專利名稱：一種培育雄性不育植物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培育雄性不育植物的方法。
背景技術：
水稻是世界上種植范圍最廣泛的作物之一，全世界有110多個國家種植水稻，有一半以上的人口以大米為主食。自20世紀70年代以來，雜交水稻的推廣和應用，為中國乃至世界的糧食增產做出了巨大的貢獻，對未來解決人類的食物安全問題具有重要意義。雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎，對于雄性不育遺傳機理的準確把握是雜種優(yōu)勢有效利用的前提。水稻雄性不育包括細胞核不育和核質互作不育，生產上利用的主要是核質互作型雄 性不育和光溫敏核不育。目前，關于水稻雄性不育的遺傳研究報道較多，特別是隨著分子生物學的研究進展，分子標記和QTL等分子技術的不斷成熟和應用，水稻雄性不育的遺傳機理研究不斷得到深化，為傳統(tǒng)育種和分子育種進一步結合奠定了堅實的基礎。通過傳統(tǒng)方法獲得的不育系受到生殖隔離和雜交不親和的限制，使雜交優(yōu)勢得不到充分利用。在作物育種工作面臨著嚴峻挑戰(zhàn)的時刻，植物基因工程的興起為人類開辟了一條改良作物創(chuàng)造新品種的途徑?；蚬こ谭椒ú皇苌掣綦x和雜交親和性的限制，可向優(yōu)良品種中轉移單一或少數(shù)基因一般不影響原有優(yōu)良性狀的遺傳和表達，可避免傳統(tǒng)雜交育種的不利性狀連鎖和遠緣雜交分離的現(xiàn)象，而且具有兩系的特點，這些都是傳統(tǒng)雜交方法無法比擬的。隨著人們對植物生殖發(fā)育的分子生物學及雄性不育機理研究的深入，利用基因工程創(chuàng)造雄性不育系成為作物雜交育種的迫切需要。雖然利用基因工程創(chuàng)造水稻雄性不育系的工作還存在許多問題，但從目前的技術以及所取得的結果說明此途徑是完全可行的，且由于其無可比擬的優(yōu)越性而具有廣闊的應用前景。相信隨著分子生物學技術的發(fā)展和完善，以及對植物生殖發(fā)育的分子機制研究的進一步深入，并將其與傳統(tǒng)的育種方法相結合，一定能創(chuàng)造出新的、穩(wěn)定的、完全不育系和恢復系，從而將植物雜交優(yōu)勢的利用引向更高的水平。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種培育雄性不育植物的方法。本發(fā)明提供的培育轉基因植物的方法，是將OsSUIl蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到雄性育性低于所述目的植物的轉基因植物；所述OsSUIl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物雄性育性相關的由序列I衍生的蛋白質。為了使(a)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
標簽殘基序列
Poly-Arg5-6(通常為 5個)RRRRR
Poly-His2-10(通常為 6 個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾 個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標簽的編碼序列得到。所述OsSUIl蛋白的編碼基因可為如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列2自5’末端第75至806位核苷酸所不的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在O. IXSSPE(或O. I X SSC), O. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述編碼基因可通過含有所述編碼基因的重組表達載體導入所述目的植物中?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述編碼基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述編碼基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用所述編碼基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
所述重組表達載體可為將含有所述編碼基因的表達盒插入雙元表達載體pCAMBIA1300的多克隆位點得到的重組質粒。所述重組表達載體具體可為將所述編碼基因插入重組質粒pMD18-T_0sSni的CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間得到的重組質粒；所述重組質粒pMD18-T_0sSni具體可為將載體PJIT163的Kpn I與Xho I酶切位點間的小片段插入雙元表達載體PCAMBIA1300得到的重組質粒。含有所述編碼基因的重組表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導、基因槍等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻。所述水稻具體可為粳稻(如品種309)或秈稻(如品種-11)。本發(fā)明還保護所述OsSUll蛋白或所述OsSUll蛋白的編碼基因在培育雄性不育植物中的應用。所述應用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體 可為水稻。所述水稻具體可為粳稻(如品種309)或秈稻(如品種-U)。本發(fā)明還保護一種重組表達載體，它構建方法包括如下步驟(I)將載體PJIT163的Kpn I與Xho I酶切位點間的小片段插入雙元表達載體PCAMBIA1300，得到重組質粒 pMD18-T_0sSUIl ；(2)將權利要求2或3所述基因插入重組質粒pMD18-T_0sSni的CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間，得到所述重組表達載體。研究表明，OsSni基因與花藥的發(fā)育調控有密切關系，過表達OsSUIl基因可引起花粉不育，而對其他器官的營養(yǎng)生長不產生負面作用，所以OsSUll基因可用于培育雄性不育系，并為將來更廣泛的應用雜種優(yōu)勢提高作物產量奠定技術基礎。


圖I為實施例2的步驟一中PCR擴增產物的電泳圖；M代表Marker ;1和2代表PCR擴增產物。圖2為實施例2的步驟一中陽性質粒的酶切鑒定電泳圖；M =Marker ;1、2、3分別代表不同的陽性質粒。圖3為雙元表達載體pCAMBIA1300的結構示意圖。圖4為載體PJIT163的結構示意圖。圖5 為重組質粒 pCAMBIA1300-163-0sSUIl 的 HindIII 酶切鑒定圖；M =Marker ；1-4 :重組質粒 pCAMBIA1300-163-0sSUIl。圖6為實施例2的步驟三中潮霉素基因特異引物對鑒定陽性植株(Ttl代)的電泳圖；M代表Marker ;1_7分別代表不同陽性植株；8代表粳稻品種臺北309 ；9代表重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSUIl。圖7為實施例2的步驟三中OsSUIl基因特異引物對鑒定陽性植株(Ttl代)的電泳圖；M代表Marker ；1代表粳稻品種臺北309 ；2~9分別代表不同Ttl代陽性植株；10代表重組質粒 pCAMBIA1300-163-0sSUIl。圖8為實施例2的步驟三中轉OsSUIl基因植株的Southern鑒定圖；CK :代表重組質粒 pCAMBIA1300-163-0sSUIl ;TB-2、TB-3、TB_4 和 TB-5 均代表轉 OsSUIl 基因植株；箭頭所指為雜交信號。圖9為實施例2的步驟三中轉OsSUIl基因植株與臺北309的植株照片。圖10為實施例2的步驟三中轉OsSUIl基因植株與臺北309的花藥碘染結果。圖11為實施例2的步驟四中潮霉素基因特異引物對鑒定陽性植株(TciR)的電泳圖；M代表Marker ;空白代表代表空白對照(以水為模板)；野生型代表秈稻品種93-11 ；1-7分別代表不同Ttl代陽性植株；陽性代表重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSni。圖12為實施例2的步驟四中OsSUIl基因特異引物對鑒定陽性植株(I；代)的電泳圖；M代表Marker ;1-7分別代表不同Ttl代陽性植株；8代表重組質粒 pCAMBIA1300-163-0sSUIl ；9代表秈稻品種93-11 ；10代表空白對照(以水為模板)。圖13為實施例2的步驟四中轉OsSUIl基因植株與93-11的植株照片；WT :野生型植株；το :轉基因植株。圖14為實施例2的步驟四中轉OsSUIl基因植株與93-11的花藥碘染結果；WT :野生型植株；το :轉基因植株。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。大腸桿菌DH5a :天根生化科技(北京)有限公司，CB101-01。水稻品種培矮64S :公眾可以從中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所獲?。粎⒖嘉墨I羅孝和，邱趾忠，李任華.導致不育臨界溫度低的兩用核不育系培矮64S.雜交水稻，1992，(I) :27-29。粳稻品種臺北309 :公眾可以從中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所獲??；參考文獻曹孟良，農桿菌介導的水稻高效遺傳轉化體系的建立.湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)·1999，25(5) :349-356。秈稻品種93-11 :公眾可以從中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所獲??；參考文獻朱立煌，超級雜交水稻LYP9及其親本的轉錄組學研究.中國基礎科學.2010,4 :20-22。雙元表達載體pCAMBIA1300 :CambiaLabs, http://www. cambia. org/daisy/bioforge_legacy/3725. html。載體PJIT163 :公眾可以從中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所獲?。粎⒖嘉墨IGuerineau F,Lucy A,MulIineaux P. Effect of two consensus sequences precedingthetranslation initiator codon on gene expression in plant protoplasts. PlantMolBiol, 1992，18(4) :815-818. (http://www. pgreen, ac. uk/JIT/JIT_fr. htm)。農桿菌菌株EHA105 :公眾可以從中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所獲?。粎⒖嘉墨I劉曉敏，張莉弘，劉金亮，魏毅，潘洪玉，張世宏.玉米逆境誘導型啟動子克隆及其植物表達載體構建·生物技術通報.2011，3 :86-90.。實施例I、OsSUIl蛋白及其編碼基因(OsSUIl基因)的序列分析OsSUIl蛋白(由243個氨基酸殘基組成)，如序列表的序列I所示，包含有SUIl結構域的保守序列(自N末端第139-243位氨基酸殘基)。OsSUIl基因，全序列如序列表的序列2所示(90ibp)，開放閱讀框為序列表的序列2自5’末端第75至806位核苷酸(732bp)，位于水稻4號染色體上，不含內含子。實施例2、轉基因植物的獲得一、OsSUIl 基因(cDNA)的克隆I、采用TRIzol試劑提取水稻品種培矮64S的總RNA。2、反轉錄反應取2yg步驟I的總RNA，加入O. 5yg/yL Oligo(dT) I μ L，加入去離子水補足到 12μ L，70°C保溫 5min 后，依次加入 5XRT buffer 4μ L,20U/y L RNase 抑制劑 I μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L，37°C保溫5min后加入200U/μ L M-MLV反轉錄酶I μ L，反應終體積為20 μ L0 42°C反應60min，70°C加熱IOmin終止反應，得到cDNA。3、PCR體外擴增以步驟2的cDNA為模板，用OsSUIl-F和OsSUIl-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。OsSUIl-F :5’ -ACT TGG ACT CCT CGG CTT GAA C-3，；OsSUIl-R :5’ -CGA CAC ACT GCT AAA CTG AAC C-3，。PCR 體系(50 μ I) :GC XBuffer 溶液 25 μ 1，dNTP Mixture 8μ I, LA Taq 聚合酶(TaKaRa) O. 5 μ I, OsSUIl-F(IOnmol) 2 μ I，OsSUII-R(IOnmol) 2 μ l，cDNA 模板 3. 5 μ LddH2O 9 μ I。PCR 程序95°C預變性 6min ;94°C變性 30s，56°C退火 40s，72°C延伸 lmin，35 個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖I。4、PCR產物的純化在紫外光照射下切膠，利用凝膠回收試劑盒(天為時代)回收瓊脂糖凝膠上的目的基因片段(約900bp)。5、DNA連接反應將步驟4回收的目的基因片段與pMD18-T Vector (TaKaRa)連接，得到連接產物。6、轉化大腸桿菌(熱激法)無菌條件下取5 μ I步驟5的連接產物與大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞輕輕混勻，冰浴30min，42°C熱激90s，將離心管迅速轉到冰浴中放置2_3min。加入LB培養(yǎng)基800 μ 1，37°C搖床(100-160rpm)，溫和搖振Ih左右。在LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μ g/ml)上加入X-Gal和IPTG涂勻，然后涂布200 μ I培養(yǎng)液，37°C倒置培養(yǎng)12_16h。7、陽性克隆的篩選及鑒定LB固體培養(yǎng)基上長出許多的藍色和白色菌斑，待菌斑長到合適大小時，用滅菌的芽簽挑取幾個白斑(陽性克隆)，分別于LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μ g/m)中振蕩培養(yǎng)12-16h，進行擴大培養(yǎng)。堿裂解法分別提取擴大培養(yǎng)后的陽性克隆的質粒。用限制性內切酶HindIII和EcoR I雙酶切質粒，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳顯示約2692bp和約901bp條帶的質粒為酶切鑒定陽性質粒。部分陽性質粒的酶切產物電泳圖見圖2。將陽性質粒進彳丁測序，測序結果表明，序列表的序列2所不的DNA (OsSUII基因cDNA)插入了 pMD18-T Vector，即得到了重組質粒 pMD18-T_0sSUIl。二、重組表達載體的構建I、用限制性內切酶Kpn I與Sal I雙酶切雙元表達載體pCAMBIA1300 (結構示意圖見圖3)，回收載體骨架(約8930bp)。2、用限制性內切酶Kpn I與Xho I載體PJIT163 (結構示意圖見圖4)，回收小片段(約2193bp)，該小片段中含有2XCaMV35S啟動子和CaMV35S終止子。3、將步驟I的載體骨架和步驟2的小片段連接(Sal I與Xho I為同尾酶)，得到 重組質粒 PCAMBIA1300-163。4、用限制性內切酶Sal I與Smal I雙酶切重組質粒pCAMBIA1300_163，回收載體骨架(約 10450bp)。5、用限制性內切酶Sal I與Smal 1雙酶切重組質粒？]\0)18-1'-085耵1，回收085瓜1片段(約901bp)。6、將步驟4的載體骨架和步驟5的OsSUIl片段連接，得到重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSUIl。7、將重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSUIl用HindIII單酶切，酶切產物的電泳圖見圖5，得到了約ISOObp的目的條帶。三、轉基因植物的獲得和鑒定(以粳稻品種臺北309為受體植物)I、轉基因植物的獲得(I)將重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSUIl導入農桿菌菌株EHA105，得到重組農桿菌。(2)將步驟(I)的重組農桿菌與粳稻品種臺北309愈傷組織共培養(yǎng)3天，用50mg/L潮霉素進行抗生篩選，分化、生根后得到陽性植株(Ttl代)。2、轉空載體植物的獲得(I)將重組質粒pCAMBIA1300-163導入農桿菌菌株EHA105，得到重組農桿菌。(2)將步驟(I)的重組農桿菌與粳稻品種臺北309愈傷組織共培養(yǎng)3天，用50mg/L潮霉素進行抗生篩選，分化、生根后得到對照植株(Ttl代)。3、轉基因植物的分子鑒定(I) PCR 鑒定CATA法提取陽性植株(Ttl代)或對照植株(Ttl代)葉片的基因組DNA，作為模板進行PCR鑒定。PCR鑒定分別采用潮霉素基因特異引物對(hpt-F和hpt-R ;靶序列約504bp)和OsSUIl基因特異引物對(OsSUI I-F和OsSUI l_ter_R ;為避免水稻自身同源基因的擴增，OsSUIl-F為基因特異引物，OsSUIΙ-ter-R為載體終止子特異引物；靶序列約580bp)。hpt-F(上游引物)5' -ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3'；hpt-R(下游引物)5' -CTGCTCCATACAAGCCAACC-3'。OsSUIl-F(上游引物)5，-GCG AGT ACA ACT ACG CCA AGG TGC TCC-3，；OsSUIl-ter-R(下游引物)5，_GCT CCA GGT TTA GTC GTC TCG TGT CTG GT-3，。潮霉素基因鑒定和OsSUIl基因鑒定的PCR體系(50 μ I) :10XBuffer溶液5 μ 1，dNTP 4 μ I, Tap DNA聚合酶 O. 5 μ 1，上游引物(IOpmol) 2 μ 1，下游引物(IOpmol) 2 μ 1，模板4 μ I, ddH20 32. 5 μ I。潮霉素基因鑒定的PCR程序94°C預變性5min ;94°C變性40s，57°C退火40s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0OsSUIl 基因鑒定的 PCR程序94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，62°C退火45s，72°C延伸45s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0潮霉素基因特異引物對鑒定陽性植株(TciR)的部分電泳圖見圖6。OsSUIl基因特異引物對鑒定陽性植株(TciR)的部分電泳圖見圖7。Ttl代陽性植株的PCR鑒定結果顯示共有6株Ttl代陽性植株潮霉素基因鑒定和OsSUIl基因鑒定均為陽性，為轉OsSUIl基因植株。但部分植株采用OsSUll基因特異引物對進行PCR擴增后，電泳顯示的擴增條帶較弱(見圖7的樣本2至4)。 T0代對照植株的PCR鑒定結果顯示共有8株Ttl代對照植株潮霉素基因鑒定為陽性，為轉空載體植株。(2) Southern 鑒定①制備探針以重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSUIl 為模板，用 OsSUIΙ-ter-F 和 OsSUIl-ter-R組成的引物對進行PCR擴增，制備Southern鑒定的探針。OsSUIΙ-ter-F :5’ -GCG AGT ACA ACT ACG CCA AGG TGC TCC-3’ ；OsSUIl-ter-R :5’ -GCT CCA GGT TTA GTC GTC TCG TGT CTG GT-3’。PCR 程序94°C 預變性 5min ;94°C 變性 30s，62 °C 退火 45s，72 °C 延伸 45s，共 35 個循環(huán)；最后在72°C下延伸lOmin。②Southern 鑒定提取轉OsSUI I基因植株苗期葉片的基因組DNA，用限制性內切酶EcoRV過夜酶切，然后依次進行電泳、轉膜和預雜交，然后用步驟I制備的探針65°C雜交16h，然后依次洗膜、顯色、終止反應并拍照。部分結果見圖8。6株轉OsSUIl基因植株中，3株為單拷貝目的基因植株(TB-2、TB-3和TB-4 ;分別對應圖7的樣本2至4)，另外3株為多拷貝目的基因植株(TB-5、TB-6 和 TB-7 ;TB_5 對應圖 7 的樣本 5)。(3)表型鑒定將成熟期的6 株 Ttl 代轉 OsSUIl 基因植株(TB-2、TB-3、TB-4、TB-5、TB_6 和 TB-7)、8株Ttl代轉空載體植株和8株野生型植株(臺北309 ；WT)分別進行表型觀察和雄性育性分析，雄性育性以花粉碘染率表征。各個轉OsSUIl基因植株、轉空載體植株均和臺北309生長表型一致。TB_5和臺北309的照片見圖9。TB-2的花粉碘染率為O %，TB-3的花粉碘染率為O %，TB-4的花粉碘染率為O %，TB-5的花粉碘染率為0%，TB-6的花粉碘染率為0%，TB-7的花粉碘染率為0%，8株臺北309的花粉碘染率均為95-99%，8株轉空載體植株的花粉碘染率均為95-99%。轉OsSUIl基因植株的花粉均表現(xiàn)高度不育。TB-5和臺北309的花藥進行碘染后的照片見圖10。四、轉基因植物的獲得(以秈稻品種93-11為出發(fā)植物)I、轉基因植物的獲得
(I)將重組質粒pCAMBIA1300-163-0sSUIl導入農桿菌菌株EHA105，得到重組農桿菌。(2)將重組農桿菌與秈稻品種93-11愈傷組織共培養(yǎng)3天，用50mg/L潮霉素進行抗生篩選，分化、生根后得到陽性植株(Ttl代)。2、轉空載體植物的獲得(I)將重組質粒pCAMBIA1300-163導入農桿菌菌株EHA105，得到重組農桿菌。(2)將步驟(I)的重組農桿菌與秈稻品種93-11愈傷組織共培養(yǎng)3天，用50mg/L潮霉素進行抗生篩選，分化、生根后得到對照植株(Ttl代)。3、轉基因植物的分子鑒定 (I) PCR 鑒定同步驟三的3的(I)。潮霉素基因特異引物對鑒定陽性植株(Ttl代)的部分電泳圖見圖11。OsSUIl基因特異引物對鑒定陽性植株(TciR)的部分電泳圖見圖12。鑒定結果顯示共有7株Ttl代陽性植株潮霉素基因鑒定和OsSUIl基因鑒定均為陽性，為轉OsSUIl基因植株。潮霉素基因特異引物對鑒定對照植株(Ttl代)的結果顯示共有8株Ttl代對照植株潮霉素基因鑒定為陽性，為轉空載體植株。(2)表型鑒定將成熟期的7株Ttl代轉OsSUIl基因植株、8株Ttl代轉空載體植株和8株和野生型植株(93-11 ；WT)分別進行表型觀察和雄性育性分析，雄性育性以花粉碘染率表征。各個轉OsSUII基因植株的生長表型一致，均略矮于93-11。一株轉OsSUII基因植株(對應圖12的樣本5)和93-11的照片見圖13。7株轉OsSUIl基因植株的碘染率分別為5%、I %、6%、4%、0%、I %和1%，8株臺北309的花粉碘染率均為95-99%，8株轉空載體植株的花粉碘染率均為95_99%。轉OsSUIl基因植株的花粉表現(xiàn)高度不育。一株轉OsSUIl基因植株(對應圖12的樣本5)和93-11的花藥進行碘染后的照片見圖14。
權利要求
1.一種培育轉基因植物的方法，是將OsSUll蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到雄性育性低于所述目的植物的轉基因植物； 所述OsSUIl蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物雄性育性相關的由序列I衍生的蛋白質。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述OsSUll蛋白的編碼基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列2自5’末端第75至806位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述編碼基因通過含有所述OsSUll蛋白的編碼基因的重組表達載體導入所述目的植物中。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為將含有所述OsSUll蛋白的編碼基因的表達盒插入雙元表達載體PCAMBIA13002的多克隆位點得到的重組質粒。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述重組表達載體是將所述OsSUll蛋白的編碼基因插入重組質粒pMD18-T-0sSHl的CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間得到的重組質粒；所述重組質粒pMD18-T-0sSHl是將載體pJIT163的Kpn I與XhoI酶切位點間的小片段插入雙元表達載體PCAMBIA1300得到的重組質粒。
6.如權利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
7.OsSUIl蛋白或OsSUIl蛋白的編碼基因在培育雄性不育植物中的應用； 所述OsSUIl蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物雄性育性相關的由序列I衍生的蛋白質。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述OsSUIl蛋白的編碼基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列2自5’末端第75至806位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.一種重組表達載體，它構建方法包括如下步驟(1)將載體PJIT163的KpnI與Xho I酶切位點間的小片段插入雙元表達載體PCAMBIA1300，得到重組質粒 pMD18-T_0sSUIl ； (2)將OsSUIl蛋白的編碼基因插入重組質粒pMD18-T-0sSni的CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間，得到所述重組表達載體； 所述OsSUIl蛋白的編碼基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 .1)序列表的序列2自5’末端第75至806位核苷酸所示的DNA分子； .2)序列表中序列2所示的DNA分子； .3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子; .4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物雄性育性相關蛋白的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育雄性不育植物的方法。本發(fā)明提供的方法，是將OsSUI1蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到雄性育性低于所述目的植物的轉基因植物；所述OsSUI1蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質。研究表明，OsSUI1基因與花藥的發(fā)育調控有密切關系，過表達OsSUI1基因可引起花粉不育，而對其他器官的營養(yǎng)生長不產生負面作用，所以OsSUI1基因可用于培育雄性不育系，并為將來更廣泛的應用雜種優(yōu)勢提高作物產量奠定技術基礎。
文檔編號C12N15/29GK102776202SQ201110123580
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權日2011年5月13日
發(fā)明者夏新界, 宋書鋒, 殷緒明 申請人:中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所