專利名稱：厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1b抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酪氨酸磷酸酶抑制劑篩選領(lǐng)域，特別涉及厚樸酚及和厚樸酚混合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB抑制劑方面的應(yīng)用，進(jìn)而用于制備治療及預(yù)防與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB活力過高或過表達(dá)相關(guān)疾病的食品、藥物或食品及藥物組合物。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPs)大家族，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子，酪氨酸磷酸化過度或不足，是許多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)相關(guān)疾病的特征。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶lB(Pr0tein Tyrosine PhosphataselB, PTP1B)是美國華盛頓大學(xué)愛德蒙德·費(fèi)舍爾(Edmond H-Fischer)教授于1988年發(fā)現(xiàn)的，是第一個(gè)被成功分離的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶。該酶為一個(gè)37KD的胞內(nèi)酶，通過含有35個(gè)氨基酸殘基的C末端被定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在第215位的Cys是PTPlB的催化活性中心。PTPlB廣泛存在人類和動(dòng)物體內(nèi)，在細(xì)胞生長、組織分化、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)及代謝方面發(fā)揮著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)PTPlB能夠調(diào)節(jié)許多凋亡蛋白的磷酸化程度、可調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育及免疫應(yīng)答并與多種生長因子有相互作用。PTPlB在體內(nèi)的活力過高或過表達(dá)是許多疾病的重要特征，如帕金森病、慢性髓系白血病等疾病都與其密切相關(guān)。近年來，國內(nèi)外的很多研究人員一直都在尋找選擇性的PTPlB抑制劑，雖然特異的、有效的和安全的非肽類抑制劑尚未發(fā)現(xiàn)，但PTPlB抑制劑的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。目前已發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)PTPlB抑制劑為肽類或毒性較強(qiáng)的物質(zhì)，例如非選擇性的PTP抑制劑釩酸鹽和過釩酸鹽等，無法作為藥物進(jìn)行開發(fā)。其它如中國專利CN1794989A，所提到的 PTPlB抑制劑為N-(((((l，3-噻唑-2-基)氨基)羰基)苯基)磺?；?苯丙氨酸衍生物及相關(guān)化合物，需要通過多步化學(xué)合成得到，生產(chǎn)工藝復(fù)雜。從傳統(tǒng)中藥資源中篩選PTPlB抑制劑是最有希望的方法之一，現(xiàn)已有從中藥等天然植物中分離提取得到的PTPlB抑制劑， 如中國專利CN1521157A，在植物紫金牛和小連翹中分離得到了一系列PTPlB抑制物對苯醌類化合物及其衍生物。但尚未發(fā)現(xiàn)厚樸酚及和厚樸酚抑制PTPlB的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)抑制劑方面的新用途。厚樸酚及和厚樸酚是存在于中藥厚樸中的多酚類化合物。本發(fā)明所涉及的厚樸酚
及和厚樸酚，其結(jié)構(gòu)式如下所示
厚樸酚
和厚樸酚本發(fā)明的厚樸酚及和厚樸酚是通過萃取的方法從厚樸中獲得的天然產(chǎn)物。該厚樸酚及和厚樸酚制劑在體外能抑制PTPlB的活性，而且無毒副作用。可以在PTPlB抑制劑方面得到應(yīng)用，進(jìn)而可以用于制備治療及預(yù)防與PTPlB活力過高或過表達(dá)相關(guān)疾病的食品、 藥物或食品及藥物組合物。厚樸酚及和厚樸酚提取方法方法一1)將干燥厚樸皮裝入三角燒瓶中，然后用甲醇與水混合提取液在45 55°C水浴溫度下冷凝水回流提取，提取3 5次，將最后得到的提取液在40 50°C水浴溫度下濃縮得甲醇提取物；干燥厚樸皮與混合提取液的用量比例為W V = Ikg 10 15L，甲醇與水組成的混合提取液中，按體積百分比計(jì)算Vw V水=90 95 10 5 ；2)將步驟1)的甲醇提取物溶解在W V= 1 1 3倍量的蒸餾水中，再加入與蒸餾水等體積的正己烷進(jìn)行萃取，萃取3 5次，保留水相；3)在步驟幻的水相體系中，加入與水相體系等體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取 3 5次，保留水相；4)在步驟幻的水相體系中加入與水相體系等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3 5次，然后在40 50°C水浴溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去乙酸乙酯，從而得到乙酸乙酯層濃縮物，即為厚樸酚及和厚樸酚的混合物，其中^mm W和厚樸1.5-2.5 1。方法二1)將厚樸干燥后研磨粉碎，通過40 60目篩過濾，得到厚樸干粉；2)將厚樸干粉與體積分?jǐn)?shù)為70% 95%的乙醇水溶液按W V=I 10 20 進(jìn)行浸泡并攪拌1 3小時(shí)，攪拌速度為60 300轉(zhuǎn)/分，然后過濾去除殘?jiān)?，得到厚樸的乙醇浸泡液；再將浸泡液中的乙醇蒸發(fā)去除，得到粘稠的厚樸浸膏；3)將厚樸浸膏加熱80 100°C，干燥去除剩余乙醇，得到厚樸干粉；再將厚樸干粉與蒸餾水、純凈水或去離子水按W V = Ikg 10 20L進(jìn)行浸泡并攪拌1 3小時(shí)，攪拌速度為60 300轉(zhuǎn)/分，然后過濾去除殘?jiān)?，得到厚樸水煎劑?)將厚樸水煎劑加熱至90 100°C去除水分，完全干燥后，將干燥產(chǎn)物粉碎；再按比例W V = Ikg 10 20L將干燥產(chǎn)物溶于體積分?jǐn)?shù)為2% 10%的吐溫(如Tween20) 中，即得到厚樸酚及和厚樸酚的混合物，其中Wiwffi W糖樸1.5 3.0 1。高效液相色譜檢測(HPLC)對本發(fā)明制備的厚樸制劑(實(shí)例1厚樸酚及和厚樸酚的混合物)進(jìn)行高效液相色譜檢測，檢測條件如下流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)50%乙腈的水溶液，C18色譜柱，柱溫40°C，檢測波長為^4nm。通過比較厚樸酚及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)與本發(fā)明制備的厚樸制劑樣品的HPLC檢測結(jié)果曲線，證明該厚樸制劑的主要成分為厚樸酚及和厚樸酚，按HPLC峰面積計(jì)算，厚樸酚及和厚樸酚混合物占提取物總量的68. 7%。與厚樸酚及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品對比，圖1 (C)的峰1為雜質(zhì)峰、峰2為和厚樸酚峰、峰3為厚樸酚峰。PTPlB抑制性的測定抑制性的測定原理PTPlB是一種去磷酸化酶，它可以使磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化。對硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)可以被PTPlB去磷酸化，變成對硝基苯酚，顏色呈黃色。檢測405nm處光吸收值的變化來間接檢測酶活性的變化情況。測定體系如下25mM嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)，ImM牛血清白蛋白(BSA)，ImM 二硫蘇糖醇(DTT)，0. ImM乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)，20mM對-硝基苯磷酸(p-NPP)，5ηΜΡΤΡ1Β，在 37°C 反應(yīng) 30min，加入 100 μ 1 0. 2Μ NaHCO3 終止反應(yīng)，在 405nm處測定光吸收的變化值。抑制性的測定方法各種物質(zhì)對PTPlB的抑制性的考察是通過測定半數(shù)抑制濃度(IC5tl)來衡量。將抑制組分按梯度進(jìn)行稀釋，將稀釋后的各個(gè)梯度加入如上面所說的反應(yīng)體系中，于405nm測定37°C，30min內(nèi)光吸收的變化值之后，將各個(gè)梯度的吸收值與未加抑制組分的相除，得出的數(shù)值為抑制百分?jǐn)?shù)，當(dāng)抑制率達(dá)到50%時(shí)，所對應(yīng)的稀釋梯度的倍數(shù)做為IC5(I。抑制性的考察標(biāo)準(zhǔn)將厚樸酚及和厚樸酚混合物、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品、和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品、厚樸酚及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物(W厚樸 ^mm= 2 1)用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇的水溶液配制成25mg/ml 的貯液。按梯度用蒸餾水稀釋，測定每個(gè)稀釋濃度對PTPlB的抑制率，以抑制劑的濃度(ug/ ml)為橫坐標(biāo)，以抑制劑對PTPlB的抑制率為縱坐標(biāo)作圖，得到抑制劑對PTPlB的IC5tl值。


圖1 厚樸提取物的高效液相色譜檢測圖(針對實(shí)施例1)；其中圖A為厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品，圖B為和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品，圖C厚樸提取物；圖2 實(shí)施例1制備的厚樸酚及和厚樸酚混合物對PTPlB的抑制率曲線；圖3 厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品對PTPlB的抑制率曲線；圖4 和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品對PTPlB的抑制率曲線；圖5 厚樸酚及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物(Wffttffi 2 1)對PTPlB的抑制
率曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 厚樸酚及和厚樸酚提取實(shí)例將干燥厚樸皮Ikg裝入三角燒瓶中，然后用V￥e V7k= 95 5的混合提取液 IOL在50°C水浴溫度下，冷凝水回流提取，提取3次，在45°C水浴溫度下濃縮得甲醇提取物140mg ；然后將甲醇提取物溶解在250ml蒸餾水中，在水相中按體積比1 1的比例加入正己烷250ml萃取，萃取3次，保留水相。在水相中按體積比1 1的比例加入二氯甲烷 250ml，萃取3次，保留水相。在水相中按體積比等于1 1的比例加入乙酸乙酯250ml，萃取3次；在45°C水浴溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去乙酸乙酯，得乙酸乙酯層濃縮物6. 8g，即為厚樸酚及和厚樸酚的混合物，收率為0. 68%，經(jīng)高效液相色譜檢測，其中厚樸酚含量為0.四％，和厚樸酚的含量為0. 18%。
實(shí)施例2 將厚樸干燥后研磨粉碎，通過40目篩過濾，得到厚樸干粉。將厚樸干粉Ikg加入到 10L、體積濃度為95%的乙醇的水溶液中浸泡并攪拌，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分，攪拌2小時(shí)， 過濾去除殘?jiān)玫胶駱愕囊掖冀菀杭s10L。將溶液中的乙醇蒸發(fā)去除，得到粘稠的厚樸浸膏。將浸膏加熱100°C干燥以去除剩余乙醇，得到厚樸干粉120mg ；再將厚樸干粉與蒸餾水按W V=Ikg IOL進(jìn)行浸泡并攪拌，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為200轉(zhuǎn)/分，2小時(shí)后，過濾去除殘?jiān)?得到厚樸水煎劑。將上述厚樸水煎劑加熱至100°C去除水分；完全干燥后，將干燥的水提取物粉碎，稱重為6. 2g，收率為0. 62%，經(jīng)高效液相色譜檢測，其中厚樸酚含量為0. 33%，和厚樸酚的含量為0. 12%。按比例W V = Ikg IOL溶于體積濃度為4%的吐溫20水溶液中，該液體即為厚樸酚及和厚樸酚的混合物。實(shí)施例3 厚樸酚及和厚樸酚對PTPlB抑制效果檢測將厚樸酚及和厚樸酚混合物(針對實(shí)施例1)、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品、和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品、厚樸酚及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物(Wffttffi ^mm= 2 1)用體積濃度為50%乙醇的水溶液配制成25mg/ml的貯液。再用蒸餾水稀釋成不同濃度的溶液(1000ug/ml、800ug/ml、500ug/ ml、300ug/ml、200ug/ml、150ug/ml、lOOug/ml、50ug/ml、20ug/ml、lOug/ml、5ug/ml)，測定每個(gè)稀釋濃度對PTPlB的抑制率，以抑制劑的濃度(ug/ml)為橫坐標(biāo)，以抑制劑對PTPlB 的抑制率為縱坐標(biāo)作圖，得到厚樸酚及和厚樸酚混合物(針對實(shí)例1)對PTPlB的IC5tl為 60. 77ug/ml、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品對PTPlB的IC5tl為203. ^ug/ml、和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品對PTPlB的IC5tl 為95. 14ug/ml、厚樸酚及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物(Wiwffi Wwffttffi= 2 1)對PTPlB的IC5tl 為58. 70ug/ml。說明厚樸提取物中對PTPlB酶活具有抑制效果的確實(shí)是厚樸酚及和厚樸酚的混合物，而單一的厚樸酚或和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品對PTPlB酶活的IC5tl值均較二者混合后的 IC5tl值要高，將厚樸酚與和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品按Wffi卜 ^mm= 2 1混合后，所測得的IC5tl 值與實(shí)例1所得混合物對PTPlB IC5tl值相當(dāng)，這說明厚樸酚及和厚樸酚對PTPlB的抑制存在一定的協(xié)同效應(yīng)，將二者混合后對PTPlB酶活具有更好的抑制效果。
權(quán)利要求
1.厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB抑制劑方面的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB抑制劑方面的應(yīng)用，其特征在于用于制備治療和預(yù)防與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB活力過高或過表達(dá)相關(guān)疾病的食品、藥物或食品及藥物組合物。
3.如權(quán)利要求1所述的厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB抑制劑方面的應(yīng)用，其特征在于，厚樸酚及和厚樸酚是由如下步驟制備1)將干燥厚樸皮裝入三角燒瓶中，然后用甲醇與水混合提取液在45 55°C水浴溫度下冷凝水回流提取，提取3 5次，將最后得到的提取液在40 50°C水浴溫度下濃縮得甲醇提取物；2)將步驟1)的甲醇提取物溶解在是其體積1 3倍量的蒸餾水中，再加入與蒸餾水等體積的正己烷進(jìn)行萃取，萃取3 5次，保留水相；3)在步驟幻的水相體系中，加入與水相體系等體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取3 5 次，保留水相；4)在步驟幻的水相體系中加入與水相體系等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3 5 次，然后在40 50°C水浴溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去乙酸乙酯，從而得到乙酸乙酯層濃縮物，即為厚樸酚及和厚樸酚的混合物，其中^mm W和厚樸1.5-2.5 1。
4.如權(quán)利要求1所述的厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB抑制劑方面的應(yīng)用，其特征在于干燥厚樸皮與混合提取液的用量比例為W V = Ikg 10 15L，甲醇與水組成的混合提取液中，按體積百分比計(jì)算Vmi V水=90 95 10 5。
5.如權(quán)利要求1所述的厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB抑制劑方面的應(yīng)用，其特征在于，厚樸酚及和厚樸酚是由如下步驟制備1)將厚樸干燥后研磨粉碎，通過40 60目篩過濾，得到厚樸干粉；2)將步驟1)厚樸干粉與體積分?jǐn)?shù)為70% 95%的乙醇水溶液按W V = Ikg 10 20L進(jìn)行浸泡并攪拌1 3小時(shí)，攪拌速度為60 300轉(zhuǎn)/分，然后過濾去除殘?jiān)?，得到厚樸的乙醇浸泡液；再將浸泡液中的乙醇蒸發(fā)去除，得到粘稠的厚樸浸膏；3)將步驟2)厚樸浸膏加熱80 100°C，干燥去除剩余乙醇，得到厚樸干粉；再將厚樸干粉與蒸餾水、純凈水或去離子水按W V = Ikg 10 20L進(jìn)行浸泡并攪拌1 3小時(shí)， 攪拌速度為60 300轉(zhuǎn)/分，然后過濾去除殘?jiān)玫胶駱闼鍎?)將步驟幻厚樸水煎劑加熱至90 100°C去除水分，完全干燥后，將干燥產(chǎn)物粉碎； 再按比例W V = Ikg 10 20L將干燥產(chǎn)物溶于體積分?jǐn)?shù)為2% 10%的吐溫中，即得到厚樸酚及和厚樸酚的混合物，其中^mm W和厚樸1.5-3.0 1。
全文摘要
厚樸酚及和厚樸酚在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B抑制劑中的應(yīng)用，屬于酪氨酸磷酸酶抑制技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的厚樸酚及和厚樸酚是以厚樸為原料，通過萃取的方法從厚樸中提取得到的天然產(chǎn)物；經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明其可以抑制人蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B的生物活性，可用于PTP1B活力過高或過表達(dá)所引起的相關(guān)疾病的輔助治療，從而用于制備治療和預(yù)防與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B活力過高或過表達(dá)相關(guān)疾病的食品、藥物或食品及藥物組合物。
文檔編號A23L1/30GK102240274SQ20111012282
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者付學(xué)奇, 尹艷春, 李婉南, 胡鑫, 邢述, 馬俊鋒 申請人:吉林大學(xué)