專利名稱：基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor及其dsRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段 ADP-r ibosy Iat ion factor 及其 dsRNA。
背景技術(shù)：
在我國，化學(xué)藥劑連續(xù)單一長(zhǎng)期使用已導(dǎo)致灰飛虱對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性，需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達(dá)到滿意的防治效果，造成了更為嚴(yán)重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外灰飛虱傳播條紋病毒引起的水稻條紋葉枯病，發(fā)病后藥劑控制效果較差， 只能依靠治蟲防病。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，急需化學(xué)農(nóng)藥之外的替代防治手段。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對(duì)的方式與蛋白編碼基因結(jié)合，根據(jù)序列配對(duì)的程度降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動(dòng)物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理獎(jiǎng)。在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，則會(huì)引起害蟲的致畸或致死，從而達(dá)到控制害蟲的目的。本專利發(fā)明就是利用實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經(jīng)干擾后能夠?qū)е禄绎w虱死亡的重要基因，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供序列和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種灰飛虱致死基因片段 ADP-r ibosy Iat ion factor 及其克隆方法。本發(fā)明的另一方法是提供該致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA及其合成方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種用于篩選致死基因的dsRNA喂食法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor，序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的克隆方法，包括如下步驟(1)取灰飛虱，提取總RNA，以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈；(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID N0. 2的上游引物Pl、序列為SEQ ID N0. 3的下游引物P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段；(4)將回收的目標(biāo)DNA片段在T3連接酶作用下插入至pEASY_T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl，涂于含有x-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜；(5)通過挑選白 色單菌落，篩選陽性重組子；(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒；(7)全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID NO. 1所示的ADP-ribosylation factor 基因片段。其中，所述的RT-PCR擴(kuò)增體系為反應(yīng)緩沖液5μ L，Mg2+4y L，dNTP 4μ L，cDNA模板 2yL，上游引物 Pl lyL，下游引物 P2 1 μ L，R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L?；绎w虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor 的 dsRNA，序列如 SEQ ID Ν0· 4所不。所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA的合成方法， 是以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID W). 5的上游引物P3、序列為SEQ ID N0. 6的下游引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的 dsRNA。所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA的合成方法優(yōu)選包含如下步驟(1)根據(jù)已經(jīng)驗(yàn)證的ADP-ribosylation factor基因片段序列，設(shè)計(jì)并合成序列為SEQ ID N0. 5的引物3和序列為SEQ ID N0. 6的引物4，以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板 PCR擴(kuò)增得到灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA，PCR體系為反應(yīng)緩沖液 5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上游引物 Ρ3 2 μ L，下游引物 P4 2 μ L， ExTap 酶 0. 25 μ L, ddH20 30. 75 μ L，共 50 μ L ；PCR 條件為94°C 變性 2min，94°C 30sec, 55-62°C 30sec,72°C 30sec，38 個(gè)循環(huán)，72°C延伸。(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離；(3)回收目標(biāo)DNA產(chǎn)物。一種灰飛虱的dsRNA喂食方法，包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將玻
璃管另一端封好；(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的封口膜， 貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個(gè)新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛虱的趨光習(xí)性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。其中所述的dsRNA優(yōu)選所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的 dsRNA。有益效果利用RNAi技術(shù)沉默ADP-ribosylation factor基因，對(duì)灰飛虱具有明顯的致死效果，說明該基因可作為利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的有效靶點(diǎn)。本發(fā)明合成的ADP-ribosylation factor基因dsRNA能有效沉默 ADP-ribosylation factor基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同時(shí)合成成本較低，便于大量實(shí)驗(yàn)或商業(yè)化使用。本發(fā)明采用改進(jìn)的喂食法進(jìn)行RNAi干擾實(shí)驗(yàn)，相對(duì)注射法，減少了蟲體的機(jī)械損傷，更加便于實(shí)驗(yàn)操作。最終通過喂食實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 ADP-ribosylation factor基因的RNAi 對(duì)灰飛虱具有致死效果，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供新的實(shí)驗(yàn)手段。


圖 IdsRNA 合成電泳圖，泳道 1 =Marker,泳道 2 ADP-ribosylation factor 的 dsRNA。圖2dsRNA喂食實(shí)驗(yàn)致死率統(tǒng)計(jì)圖?！?”表示該系數(shù)在0. 05顯著性水平上是可以接受的，也就是說，該系數(shù)的可靠度在95%以上；“**”表示該系數(shù)在0. 01的顯著性水平上可以接受，即它的可靠度在99%以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11. ADP-ribosylation factor 基因片段的克隆方法(1)取灰飛虱10-20頭，用TRIzoI法提取總RNA ；
(2)合成cDNA第一條鏈；(3)從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組中獲取基因片段序列，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/進(jìn)行同源性比對(duì)之后，預(yù)測(cè)為灰飛虱ADP-ribosylation factor基因，利用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)Pl和P2，以RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增；上游引物(Pl)5' TGAAGGCAGTCAGGAAA 3' (SEQ ID N0. 2)，下游引物(P2)5' TAGGCTTATTATCACCACAAC 3' (SEQ ID N0. 3)；PCR 條件為94°C變性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸PCR 反應(yīng)體系(50 μ L)
反應(yīng)緩沖液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上游引物PlΙμ
下游引物P 2Ιμ
R- Tag 酶0.5μ
ddH2032.5μ
總體積50μ
(4) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段；(5)將回收的目標(biāo)片段在T3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl，涂于含x-gal 0. 02g/ml、IPTGO. 2g/ml以及氨芐青霉素50ng/ml的LB培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)，過夜；(6)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(7)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒；(8)全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)，即可得到SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列的ADP-ribosylation factor基因片段。實(shí)施例2. dsRNA合成及回收(1)根據(jù)已經(jīng)驗(yàn)證的ADP-ribosylation factor基因片段序列，采用 Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)P3和P4，在上下游引物5，端加入T7啟動(dòng)子序列 TAATACGACTCACTATAGGG ；上游引物(P4):5'TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGGCAGTCAGGAAA 3' (SEQ ID NO. 5)上游引物(P5):5'TAATACGACTCACTATAGGGTAGGCTTATTATCACCACAAC 3 ‘ (SEQ IDN0. 6)
反應(yīng)緩沖液5 μιMg2+4μLdNTP4μLcDNA模板2μL上游引物P32μL下游引物P42μLEx Tap 酶0.25μ ddH2030.75μ 總體積50μ PCR 條件94°C變性 2min，94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，38 個(gè)循環(huán)，72°C延伸。(2) PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離并在紫外燈下進(jìn)行觀察， 結(jié)果見圖1，其序列見SEQ ID N0. 4。(3)采用 Promega 公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒進(jìn)行回收①對(duì)分離得到的目標(biāo)片段切膠，并放入稱量過重量(a)的1. 5ml微量離心管中，再次稱量(b)，b-a算得所切膠重；②根據(jù)膠重，每IOmg凝膠加入10 μ L Membrane Binding Solution。凝膠重量不超過350mg ；③將凝膠放入50_65°C水浴鍋中水浴IOmin或者直到凝膠完全融化；
7
④將試劑盒中的濾管放置在配套的收集管中，轉(zhuǎn)移融化的凝膠液體至濾管中，室溫放置Imin ；⑤16，000 Xg (14，OOOrpm)離心lmin，棄去收集管中的液體；⑥力口入 700 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心lmin，棄去收集管中的液體；⑦力口入 500 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精)， 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心5min，棄去收集管中的液體；⑧不加液體空轉(zhuǎn)Imin ；⑨轉(zhuǎn)移濾管到1. 5ml微量離心管中，加入50 μ 1 Nuclease-Free Water，室溫放置 lmin, 16，000 Xg (14，OOOrpm)離心 Imin ；⑩收集到的DNA產(chǎn)物保存在4°C或_20°C。實(shí)施例3. dsRNA喂食實(shí)驗(yàn)(1)將玻璃管的一端用封口膜封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將另一端封好；(2)將蟲子輕輕用手拍打至一端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的封口膜貼紙的一面朝上，均勻用力向兩側(cè)拉，拉成正方形，然后蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置在超凈臺(tái)面上；(3)用移液槍吸取飼料100 μ 1滴在封口膜的中央，對(duì)照只加飼料(配方見表1)， 處理組在飼料中加入ADP-ribosylation factor基因的dsRNA，dsRNA的濃度為4337ng/ μ 1，用一個(gè)新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛虱的趨光習(xí)性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次飼料和dsRNA ；(5)連續(xù)喂食五天，每24h統(tǒng)計(jì)一次死亡率，結(jié)果見圖2，由圖2可見喂食致死基因 ADP-ribosylation factor的dsRNA能夠達(dá)到很好的致死效果。表 1組分mg / IOOml組分mg / 100mlI.氨基酸L-Leu (亮)240L-Gln (谷氨酰胺)240L-Cyss (胱)20L-His (組)80L-Tyr (酪)10L-Met (甲硫)70L-Glu (谷)250L-Ilc (異亮)100L-Gly (甘)30L-Pro (脯)10 L-Ala (丙)130L-Lys (賴)200L-Arg (精)175L-Phe (苯丙)20 L-Asn (天冬酰胺)220L-Ser (絲)400L-Asp (天冬氨酸)100L-Thr (蘇)130L-Cys (半胱)80L-Trl (色)105L-val (纈氨酸)300L-GABA (氨基丁酸)10II.維生素ΠΙ.無機(jī)鹽生物索0.05CaCl2 2H203.115泛酸鈣5CuCl2 2H200.268氯化膽堿60FeCl3 GR2O2.228葉酸2.5MnCl2. 4H200.793肌醇50ZnCl20.396煙酸15MgCl2. 6H2020 VB62.5KH2PO4500核黃素2IV.其它硫胺素2.5蔗糖(g)9Vc100PH6.8
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權(quán)利要求
1.灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的克隆方法，其特征在于包括如下步驟(1)取灰飛虱，提取總RNA，以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈；(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQID NO. 2的上游引物Pl、序列為SEQ ID NO. 3的下游引物P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)DNA片段；(4)將回收的目標(biāo)DNA片段在T3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl，涂于含有X-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，過夜；(5)通過挑選白色單菌落，篩選陽性重組子；(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取克隆質(zhì)粒；(7)全自動(dòng)序列儀進(jìn)行測(cè)序，得到SEQID NO. 1所示的ADP-ribosylation factor基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的克隆方法，其特征在于所述的RT-PCR擴(kuò)增體系為反應(yīng)緩沖液5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA模板 2μ L，上游引物 1μ L，下游引物 1μ L，R-Tag 酶 0. 5μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L ； PCR 條件為94°C變性 2min，94°C 30sec，55_62°C 30sec,72°C 30sec，38 個(gè)循環(huán)，72°C延伸。
4.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的dsRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的dsRNA的合成方法，其特征在于以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板，以序列為SEQ ID NO. 5的上游引物P3、序列為SEQ ID N0.6的下游引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到灰飛虱致死基因片段 ADP-ribosylation factor 白勺 dsRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的dsRNA的合成方法，其特征在于包含如下步驟(1)根據(jù)已經(jīng)驗(yàn)證的ADP-ribosylationfactor基因片段序列，設(shè)計(jì)并合成序列為SEQ ID NO. 5的P3和序列為SEQ ID NO. 6的P4，以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板PCR擴(kuò)增得到灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA，PCR體系為反應(yīng)緩沖液5 μ L， Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L，cDNA 模板 2 μ L ；上游引物 2 μ L，下游引物 2 μ L，Ex Tap 酶 0. 25 μ L， ddH20 30. 75 μ L,共 50 μ L ；PCR 條件為94 "C 變性 2min，94 "C 30sec，55-62 "C 30sec, 72°C 30sec，38 個(gè)循環(huán)，72°C延伸；(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離；(3)回收目標(biāo)DNA產(chǎn)物。
7.一種灰飛虱的dsRNA喂食方法，其特征在于包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好，用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi)，用紗布將玻璃管另一端封好；(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端，將另一端的紗布取下，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的封口膜，貼紙的一面朝上，蓋到玻璃管管口上，將管豎立放置；(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央，用一個(gè)新的封口膜，貼紙的一面朝下，貼在玻璃管管口上，將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間；(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上，房間溫度為26°C，利用灰飛虱的趨光習(xí)性僅在飼料端給予光照，使其趨食飼料，每24h換一次含dsRNA的飼料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的dsRNA喂食方法，其特征在于所述的dsRNA為權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor及其dsRNA。本專利發(fā)明就是利用實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經(jīng)干擾后能夠?qū)е禄绎w虱死亡的序列如SEQ ID NO.1所示的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor，利用該基因片段的dsRNA喂養(yǎng)灰飛虱，能夠達(dá)到很好的致死效果，為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供序列和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102220342SQ20111012301
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者姜衛(wèi)華, 李國清, 李飛, 董雙林, 韓召軍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)