專利名稱：一種結(jié)合solid測(cè)序和單細(xì)胞rt-pcr的人抗體可變區(qū)獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類特異性抗體可變區(qū)序列獲取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種結(jié)合SOLID測(cè)序和單細(xì)胞RT-PCR的人抗體可變區(qū)獲取方法。
背景技術(shù)：
從2002年的SARS大規(guī)模爆發(fā)，到2008年EV71病毒引發(fā)的手足口病，再到2009年墨西哥甲型HlNl流感病毒引發(fā)的全球流感大流行，一旦爆發(fā)它們就很快在大范圍內(nèi)或全球蔓延。常規(guī)的抗病毒藥物開發(fā)是一個(gè)漫長的過程，無法在短時(shí)間內(nèi)滿足需要。而且，這些感染病菌的變異之快，使得我們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)找到行之有效的防控辦法變得越來越困難。對(duì)于這類病原體引發(fā)的爆發(fā)性、流行性疾病，非常迫切需要在很短時(shí)間內(nèi)找到有效的預(yù)防和治療方法?？贵w治療已成為多種疾病特異性治療的新型手段和發(fā)展方向。尤其是全人源化單克隆抗體與人體結(jié)合性最好，也是最安全和有效的單克隆抗體，必將代表未來抗體治療的發(fā)展方向。目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫篩選技術(shù)、基因工程小鼠制備全人抗體、轉(zhuǎn)染色體牛?？贵w庫篩選技術(shù)主要包括噬菌體抗體庫和核糖體展示技術(shù)。噬菌體抗體庫技術(shù)從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中分離抗體可變區(qū)基因；PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段(如VH、VL)，將體外擴(kuò)增的VH、VL基因片段隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體，形成組合文庫；將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因III (g3)或基因VIII (g8)的先導(dǎo)系列下游，使外源基因表達(dá)的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gp III或gp VIII的N端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合-洗脫-擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。核糖體展示技術(shù)將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對(duì)DNA進(jìn)行了特殊的加工與修飾，如去掉3'末端終止密碼子，核糖體翻譯到mRNA末端時(shí)，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA的3 '末端不脫離，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化，如固定在ELISA微孔或磁珠表面，含有目標(biāo)蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA板孔中或磁珠上被篩選出，對(duì)篩選分離得到的復(fù)合物進(jìn)行分解，釋放出的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，使目標(biāo)蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。上述全人源化抗體技術(shù)中，制備和生產(chǎn)流程復(fù)雜，需要時(shí)間和周期漫長，無法適用于某些突發(fā)、流行性疾病的抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)，且對(duì)某些病原體或抗原快速變異方面顯得無能為力。人源化抗體最關(guān)鍵的技術(shù)在于特異抗體可變區(qū)基因序列的擴(kuò)增。由于每個(gè)抗原有很多抗原決定簇，機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)針對(duì)不同的抗原決定簇產(chǎn)生不同的抗體，而且根據(jù)抗原決定簇的不同，所產(chǎn)生抗體與抗原的結(jié)合能力和抗體的效價(jià)也不相同。因此，要從成千上萬的抗體中將效價(jià)高，結(jié)合能力強(qiáng)的特異抗體的可變區(qū)基因挑選出來，傳統(tǒng)方法的工作量可想而知。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種結(jié)合SOLID測(cè)序和單細(xì)胞RT-PCR的人抗體可變區(qū)獲取方法，旨在結(jié)合傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)和高效的SOLID測(cè)序技術(shù)快速獲得人類抗體可變區(qū)序列。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種結(jié)合SOLID測(cè)序和單細(xì)胞RT-PCR的人抗體可變區(qū)獲取方法，其具體步驟如下(I)從特異免疫力供體獲取抗凝外周血；
(2)分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)；(3)以CDT和CD19+為gate對(duì)PBMCs進(jìn)行初次分選；(4)以CD27high和CD38high為gate對(duì)初次分選的細(xì)胞再次分選；(5)獲取具有抗體分泌功能的漿細(xì)胞，并稀釋成單細(xì)胞；(6)裂解單細(xì)胞并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得單細(xì)胞cDNA序列；(7) IgG/M特異引物PCR擴(kuò)增；(8) Barcoded Primers 測(cè)序引物 PCR 擴(kuò)增；(9) SOLID芯片測(cè)序，生物信息學(xué)分析，獲得抗體可變區(qū)基因序列。本發(fā)明帶來的有益效果是提供了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)，可廣泛用于獲取多種傳染性/感染性、腫瘤性疾病、自身免疫性疾病中特異性抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。特別是針對(duì)某些突發(fā)、重大流行性疾病，如SARS、禽流感等疾病時(shí)，該技術(shù)更能體現(xiàn)出其快速，高效的優(yōu)勢(shì)。此外，本發(fā)明也為全人源化抗體藥物的生產(chǎn)提供了一個(gè)有效手段。


圖I為人類抗體可變區(qū)擴(kuò)增圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。本發(fā)明的具體實(shí)施例為從具有特異免疫力的供體中獲取抗凝外周血，分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，首先以⑶3_、⑶19+為gate用流式細(xì)胞儀分選活的PBMCs，然后以CD27high、CD38high為gate對(duì)初次分選的細(xì)胞進(jìn)行再分選，最終獲得具有抗體分泌功能的漿細(xì)胞。將獲得的漿細(xì)胞稀釋成單個(gè)細(xì)胞，然后，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解，將單細(xì)胞mRNA進(jìn)行一次反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA序列，然后用我們?cè)O(shè)計(jì)的IgG/M特異引物群進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板，再用SOLID測(cè)序引物(Barcoded Primers)進(jìn)行一次PCR。該引物能同時(shí)攜帶96個(gè)不同標(biāo)記，即一次可以做96個(gè)不同細(xì)胞。最后我們?nèi)∵@些帶有標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行SOLID測(cè)序。這里的測(cè)序芯片可以分為單分區(qū)芯片，4分區(qū)芯片和8分區(qū)芯片，每個(gè)分區(qū)最多可以測(cè)序96個(gè)細(xì)胞，8分區(qū)芯片一次可以測(cè)序768個(gè)細(xì)胞。最后將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，即可獲得如圖I所示的人類抗體可變區(qū)基因序列。
以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明所揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限 定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合SOLID測(cè)序和單細(xì)胞RT-PCR的人抗體可變區(qū)獲取方法，其特征在于，所述方法步驟如下 (1)從特異免疫力供體獲取抗凝外周血； (2)分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)； (3)以CD3_和CD19+為gate對(duì)PBMCs進(jìn)行初次分選； (4)以⑶27high和⑶38high為gate對(duì)初次分選的細(xì)胞再次分選； (5)獲取具有抗體分泌功能的漿細(xì)胞，并稀釋成單細(xì)胞； (6)裂解單細(xì)胞并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得單細(xì)胞cDNA序列； (7)IgG/M特異引物PCR擴(kuò)增； (8)Barcode Primer 測(cè)序引物 PCR 擴(kuò)增； (9)SOLID芯片測(cè)序，生物信息學(xué)分析，獲得抗體可變區(qū)基因序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種結(jié)合SOLID測(cè)序和單細(xì)胞RT-PCR的人抗體可變區(qū)獲取方法。通過細(xì)胞表面分子標(biāo)記篩選表達(dá)特異抗體的單細(xì)胞，將單細(xì)胞mRNA進(jìn)行一次反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA序列，然后用我們?cè)O(shè)計(jì)的IgG/M特異引物群進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板，再用SOLID測(cè)序引物(Barcoded Primers)進(jìn)行一次PCR。最后取Barcoded Primers擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行SOLID測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，即可獲得人類抗體可變區(qū)基因序列。本發(fā)明可廣泛用于獲取多種疾病中特異性抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，其快速，高效的優(yōu)勢(shì)為全人源化抗體藥物的生產(chǎn)提供了一個(gè)有效手段。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102787118SQ20111012429
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者史占平, 孫毅, 曾橋, 梁愛斌 申請(qǐng)人:史占平, 孫毅, 曾橋, 梁愛斌