專利名稱：一種降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多環(huán)芳烴(PAHs)污染物的修復(fù)技術(shù)，具體地說是一種降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑。
背景技術(shù)：
常規(guī)環(huán)境修復(fù)技術(shù)主要指化學(xué)修復(fù)法、物理修復(fù)法、生態(tài)修復(fù)法和生物修復(fù)法，后兩者常被歸為統(tǒng)一的技術(shù)，工程上一般采取原位方式。對于多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)技術(shù)已有很多研究，其優(yōu)點(diǎn)是①費(fèi)用省，其費(fèi)用約為焚燒處理費(fèi)用的1/4-1/3。②環(huán)境影響小，生物修復(fù)只是一個(gè)自然過程的強(qiáng)化，其最終產(chǎn)物是二氧化碳、水和脂肪酸等，不形成二次污染或?qū)е挛廴疚镛D(zhuǎn)移。③可以最大限度地降低污染物濃度等。且能改良土壤，提高地力，因此具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景。應(yīng)用微生物來治理環(huán)境污染的研究越來越受到世界各國的重視，我國自20世紀(jì)90年代開始，針對石油及多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)技術(shù)開展了大量研究，從理論和應(yīng)用均取得了顯著的研究成果，但目前仍沒有實(shí)用規(guī)模的成熟的生物處理技術(shù)。我國有大量污染農(nóng)田土壤需要修復(fù)，特別急需農(nóng)田PAHs污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)。沈陽撫順屬于老工業(yè)化的城市，30-40年的石油污水灌溉使土壤積累了大量的PAHs，由于低環(huán)組分易于揮發(fā)、降解，而中高環(huán)部分的自然降解能力相對較低，因此土壤中更多地積累了 PAHs高環(huán)組分，其中PAHs含量按環(huán)數(shù)排列4環(huán)>5環(huán)>3環(huán)>6環(huán)>2環(huán)，4環(huán)、5環(huán)、6環(huán)占PAHs總量的79. 76%，屬于老化的石油源污染土壤。對于這種大面積的污染土壤必須采用原位修復(fù)技術(shù)，而微生物的降解是去除PAHs的主要途徑。如何篩選高效的降解菌，有效發(fā)揮微生物的活性是生物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑由土著混合菌組成，所述土著混合菌為假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )B08、假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)BM、芽抱桿菌(Bacillussp. )BYB、芽抱桿菌(Bacillus sp. )B07、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp. )ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.) BGDS 和分枝桿菌(Mycobacterium sp.) BFZG ；上述菌株已于2011年3月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號分別為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.) B08 (保藏編號CCTCC M 2011082)、假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)BM(保藏編號 CCTCC M 2011085)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)BYB(保藏編號 CCTCC M 2011086)、芽孢桿菌(Bacillus sp.) B07 (保藏編號 CCTCC M 2011081)、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)ZHL-4(保藏編號CCTCC M 2011087)、戈登氏菌(Gordonia sp.)B⑶S (保藏編號 CCTCC M 2011084)和分枝桿菌(Mycobacterium sp.) BFZG (保藏編號 CCTCCM 2011083)。
將土壤樣品經(jīng)過含PAHs污染物的富集培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)，再以PAHs污染物為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)、篩選獲得，即得到所述以PAHs污染物為唯一碳源的土著混合菌劑。所述富集培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為葡萄糖O. 1%、蛋白胨O. 1%、酵母膏O. 1%,NaCl O. 5%, NH4NO3 O. I %, K2HPO4 O. 5%, MgSO4 · 7Η200· 05 %、余量為自來水，ρΗ7· 2 ;所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為=NaCl O. 01%,NH4NO3 O. 5%, K2HPO4 O. 5%,MgSO4 ·7Η20
O.05%,ρΗ7. 2。所述富集培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基中菲、芘和苯并(a)芘3種污染物總量的濃度均為180 ZSOmgL'將混合菌劑按5_10 (質(zhì)量)％的接種量投加到污染土壤或水體中。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn) I本發(fā)明的混合菌劑經(jīng)過含PAHs污染物的富集培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)；再以PAHs污染物為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)、篩選獲得。其生長、繁殖能力及適應(yīng)性較強(qiáng)。2本發(fā)明的菌劑是由土著混合菌組成，保持原微生物種群結(jié)構(gòu)，有利于提高微生物的活性和生物量。3本發(fā)明的菌劑降解率高，采用本發(fā)明的菌劑當(dāng)PAHs初始濃度為180. .時(shí)，培養(yǎng)9天后其降解率可達(dá)91.21%。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中假單胞桿菌(Pseudomonassp. )B08革氏染色和鞭毛染色效果圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中假單胞桿菌(Pseudomonassp. )BM菌落形態(tài)圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中芽孢桿菌(Bacillus sp.)BYB的革氏染色和鞭毛染色效果圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中芽孢桿菌(Bacillus sp.)B07的革氏染色效果圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)ZHL4的革氏染色和鞭毛染色的效果圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中戈登氏菌(Gordonia sp. )B⑶S的菌落形態(tài)圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例提供的菌劑中分枝桿菌(Mycobacteriumsp. )BFZG的菌落形態(tài)圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例提供的PAHs總量為180. 67mg/l時(shí)，混合菌劑對菲、芘和苯并(a)芘的降解效果圖。圖9為本發(fā)明實(shí)施例提供的PAHs總量為232. 88mg/l時(shí)，混合菌劑對菲、芘和苯并(a)芘的降解效果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I7株高效降解菌的篩選菌液的制備在90ml含有PAHs污染物的富集培養(yǎng)基中，加入IOg污灌區(qū)(撫順市三寶屯北后屯耕層土壤)老化的PAHs污染土壤,于120rpm/min恒溫(30°C )搖床中振蕩培養(yǎng)7d，待用。所述含有PAHs污染物的富集培養(yǎng)基為將2. 5ml PAHs溶液加入到無菌的500ml三角瓶中，使富集培養(yǎng)基中多環(huán)芳烴總量濃度為200mg/L ;待溶劑揮發(fā)完后，再將分裝好的90ml無菌富集培養(yǎng)基倒入三角瓶中。所述富集培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為葡萄糖O. I %、蛋白胨 O. 1%、酵母膏 O. l%、NaCl O. 5%, NH4NO3 0.1%, K2HPO4 O. 5%,MgSO4 · 7H20 O. 05%,余量為自來水，pH7. 2。滅菌條件為0. IMpa濕熱滅菌30min。而后按10%接種量將上述種液轉(zhuǎn)接到30ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，該培養(yǎng)基中PAHs總量濃度為200mg/L。于28°C，120rpm/min條件下進(jìn)行馴化培養(yǎng)5d。以此重復(fù)三次上述富集培養(yǎng)和馴化培養(yǎng)，即得到以PAHs為唯一碳源的菌株作為微生物的混合菌劑。所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為NaCl O. 01 NH4NO3 0.5%, K2HPO4
0.5%,MgSO4 · 7H20 O. 05%、pH7. 2。滅菌條件為0. IMpa 濕熱滅菌 30min。 所述菌株為高效降解菌，分別為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)B08、假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )BM、芽抱桿菌(Bacillus sp. )BYB、芽抱桿菌(Bacillus sp.)B07、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.) ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.) BGDS 和分枝桿菌(Mycobacteriumsp.) BFZG (參見圖 1-7)。上述菌株已于2011年3月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號分別為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.) B08 (保藏編號CCTCC M 2011082)、假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)BM(保藏編號 CCTCC M 2011085)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)BYB(保藏編號 CCTCC M 2011086)、芽孢桿菌(Bacillus sp.) B07 (保藏編號 CCTCC M 2011081)、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)ZHL-4(保藏編號CCTCC M 2011087)、戈登氏菌(Gordonia sp.)B⑶S (保藏編號 CCTCC M 2011084)和分枝桿菌(Mycobacterium sp.) BFZG (保藏編號 CCTCCM 2011083)。各菌株的形態(tài)分別為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)的菌株B08菌體形態(tài)為細(xì)胞短桿狀,革蘭氏染色陰性，無芽孢，極生鞭毛。好氧。生長最適溫度28_30°C。假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)的菌株BM菌體形態(tài)為細(xì)胞桿狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢，極生鞭毛，好氧。最適溫度28-30°C。芽孢桿菌(Bacillus sp.)的菌株BYB菌體形態(tài)為革蘭氏染色陽性桿菌,末端圓，單個(gè)或呈短鏈排列，直徑為I. 2 I. 5X2. O 4. O微米，能運(yùn)動。周生鞭毛，好氧。芽孢為
1.O I. 2X1. 5 2. O微米，橢圓形，中生或次端生。最適溫度28-30°C。芽孢桿菌(Bacillus sp.)的菌株B07菌體形態(tài)為革蘭氏染色陽性桿菌，周生鞭毛，單個(gè)或呈短鏈排列，直徑為I. O I. 2X2. O 3. O微米，好氧。芽孢中生或次端生。蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)的菌株ZHL-4菌體形態(tài)為細(xì)胞為短桿狀,革蘭氏染色呈陰性，無芽孢，菌體的大小為0.2 0.4 μ mX 0.4 I. I μ m。在固體培養(yǎng)基表面，菌體形成不透明的淺黃色小菌落，菌落干，邊緣不整齊。最適溫度28-30°C。戈登氏菌屬(Gordonia sp.)的菌株B⑶S菌體形態(tài)為革蘭氏染色陽性桿菌,無芽孢，無鞭毛，不抗酸，好氧。最適溫度28_30°C。分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.)的菌株BFZG菌體形態(tài)為革蘭氏染色陽性桿菌，無芽孢，無鞭毛，抗酸染色陽性，好氧。生長較慢，最適溫度28-30°C以上7種菌最適生長及最佳降解溫度為28°C -30°C，在低于10°C或高于40°C時(shí)生長緩慢；最適生長PH值為7-7. 5，當(dāng)pH值低于5或高于10時(shí)，其生長受到明顯抑制。實(shí)施例2將上述以PAHs為唯一碳源的菌液按10%接種量，接入到富集培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即獲得降解PAHs的微生物混合菌劑，保存?zhèn)溆谩６筮M(jìn)行混合菌劑對PAHs降解能力實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中進(jìn)行。無機(jī)鹽培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其PH為7. O，分裝于150ml三角瓶中，每瓶30ml，裝瓶后高壓滅菌30min，冷卻后，每瓶投加上述混合菌劑1.5ml (5%的接種量)；投加菲、芘和苯并(a)芘溶液。每種污染物初始濃度(實(shí)測值)分別為-J2. 84mg/l、67. 49mg/l和40. 34mg/l,3種污染物總量為180. 67mg/l。130轉(zhuǎn)/min，保持28°C。振蕩培養(yǎng)9天后，測定3種污染物的殘留濃度。用二氯甲烷萃取培養(yǎng)基中殘留污染物3次，合并提取液，提取液過無水硫酸鈉柱 后定容至25ml。取過膜(0.2um的有機(jī)膜)后的提取液，放入樣品瓶中，氮?dú)獯蹈珊笥蒙V純甲醇定容，用HPLC測定。經(jīng)過9天降解后各處理中PAHs殘留濃度測定結(jié)果見表1，其降解率見圖8。由圖8看出當(dāng)PAHs初始濃度為180. 6711^171時(shí)，培養(yǎng)9天后PAHs總量降解率可達(dá)91. 21%。對3、4環(huán)的菲和芘去除率均90%以上，即使對5環(huán)難降解的BaP也有81. 06%降解率。說明本發(fā)明混合菌劑對PAH s污染物的生物修復(fù)具有很好的應(yīng)用前景。所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分(% ) =NaCl O. 01 ；NH4NO3 O. I ；CaCl2 O. 01 ；MgS04. 7Η200· 02 ；FeCl3 O. 002 ；KH2PO4 O. I ；K2HPO4 O. 1，水 100ml，ρΗ7· 2。
表I混合菌劑降解PAHs殘留濃度比較(mg · I/1)
處理__法 Bap 總量72. 84~67. 49~40. 34~180. 67
對照 62.63 65. 41 38.47 166.50
混合菌劑 1.51 6. 74 7. 64 15. 88實(shí)施例3將上述菌劑從冰箱中取出放置至室溫，進(jìn)行活化。所述活化即在無菌條件下，按10%接種至已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，130轉(zhuǎn)/min，28°C振蕩培養(yǎng)2_3d。實(shí)驗(yàn)采用搖瓶液體培養(yǎng)法進(jìn)行。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。在無菌條件下，吸取O. 60mlPAHs溶液置于已滅菌的150ml空三角瓶中，蓋上通氣的高溫塑料膜，通風(fēng)至近干，再加入O. 5ml丙酮，通過振搖將污染物溶解，通風(fēng)至少量，加入已滅菌的30ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基。在30ml培養(yǎng)基中接種3ml菌劑(10%的接種量)，130轉(zhuǎn)/min，28°C震蕩培養(yǎng)10天。所述PAHs溶液為菲、花和苯并(a)花混合液,菲、花濃度為4mg/ml,苯并[a]花為2mg/ml，3種污染物濃度總量約為10mg/ml，溶劑為二氯甲烷。樣品預(yù)處理采用二氯甲烷萃取，在三角瓶中加入二氯甲烷10ml，蓋上密封塑料膜，180轉(zhuǎn)/min振蕩5min,靜止分層后，下層(二氯甲燒層)放入裝有無水Na2SO4漏斗中，過濾到25ml比色管中。上層再萃取兩次，步驟同上，最后定容至25. 0ml，取2ml過O. 22um有機(jī)膜。準(zhǔn)確吸取過膜后的液體40ul置于樣品瓶中，自然揮發(fā)近干后，用過膜的色譜純甲醇定容至1ml，用高效液相色譜儀測定。分析培養(yǎng)液中污染物的殘留濃度，根據(jù)初始投加量的減少，計(jì)算去除率。研究結(jié)果見表2和圖9。結(jié)果表明，當(dāng)菲、芘和苯并[a]芘初始濃度為 94. 36mg/ml、95. 61mg/ml 和 42. 91mg/ml 時(shí)，10 天后去除率分別為 89. 85%,89. 76%和81. 08%。不投加混合菌劑的對照去除率分別為31. 13%,27. 15%和13. 59%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合菌劑有非常明顯的去除效果。表2混合菌劑降解PAHs殘留濃度比較(mg · Γ1)
權(quán)利要求
1.一種降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑，其特征在干由土著混合菌組成，所述土著混合菌為假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )B08、假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)BM、芽孢桿菌(Bacillus sp.)BYB、芽抱桿菌(Bacillus sp. )B07、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.)BGDS 和分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)BFZG ; 上述菌株已于2011年3月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號分別為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.) B08 (保藏編號CCTCC M 2011082)、假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)BM(保藏編號 CCTCC M 2011085)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)BYB(保藏編號 CCTCC M 2011086)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)B07 (保藏編號 CCTCC M 2011081)、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)ZHL-4(保藏編號 CCTCC M 2011087)、戈登氏菌(Gordonia sp.)B⑶S(保藏編號CCTCC M 2011084)和分枝桿菌(Mycobacterium sp.)BFZG(保藏編號CCTCCM 2011083)。
2.按權(quán)利要求I所述的降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑，其特征在于將土壤樣品經(jīng)過含PAHs污染物的富集培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)，再以PAHs污染物為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)、篩選獲得，即得到所述以PAHs污染物為唯一碳源的土著混合菌劑。
3.按權(quán)利要求2所述的降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑，其特征在于所述富集培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為葡萄糖0. I %、蛋白胨0. I %、酵母膏0. I %、NaCl 0.5%、NH4NO30.I %, K2HPO4 0. 5%, MgSO4 7H200. 05 %、余量為自來水，pH7. 2 ;所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為NaCl 0. 01%, NH4NO3 0. 5%, K2HPO4 0. 5%,MgSO4 7H20 0.05%、pH7.2。
4.按權(quán)利要求2所述的降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑，其特征在于所述富集培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基中菲、芘和苯并(a)芘3種污染物總量的濃度均為180 2501^1^。
5.按權(quán)利要求I所述的降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑，其特征在于將混合菌劑按5-10 (質(zhì)量)％的接種量投加到污染土壌或水體中。
全文摘要
本發(fā)明涉及多環(huán)芳烴(PAHs)污染物的修復(fù)技術(shù)，具體地說是一種降解多環(huán)芳烴污染物的混合菌劑。由土著混合菌組成，所述土著混合菌為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)B08、假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)BM、芽孢桿菌(Bacillus sp.)BYB、芽孢桿菌(Bacillus sp.)B07、蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.)BGDS和分枝桿菌(Mycobacterium sp.)BFZG；采用本發(fā)明菌劑可按5-10％的接種量投加，當(dāng)PAHs初始濃度為180.67mgL-1時(shí)，處理9天后PAHs總量降解率可達(dá)91.21％。
文檔編號C12N1/20GK102776135SQ20111012828
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者劉宛, 臺培東, 鞏宗強(qiáng), 張春桂, 張海榮, 李曉軍 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所