專利名稱：微生物來源的抗氧化劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗氧化劑制備方法。
背景技術(shù)：
自由基是生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝物質(zhì)。自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，會(huì)造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病。在衰老過程中，機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡發(fā)生了變化，表現(xiàn)為氧化作用增強(qiáng)，抗氧化能力減弱隨著年齡的增長(zhǎng)，抗氧化酶類如SOD等活性降低，體內(nèi)除氧自由基的能力受到影響，氧自由基濃度升高，引起膜脂質(zhì)的過氧化、蛋白質(zhì)變性、酶活性降低和DNA損傷等危害些生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的改變，必然導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，從而導(dǎo)致各種疾病和引起衰老。因此說自由基攻擊生命大分子和各種細(xì)胞器造成組織損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重大原因?？寡趸镔|(zhì)(抗氧化劑)是指能夠清除氧自由基，抑制或消除以及減緩氧化反應(yīng)的一類物質(zhì)?？寡趸瘎┑拈_發(fā)與研究一直以來受到人們的廣泛關(guān)注，特別是當(dāng)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)人體的疾病與衰老是人體內(nèi)自由基作用的結(jié)果后，抗氧化劑的研究更有了廣闊的發(fā)展空間。天然抗氧化劑已從單純作為油脂和含脂食品的抗氧化劑，發(fā)展到作為體內(nèi)氧自由基的清除劑，起到保護(hù)人體細(xì)胞組織，保護(hù)心腦血管循環(huán)系統(tǒng)、抗癌及延緩衰老等生理作用。目前天然抗氧化物質(zhì)主要是從動(dòng)植物中提取的，如維生素類、酶類和天然藥物類等。但是動(dòng)植物中天然抗氧化物質(zhì)含量較低，提取工藝復(fù)雜，而且從這些資源提取勢(shì)必使這這些動(dòng)植物資源遭到嚴(yán)重破壞，造成生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的損失。近年來，利用一些微生物具有產(chǎn)生和宿主相同或相似生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)，對(duì)植物來源菌進(jìn)行了大量的研究，已從榛屬植物中分離得到多株可以產(chǎn)生具有生理活性物質(zhì)的菌株，其中包括可以產(chǎn)生抗氧化劑的青霉(產(chǎn)抗氧化劑的菌株為青霉JTLR-1，分類命名為青霉Penicillium sp，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年3月21日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4701)。名稱為“一株產(chǎn)抗氧化劑的菌株(申請(qǐng)?zhí)?01110111548X，申請(qǐng)日2011年04月四日)”的專利中利用青霉JTLR-I產(chǎn)抗氧化劑的提取方法(具體如下取青霉JTLR-I的發(fā)酵固體培養(yǎng)物用液氮冷凍并研碎后，以Ig固體培養(yǎng)物加入IOmL質(zhì)量濃度50%的甲醇水的比例進(jìn)行提取，用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后，除去上層正己烷層，取下層冷凍干燥，即得到菌產(chǎn)抗氧化劑)存在雜質(zhì)較多，抗氧化活性低的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有提取方法得到的菌產(chǎn)抗氧化劑存在雜質(zhì)較多，抗氧化活性低的問題，而提供微生物來源的抗氧化劑制備方法。微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行一、將1 2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；二、液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體， 再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為0. 1 lOmL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，棄去洗脫液；五、按體積比20 100 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為0.1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，收集洗脫液，在25 50°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加1 20ml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1 ；步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 1 100，硅膠的粒徑為5 μ m 2_。微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行一、將1 2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)接于裝有50mL察氏培養(yǎng)基的大平皿中，在 25°C下培養(yǎng)7天得培養(yǎng)物；二、培養(yǎng)物用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，然后用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取， 萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水N%S04除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為0. 1 lOmL/min， 棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，棄去洗脫液；五、按體積比20 100 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，收集洗脫液，在25 50°C 下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加1 20ml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1 ；步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 1 100，硅膠的粒徑為5 μ m 2匪。本發(fā)明微生物來源的抗氧化劑制備方法，采用具有較高抗氧化活性的青霉JTLR-I 作為微生物來源；本發(fā)明中的制備方法可以除去較多雜質(zhì)，且得到的抗氧化劑比現(xiàn)有提取方法濃縮了至少6倍以上，可見抗氧化活性高。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行 一、將1 2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有 200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；二、液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為 0. 1 lOmL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的 10 20倍，棄去洗脫液；五、按體積比20 100 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合， 繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，收集洗脫液，在25 50°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加1 20ml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1 ；步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 1 100，硅膠的粒徑為5 μ m 2mm。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同是步驟一中PDA固體培養(yǎng)基由IOOml質(zhì)量濃度為20%的馬鈴薯汁、2g的蔗糖和2g的瓊脂組成。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二的不同是步驟一中察氏培養(yǎng)基每 L 由 2g 的 NaNO3Ug 的 K2HP04、0. 5g 的 KCl、0· 5g 的 MgSO4 · 4Η20、0· Olg 的 FeSO4、30g 的蔗糖和余量的蒸餾水組成，PH值自然。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一的不同是步驟二中萃取溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種的組合物；或者萃取溶劑由兩部分構(gòu)成， 一部分由乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種組成，另一部分由甲醇、乙醇、丙酮中的一種或者三種的組成。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。本實(shí)施方式中萃取溶劑為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行 一、將1 2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)接于裝有 50mL察氏固體培養(yǎng)基的大平皿中，在25°C下培養(yǎng)7天得培養(yǎng)物；二、培養(yǎng)物用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，然后用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4 除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物； 三、取Ig無水提取物溶解于1 100ml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為0. 1 lOmL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比 20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min， 洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，棄去洗脫液；五、按體積比20 100 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，收集洗脫液，在25 50°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加1 20ml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1;步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 1 100，硅膠的粒徑為5 μ m 2mm。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五的不同是步驟一中PDA固體培養(yǎng)基由100ml質(zhì)量濃度為20%的馬鈴薯汁、2g的蔗糖和2g的瓊脂組成。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五或六的不同是步驟一中察氏固體培養(yǎng)基每 L 由 2g 的 NaNO3Ug 的 K2HP04、0. 5g 的 KCl、0· 5g 的 MgSO4 · 4Η20、0· Olg 的 FeSO4, 30g的蔗糖、15 20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，pH值自然。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五或六相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五至七之一的不同是步驟二中萃取溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種的組合物；或者萃取溶劑由兩部分構(gòu)成， 一部分由乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種組成，另一部分由甲醇、乙醇、丙酮中的一種或者三種的組成。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行 一、將2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL 察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；二、液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在30°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于IOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為2mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為5mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，棄去洗脫液；五、按體積比 95 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為5mL/min，洗脫體積為硅膠體積的10倍，收集洗脫液，在30°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加20ml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1 ；步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 3，硅膠的粒徑為0.5mm。本實(shí)施方式中步驟二中萃取溶劑為二氯甲烷與甲醇按體積比9 1的混合溶液。本實(shí)施方式所得抗氧化劑，采用β -胡蘿卜素-亞油酸法測(cè)定菌產(chǎn)抗氧化劑的抗氧化活性將0. 2mg^-胡蘿卜素溶于0. 2mL氯仿中，加入20mg亞油酸及200mg吐溫-40，混合均勻后于40°C水浴中除去氯仿，然后加入50mL蒸餾水(經(jīng)鼓氧氣2 3min)，劇烈振蕩， 即配成反應(yīng)介質(zhì)溶液；同時(shí)設(shè)置空白，除不加β-胡蘿卜素氯仿溶液外，其他步驟同前；于具塞試管中逐一加入4. OmL反應(yīng)介質(zhì)溶液，本實(shí)施方式所得抗氧化劑溶于無水乙醇配制成系列濃度溶液作為樣液，分別加入0. 2mL樣液，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零管、對(duì)照管和樣品管，其中空白調(diào)零管中不含β-胡蘿卜素與試樣，對(duì)照管不含試樣，以0. 2mL無水乙醇代替試樣溶液；上述溶液混勻后，置于50°C水浴中恒溫，在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定t = 0時(shí)的吸光度，之后每間隔15min測(cè)定吸光度，直至對(duì)照管中β-胡蘿卜素顏色消失(約120min)；抗氧化活性的計(jì)算公式抗氧化活性(％)=100 χ [1 - (A0 - At)/(Al - 4°)] (A。、分別表示t = 0時(shí)樣品和對(duì)照的吸光度；At、4°分別表示t = 120min時(shí)樣品和對(duì)照的吸光度)結(jié)果胡蘿卜素-亞油酸法測(cè)定菌產(chǎn)抗氧化劑，現(xiàn)有提取方法得到的菌產(chǎn)抗氧化劑IC50值為1. 05mg/mL，而本實(shí)施方式中得到的菌產(chǎn)抗氧化劑的IC50值為0. 16mg/mL,說明按本實(shí)施方式中方法得到的抗氧化劑比現(xiàn)有提取方法濃縮了至少6倍，可見抗氧化活性高。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行 一、將2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)接于裝有50mL 察氏固體培養(yǎng)基的大平皿中，在25°C下培養(yǎng)7天得培養(yǎng)物；二、培養(yǎng)物用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，然后用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水， 過濾去除固形物后得到提取液，再在25°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于IOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為5mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為5mL/min，洗脫體積為硅膠體積的20倍，棄去洗脫液；五、按體積比80 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為5mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，收集洗脫液，在25°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加Iml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1;步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 2，硅膠的粒徑為50 μ m。本實(shí)施方式中步驟二中萃取溶劑為乙酸乙酯、氯仿和乙醇按體積比4 5 1的混合溶液。本實(shí)施方式所得抗氧化劑，清除DPPH自由基能力的測(cè)定用無水乙醇配置6. 5X 10_5mol/L DPPH溶液，另將本實(shí)施方式所得抗氧化劑和化學(xué)合成抗氧化劑BHT溶于無水乙醇配制成系列濃度溶液作為樣液；精確吸取2. 5mL DPPH溶液和0. 5mL樣液搖勻，室溫避光放置反應(yīng)IOmin后倒入光徑Icm比色皿517nm下測(cè)定吸光值； 重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值；然后按下式計(jì)算DPPH自由基清除率，抗氧化劑清除自由基能力采用清除DPPH的IC50值表示，即DPPH自由基清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗氧化劑溶液濃度；清除率(％) = [I-(Ai-Aj)/AJ X 100%，其中 Atl 為 2. 5mL DPPH 溶液+0. 5mL 無水乙醇，Ai為2. 5mLDPPH溶液+0. 5mL樣液，Aj為2. 5mL無水乙醇+0. 5mL樣液。經(jīng)計(jì)算現(xiàn)有提取方法得到的菌產(chǎn)抗氧化劑的IC50值(50% DPPH自由基清除率所需樣品的濃度)為41. 17 μ g/mL,而新提取方法得到的菌產(chǎn)抗氧化劑的IC50值為4. 94 μ g/ mL，說明按本實(shí)施方式中得到的抗氧化劑比現(xiàn)有提取方法濃縮了至少8倍，可見清除DPPH 自由基能力高。
權(quán)利要求
1.微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行一、將1 2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天， 收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；二、液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料， 上樣流速為0. 1 lOmL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；四、按體積比20 100 將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，棄去洗脫液；五、按體積比20 100 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20 倍，收集洗脫液，在25 50°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加1 20ml 蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1 ；步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 1 100，硅膠的粒徑為5μπι 2mm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于步驟一中PDA 固體培養(yǎng)基由IOOml質(zhì)量濃度為20%的馬鈴薯汁、2g的蔗糖和2g的瓊脂組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于步驟一中察氏培養(yǎng)基每 L 由 2g 的 NaNO3Ug 的 Κ2ΗΡ04、0· 5g 的 KCl、0· 5g 的 MgSO4 · 4Η20、0· Olg 的 FeSO4,30g的蔗糖和余量的蒸餾水組成，pH值自然。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于步驟二中萃取溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種的組合物；或者萃取溶劑由兩部分構(gòu)成， 一部分由乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種組成，另一部分由甲醇、乙醇、丙酮中的一種或者三種的組成。
5.微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于微生物來源的抗氧化劑制備方法按以下步驟進(jìn)行一、將1 2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)接于裝有50mL察氏固體培養(yǎng)基的大平皿中，在25°C下培養(yǎng)7天得培養(yǎng)物；二、培養(yǎng)物用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，然后用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；三、取Ig無水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液， 然后上樣于硅膠填料，上樣流速為0. 1 lOmL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液； 四、按體積比20 100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為0.1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，棄去洗脫液；五、按體積比20 100 100 將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為0. 1 lOOmL/min，洗脫體積為硅膠體積的10 20倍，收集洗脫液，在25 50°C下減壓除去溶劑，得到具抗氧化作用物質(zhì)的提取物，即完成微生物來源的抗氧化劑制備；其中步驟二中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加1 20ml蒸餾水；步驟二中水層與萃取溶液的體積比為1 1;步驟三中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為1 1 100，硅膠的粒徑為5 μ m 2mm ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于步驟一中PDA 固體培養(yǎng)基由IOOml質(zhì)量濃度為20%的馬鈴薯汁、2g的蔗糖和2g的瓊脂組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于步驟一中察氏固體培養(yǎng)基每 L 由 2g 的 NaNO3Ug 的 K2HP04、0. 5g 的 KCl、0. 5g 的 MgSO4 · 4H20、0. Olg 的i^eS04、30g的蔗糖、15 20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，pH值自然。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物來源的抗氧化劑制備方法，其特征在于步驟二中萃取溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種的組合物；或者萃取溶劑由兩部分構(gòu)成， 一部分由乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的一種或者兩種組成，另一部分由甲醇、乙醇、丙酮中的一種或者三種的組成。
全文摘要
微生物來源的抗氧化劑制備方法，它涉及抗氧化劑制備方法。它解決了現(xiàn)有提取方法得到的菌產(chǎn)抗氧化劑存在雜質(zhì)較多，抗氧化活性低的問題。方法制青霉JTLR-1的培養(yǎng)物；培養(yǎng)物反復(fù)凍融并研碎后，制無水提取物；制無水提取物乙酸乙酯溶液并上樣于硅膠填料，棄去乙酸乙酯溶液；乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合后洗脫硅膠，棄去洗脫液；繼續(xù)洗脫硅膠，收集洗脫液，減壓除去溶劑即完成。本發(fā)明中的制備方法可以除去較多雜質(zhì)，且得到的抗氧化劑比現(xiàn)有提取方法濃縮了至少6倍以上，可見抗氧化活性高。
文檔編號(hào)C12R1/80GK102304547SQ20111012768
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者葛菁萍, 金濤 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)