能大規(guī)模篩選鑒定非洲菊灰霉病抗性資源的方法，為進(jìn)一步的雜交育種或分子標(biāo)記輔助育種提供支持。解決上述技術(shù)問題和實現(xiàn)本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 一種非洲菊灰霉病抗性鑒定方法，按以下步驟進(jìn)行
(1)適宜的接種材料的選擇，以新鮮采集的完整幼葉或花瓣作為接種材料；
(2)灰霉菌SoiiTiisCinerea培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備
用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)灰霉菌(徹iiriis cinerea), 將-70°C _80°C低溫保存的灰霉菌(SoiiTii1S于超菌工作臺接種于馬鈴薯葡萄
糖瓊脂培養(yǎng)基中，于18°C 25°C溫度，光照強度為1000 20001x條件下16 h連續(xù)光照培養(yǎng)培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)7 15天，菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 1%吐溫-20的滅菌蒸餾水懸浮培養(yǎng)皿中所培養(yǎng)的分生孢子，用小孔計數(shù)法制備每毫升孢子數(shù)為IXIO7個的分生孢子貯備液供接種用；
(3)制備接種液
3于接種前，將步驟(2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)和分生孢子數(shù)為1 X IO6個/ml濃度的接種液供接種用或?qū)⒉襟E (2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)和分生孢子數(shù)為3 X IO5個/ml濃度的接種液供接種用； (4)接種
用微量移液器取2μ 1的接種液以液滴的方式將孢子液接種到步驟(1)所述的幼葉或花瓣，將該幼葉或花瓣材料保持在相對濕度為90% 95%、光照強度為IOOOIx 20001χ、溫度為18°C 25°C的條件下，接種24h后開始觀察病情發(fā)展，根據(jù)病情發(fā)展的速度及病情指數(shù)判斷供試材料的抗性，花瓣在4 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種，幼葉在120h 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種。所述的病情指數(shù)分為花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計方法和幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計方法，所述的花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計方法如下
0級接種液滴清澈，無任何侵染跡象，
1級開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，
2級侵染擴展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-4倍，
3級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，但小于接種花瓣的1/2面積，
4級侵染面積超過花瓣的1/2，
5級整個花瓣幾乎或完全被侵染，
48h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種；
所述的幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計方法如下
0級接種液滴清澈，無任何侵染跡象，
1級開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，
2級侵染擴展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-5倍，
3級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，侵染斑大小為液滴的6-10倍，
4級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，侵染區(qū)域接近葉片面積的1/2，
5級侵染區(qū)域達(dá)到或超過葉片面積的2/3，
120h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種。所述的接種是對完整幼葉的正面接種或?qū)ò甑恼娼臃N。本發(fā)明所涉及的生物材料灰霉菌徹iiriis Cinerea已在許多非專利文獻(xiàn)公開， 如在“番茄灰霉病病原菌生物學(xué)特性的研究”(徐明等，貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(3) :68-71) 中公開，并且上述生物材料申請人有保存，申請人保證自本專利申請日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放。申請人聯(lián)系地址是云南省昆明市北郊黑龍?zhí)对颇限r(nóng)業(yè)大學(xué)，郵政編碼650201，聯(lián)系電話0871-5220399。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1、現(xiàn)有的大田非洲菊活體灰霉菌病害抗性鑒定從育苗開始、小苗移栽、接種到發(fā)病是一項歷時2 3月、費時費力的工作，且病害表現(xiàn)易受環(huán)境影響、很難獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明采用小分生孢子液滴、補充營養(yǎng)、花瓣無創(chuàng)傷接種，于室溫、高濕、自然光條件下48h能清楚地鑒別出非洲菊不同基因型間的灰霉病抗性差異，花瓣鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性被幼葉鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實，且對非洲菊抗感親本雜交分離后代的檢測結(jié)果符合非洲菊灰霉菌抗病基因為QTL基因控制性狀的分離特點，達(dá)到了簡單、快速、準(zhǔn)確鑒定非洲菊灰霉病抗性的目的。2、現(xiàn)有非洲菊灰霉病抗性鑒定采用活體鑒定的方法，因接種病菌使植株感染病害影響植株正常生長發(fā)育、甚至死亡，致使非洲菊雜交育種后代的早期抗性鑒定無法進(jìn)行。本發(fā)明的方法采用離體的幼葉作接種材料，不但不影響植株正常的生長發(fā)育，并且能夠在早期對雜交后代進(jìn)行灰霉病抗性鑒定，能夠有效的促進(jìn)非洲菊灰霉病抗性育種。3、現(xiàn)有灰霉菌活體抗性鑒定方法，因易受環(huán)境的影響，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性低，無法為非洲菊灰霉菌抗性連鎖分子標(biāo)記的建立提供可靠的研究材料，本發(fā)明的離體花瓣鑒定方法是在人工控制的穩(wěn)定條件下進(jìn)行，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高，可為非洲菊灰霉菌抗性連鎖分子標(biāo)記的建立提供可靠的支持。


圖1是一對抗病和感病的非洲菊親本及其雜交分離后代的灰霉菌抗性變異，橫坐標(biāo)及其數(shù)字表示雜交親本及其雜交分離后代。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。以下各實施例中所用的灰霉菌 Botrytis cinerea由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，其余試劑均為是市售產(chǎn)品。所用儀器光學(xué)顯微鏡、 光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱均為普通配制。本發(fā)明使用的生物材料灰霉菌召oiiTiis ci/^rea是利用灰霉菌的致灰霉病的致病共性來感染植株，因此具有致病力的各種灰霉菌菌株都能達(dá)到本發(fā)明的效果，該灰霉菌廣泛存在于許多大田或園藝作物中，采用植物病原真菌的常規(guī)稀釋分離方法(方中達(dá)，植病研究法(第三版)，中國農(nóng)業(yè)出版社，1998，124 125)即可得到灰霉菌召oirj^is chwrea。實施例1以花瓣為接種材料的實施例
(1)植物材料
供試的灰霉菌不同抗性的非洲菊切花栽培品種為Macy，Kaliki, Risto, Serena, CK100, 3142，5544共7個基因型，由荷蘭非洲菊育種公司Florist和Shreurs提供，采集新鮮花瓣作為接種材料；
(2)灰霉菌SoiiTiiscinerea培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備
用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)灰霉菌徹trytis cinerea， 將-80°C低溫保存的灰霉菌OtoiiTiis ci/^rm)于超菌工作臺接種于裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的直徑IOcm培養(yǎng)皿中心，于20°C 22°C溫度，光照強度為18001x條件下1 連續(xù)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)7天，菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 1%吐溫-20的滅菌蒸餾水懸浮培養(yǎng)皿中所培養(yǎng)的分生孢子，用小孔計數(shù)法制備每毫升孢子數(shù)為IXlO7的分生孢子貯備液供接種用；
(3)制備接種液
于接種前，將步驟(2)獲得的分生孢子貯備液制備為分別含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、6%濃度的馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)及分生孢子數(shù)為3X IO5個/ml、1 X IO6個/ml 濃度的接種液供接種用； (4)接種
5取將步驟(3)制備的含不同濃度分生孢子和PD的接種液2μ 1分別接種到步驟(1) 所述的花瓣上，將該花瓣材料分別保持在塑料膜密封，相對濕度90% 95%，光照強度為 18001χ、溫度為20°C 22°C的條件下，接種24h后開始觀察病情發(fā)展，根據(jù)病害發(fā)展速度及病情指數(shù)判斷供試材料的病害抗性。接種采用對花瓣的正面和反面接種對比形式。(5)病情觀察及病情指數(shù)統(tǒng)計花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計方法如下
0級接種液滴清澈，無任何侵染跡象； 1級開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀； 2級侵染擴展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-4倍； 3級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，但小于接種花瓣的1/2面積； 4級侵染面積超過花瓣的1/2 ； 5級整個花瓣幾乎或完全被侵染。48h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種。(6)實驗結(jié)果及分析
接種花瓣正反兩面比較組織正反面對接種效果的影響。觀察結(jié)果為，花瓣正反面接種均能發(fā)病、且正反面發(fā)病表現(xiàn)結(jié)果一致，但花瓣正面接種病害發(fā)展快于反面，可能是非洲菊花瓣背面膜質(zhì)化程度的增大加大了病菌侵入的難度，以正面接種為理想。統(tǒng)計灰霉菌分生孢子及營養(yǎng)濃度配比對非洲菊花瓣正面接種的病情指數(shù)詳見表 1。病情指數(shù)結(jié)果表明，含有1%的PD的兩個分生孢子濃度3 X IO5個/ml、1 X IO6個/ml接種的各品種的花瓣4天內(nèi)均發(fā)病輕、且品種間差異不明顯；含有6%的PD及分生孢子濃度 1 X IO6個/ml接種的各品種的花瓣在接種4 均已嚴(yán)重發(fā)病、無法鑒定品種間差異；3%PD 與分生孢子3X IO5個/ml濃度組合接種的花瓣雖然品種間差異明顯，但48h時品種間差異尚小；以3%PD與分生孢子1 X IO6個/ml及6%PD與分生孢子3 X IO5個/ml濃度組合最為理想，4 能清楚鑒別品種間抗性差異，病情指數(shù)大于3的品種均為田間觀察較為感病的品種。表1灰霉菌分生孢子及營養(yǎng)濃度配比對非洲菊花瓣正面接種的病情指數(shù)
權(quán)利要求
1.一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，按以下步驟進(jìn)行(1)適宜的接種材料的選擇，以新鮮采集的完整幼葉或花瓣作為接種材料；(2)灰霉菌SoiiTiisCinerea培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)灰霉菌，將-70 -80°C低溫保存的灰霉菌于超菌工作臺接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，于18°C 25°C溫度，光照強度為1000 20001x 條件下16 h連續(xù)光照培養(yǎng)培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)7 15天，菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%吐溫-20的滅菌蒸餾水懸浮培養(yǎng)皿中所培養(yǎng)的分生孢子，用小孔計數(shù)法制備每毫升孢子數(shù)為IX IO7個的分生孢子貯備液供接種用；(3)制備接種液于接種前，將步驟(2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為1 X IO6個/ml濃度的接種液供接種用或?qū)⒉襟E(2)獲得的分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為3 X IO5個/ml濃度的接種液供接種用；(4)接種用微量移液器取2μ 1的接種液以液滴的方式將孢子液接種到步驟(1)所述的幼葉或花瓣，將該幼葉或花瓣材料保持在相對濕度為90% 95%、光照強度為IOOOIx 20001χ、溫度為18°C 25°C的條件下，接種24h后開始觀察病情發(fā)展，根據(jù)病情發(fā)展的速度及病情指數(shù)判斷供試材料的抗性，花瓣在4 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種，幼葉在120h 內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，其特征在于所述的病情指數(shù)分為花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計方法和幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計方法，所述的花瓣病情指數(shù)統(tǒng)計方法如下0級接種液滴清澈，無任何侵染跡象，1級開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，2級侵染擴展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-4倍，3級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，但小于接種花瓣的1/2面積，4級侵染面積超過花瓣的1/2，5級整個花瓣幾乎或完全被侵染，48h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種；所述的幼葉病情指數(shù)統(tǒng)計方法如下0級接種液滴清澈，無任何侵染跡象，1級開始侵染，侵染斑限于接種液滴之內(nèi)，液滴呈褐色狀，2級侵染擴展到液滴之外，侵染斑大小為液滴的2-5倍，3級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，侵染斑大小為液滴的6-10倍，4級侵染區(qū)域繼續(xù)擴大，侵染區(qū)域接近葉片面積的1/2，5級侵染區(qū)域達(dá)到或超過葉片面積的2/3，120h內(nèi)病情指數(shù)達(dá)到3 5級為感病品種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，其特征在于所述的接種是對完整幼葉的正面接種或?qū)ò甑恼娼臃N。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非洲菊灰霉病抗性鑒定的方法，屬植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域。該方法是(1)適宜的接種材料的選擇，以新鮮采集的完整幼葉或花瓣作為接種材料；(2)灰霉菌培養(yǎng)及其分生孢子懸浮液的制備(3)制備接種液，于接種前將分生孢子貯備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為1×106個/ml濃度的接種液或?qū)⒎稚咦淤A備液稀釋為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的馬鈴薯葡萄糖和分生孢子數(shù)為3×105個/ml濃度的接種液；(4)接種。本發(fā)明方法在人工控制的穩(wěn)定條件下進(jìn)行，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高，達(dá)到了簡單、快速、準(zhǔn)確鑒定非洲菊灰霉病抗性的目的。
文檔編號C12Q1/18GK102220407SQ20111012255
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者吳興恩, 吳景芝, 吳紅芝, 都婷, 陳溪 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)