專(zhuān)利名稱(chēng)：一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞系構(gòu)建領(lǐng)域，特別涉及一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
耳聾是人類(lèi)發(fā)病率最高的感官或功能缺陷性疾病，不僅嚴(yán)重影響患病人群的生活、學(xué)習(xí)、社會(huì)交往及家庭生活品質(zhì)，而且給患者及其家庭帶來(lái)生理上和心理上痛苦。耳聾分為傳導(dǎo)性耳聾、感音神經(jīng)性耳聾及混合性耳聾。我國(guó)衛(wèi)生部2000年公布的調(diào)查結(jié)果顯示，感音神經(jīng)性聾約占耳聾患者的63%，其絕對(duì)數(shù)量超過(guò)8千萬(wàn)。目前，感音神經(jīng)性聾的治療多需要借助人工耳蝸。人工耳蝸植入及助聽(tīng)技術(shù)的臨床應(yīng)用部分改善了中重度感音神經(jīng)性聾患者的聽(tīng)力障礙，一定程度上改善了患者的言語(yǔ)交流能力。但是人工耳蝸植入價(jià)格昂貴，限制了該技術(shù)在耳聾治療中的廣泛應(yīng)用。研究表明，噪音、耳毒性藥物、感染、中毒、老化以及各種疾病引起的毛細(xì)胞的缺失、變性和損傷是導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾的主要原因。毛細(xì)胞是內(nèi)耳感覺(jué)上皮的終末分化細(xì)胞，當(dāng)聲波經(jīng)過(guò)的時(shí)候，從細(xì)胞表面長(zhǎng)出的靜纖毛隨聲波運(yùn)動(dòng)，把刺激經(jīng)由神經(jīng)傳給大腦。 但是哺乳動(dòng)物的毛細(xì)胞損傷后不能再生，因此，使毛細(xì)胞再生或恢復(fù)，成為治療由毛細(xì)胞損傷所致的感音神經(jīng)性聾的關(guān)鍵。但是耳蝸毛細(xì)胞為分化的終末細(xì)胞，不能傳代，因此在體外不能培養(yǎng)，建立能夠傳代的細(xì)胞系更為困難。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，位于感覺(jué)上皮外的大上皮嵴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)能形成大量新生毛細(xì)胞，且當(dāng)耳蝸組織過(guò)表達(dá)Mathl后，會(huì)誘導(dǎo)大上皮嵴細(xì)胞區(qū)域產(chǎn)生異位毛細(xì)胞，即大上皮嵴柱狀上皮細(xì)胞在Mathl的作用下能分化成毛細(xì)胞。這些研究表明大上皮嵴細(xì)胞可能是耳蝸毛細(xì)胞的前體細(xì)胞之一。但是由于內(nèi)耳中小的組織、復(fù)雜的體內(nèi)骨結(jié)構(gòu)以及缺乏由毛細(xì)胞的祖細(xì)胞構(gòu)成的培養(yǎng)體系，獲取大量此種耳蝸毛細(xì)胞的前體細(xì)胞非常困難。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種保藏編號(hào)為CGMCC No. 4719的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。該大上皮嵴細(xì)胞系能夠穩(wěn)定傳代，可應(yīng)用于毛細(xì)胞分化、再生的研究及制備治療耳聾的相關(guān)藥物。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系，含有Mathl基因，保藏編號(hào)為CGMCC No.4719。哺乳動(dòng)物內(nèi)耳的形態(tài)生成和毛細(xì)胞的產(chǎn)生是由局部的細(xì)胞間相互影響及特異的基因調(diào)控的，其中最關(guān)鍵的就是“堿性螺旋-環(huán)-螺旋”(basic helix-loop-helix,bHLH)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如Mathl (mammalian atonal homologl)是毛細(xì)胞分化的正向調(diào)控因子。 Mathl是一種果蠅atonal的鼠類(lèi)同源基因，對(duì)于毛細(xì)胞分化是必須的。發(fā)育中的毛細(xì)胞表達(dá)Mathl，而非感覺(jué)細(xì)胞則不表達(dá)。試驗(yàn)證明，Mathl基因敲除后鼠無(wú)法形成毛細(xì)胞，新生鼠內(nèi)耳組織培養(yǎng)物過(guò)表達(dá)Mathl會(huì)引起大上皮嵴(greater epitheliaridge, GER)區(qū)域額外毛細(xì)胞的產(chǎn)生。通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)染Mathl基因至成熟豚鼠耳蝸內(nèi)淋巴囊從而構(gòu)建Mathl 在耳蝸非感覺(jué)細(xì)胞的過(guò)表達(dá)模型，結(jié)果顯示Corti器、內(nèi)溝細(xì)胞以及Hense細(xì)胞區(qū)域產(chǎn)生了不成熟毛細(xì)胞，并且聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)軸突伸向一部分的新生毛細(xì)胞，說(shuō)明新生毛細(xì)胞吸引了聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元。因此，成熟耳蝸的非感覺(jué)細(xì)胞有形成新生毛細(xì)胞的能力，同時(shí)，Mathl具有誘導(dǎo)非感覺(jué)細(xì)胞分化成毛細(xì)胞的功能。因此，本發(fā)明提供的永生化耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系中，導(dǎo)入了 Mathl基因，用來(lái)誘導(dǎo)耳蝸大上皮嵴細(xì)胞分化成毛細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的制備方法，通過(guò)病毒載體向耳蝸大上皮嵴細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SV40大T抗原，然后通過(guò)脂質(zhì)體LipOOfectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)入包含 Mathl基因的質(zhì)粒prv5-EGFP，G418篩選獲得耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。作為優(yōu)選，上述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染SV40大T抗原的方法為用含有SV40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒與大上皮嵴細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入EGF (上皮生長(zhǎng)因子)及polybrene (聚凝胺)。在兩次感染后， 換成10%DMEM培養(yǎng)基(加入EGF)培養(yǎng)。利用0. 125%胰酶消化作用，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至M 孔培養(yǎng)板中。通過(guò)每日倒置顯微鏡觀察，數(shù)天后可以看到感染細(xì)胞的克隆，在0. 125%胰酶消化作用的同時(shí)，利用吸管進(jìn)行單克隆的提取進(jìn)而獲得細(xì)胞的純化。將提取的細(xì)胞單克隆接種至96孔培養(yǎng)板進(jìn)行增殖和傳代。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)是一種由53個(gè)氨基組成的活性物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞。聚凝胺(polybrene)又名為溴化己二甲銨(hexadimethrinebromide)，是一種陽(yáng)離子聚合物，在細(xì)胞培養(yǎng)中主要通過(guò)中和細(xì)胞表面的唾液酸和病毒粒子之間的電荷排斥， 提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的效率。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染Mathl基因的方法包括步驟1 轉(zhuǎn)染有SV40大T抗原的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 轉(zhuǎn)染前池，換無(wú)血清培養(yǎng)基。步驟2 取prv5_EGFP質(zhì)粒和Lipoofectamine 2000分別溶于轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)液中， 將二者逐滴混勻，室溫下靜置，形成DNA-Lipoofectamine 2000復(fù)合物。步驟3 向轉(zhuǎn)染有SV40大T抗原的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞中加入上述復(fù)合物，并輕輕震搖，37 °C培養(yǎng)他后，去除培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)液。作為優(yōu)選，上述篩選包括抗性篩選和Mathl基因檢測(cè)。G418篩選方法包括步驟1 將G418溶于HEPES中，過(guò)濾消毒，制得G418溶液。步驟2 用培養(yǎng)基按濃度梯度稀釋G418溶液，制成篩選培養(yǎng)基。步驟3 將上述轉(zhuǎn)染有SV40大T抗原、Mathl基因的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)約他后，吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌之后，換用篩選培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3 5d更換一次篩選培養(yǎng)基。步驟4 :10 14d后，能夠殺死所有細(xì)胞的G418最小濃度即為最佳篩選濃度。步驟5 將上述轉(zhuǎn)染有SV40大T抗原、Mathl基因的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞培養(yǎng)待密度增至50 70%時(shí)，吸出培養(yǎng)液，按最佳篩選濃度配置好的G418篩選培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3 5d更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半以維持篩選。篩選10 14d后，可見(jiàn)有抗性的單克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，挑單克隆。傳代50代后，上述單克隆仍能夠穩(wěn)定傳代，具有生物特異性，鑒于該單克隆能夠穩(wěn)定傳代，本發(fā)明獲得耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的制備方法中，還包括基因檢測(cè)的步驟。上述基因檢測(cè)為對(duì)所述耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系中Mathl基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。優(yōu)選地，耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)Mathl 基因是否存在。本發(fā)明還提供了一種含有Mathl基因、保藏編號(hào)為CGMCC No. 4719的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系在毛細(xì)胞的分化、再生研究中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了一種Mathl基因、保藏編號(hào)為CGMCC No. 4719的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。該細(xì)胞系通過(guò)病毒載體將SV40大T抗原轉(zhuǎn)染入耳蝸大上皮嵴細(xì)胞，再將編碼Mathl基因的真核表達(dá)質(zhì)粒prv5-EGFP導(dǎo)入，然后應(yīng)用G418篩選獲得抗G418陽(yáng)性細(xì)胞并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選得到耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。該細(xì)胞系生長(zhǎng)速度快，易于培養(yǎng)，導(dǎo)入噪聲致聾的耳蝸模型后，能夠表達(dá)毛細(xì)胞特征性標(biāo)記蛋白myosin Vila，且能夠發(fā)育成具有毛細(xì)胞特征的靜纖毛簇。該細(xì)胞系便于推廣，可應(yīng)用于毛細(xì)胞分化、再生的研究。本發(fā)明提供的大上皮嵴細(xì)胞系分化得到的毛細(xì)胞是感覺(jué)細(xì)胞，其功能是將聲音信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯镫娦盘?hào)，然后由螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元將信號(hào)傳入聽(tīng)覺(jué)中樞產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。生物保藏說(shuō)明生物材料CEC-M_6 ；分類(lèi)命名大鼠耳蝸上皮細(xì)胞系；2011年4月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市中關(guān)村中國(guó)科學(xué)院微生物所內(nèi)，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4719。


圖1示本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系中Mathl基因的檢測(cè)結(jié)果。利用管家基因DAPDH作為內(nèi)參，對(duì)Math基因的表達(dá)量進(jìn)行半定量檢測(cè)。從左至右，第一泳道為培養(yǎng)24h 后提取總RNA經(jīng)RT-PCR后的電泳圖；第二泳道為培養(yǎng)4 后提取總RNA經(jīng)RT-PCR后的電泳圖；第三泳道為培養(yǎng)7 后提取總RNA經(jīng)RT-PCR后的電泳圖；第四泳道為培養(yǎng)邪h后提取總RNA經(jīng)RT-PCR后的電泳圖。圖2示損傷的耳蝸模型導(dǎo)入本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系1月后電鏡圖，有靜纖毛簇產(chǎn)生，表明有毛細(xì)胞產(chǎn)生。圖3示損傷的耳蝸模型導(dǎo)入本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系1月后電鏡圖，生成的細(xì)胞表面有成團(tuán)狀的纖毛產(chǎn)生。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種含有Mathl基因、保藏編號(hào)為CGMCC No. 4719的大上皮嵴細(xì)胞系及其在毛細(xì)胞分化、再生研究上的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述， 相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系，含有Mathl基因，保藏編號(hào)為CGMCC No.4719。本發(fā)明還提供了一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的制備方法，通過(guò)病毒載體向耳蝸大上皮嵴細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SV40大T抗原，然后通過(guò)脂質(zhì)體LipOOfectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)入包含 Mathl基因的質(zhì)粒prv5-EGFP，G418篩選篩選獲得永生化耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。作為優(yōu)選，上述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一種人工改建的感染性RNA病毒，可以將非病毒基因整合于有絲分裂期宿主細(xì)胞，從而使靶細(xì)胞獲得對(duì)目的基因的穩(wěn)定、永久性的轉(zhuǎn)染。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)中除包含SV40大T抗原外，同時(shí)編碼了一段溫度依賴(lài)性蛋白(tsA58)，在33°C時(shí)，大 T抗原活性最強(qiáng)，所以當(dāng)培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移至非許可溫度(39°C)時(shí)，大T功能失活，細(xì)胞將停止增殖。另外，作為標(biāo)記基因的Neo基因，是一種最常用的供陽(yáng)性篩選的標(biāo)記基因，該酶對(duì) G418 (新霉素的衍生物)具有抗性，正常情況下，G418可使培養(yǎng)細(xì)胞死亡，而經(jīng)Neo基因轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞能在含G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由此可供陽(yáng)性篩查。故對(duì)于本研究中細(xì)胞系的純化方法，可以利用G418對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中已實(shí)現(xiàn)SV40大T抗原穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行篩選及純化。G418是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。它通過(guò)抑制轉(zhuǎn)座子Tn601，Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)。當(dāng) neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。G418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠(chǎng)家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100 μ g/mL lmg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10 14d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早； 但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24h之后才開(kāi)始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3 5d都要更換一次含有G418的篩選液。為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽(yáng)性克隆造成的不利影響以及增加陽(yáng)性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽(yáng)性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽(yáng)性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽(yáng)性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或用套環(huán)套住陽(yáng)性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽(yáng)性克隆在96孔板中篩選。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的制備方法中，還包括對(duì)基因檢測(cè)的步驟。上述基因檢測(cè)為對(duì)所述耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系中Mathl基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。
優(yōu)選地，耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)Mathl
基因是否存在。本發(fā)明還提供了一種含有Mathl基因、保藏編號(hào)為CGMCC No. 4719的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系在毛細(xì)胞的分化、再生研究中的應(yīng)用。該細(xì)胞系生長(zhǎng)速度快，易于培養(yǎng)，導(dǎo)入噪聲致聾的耳蝸模型后，能夠表達(dá)毛細(xì)胞特征性標(biāo)記蛋白myosin Vila，且能夠發(fā)育成具有毛細(xì)胞特征的靜纖毛簇。該細(xì)胞系便于推廣，可應(yīng)用于毛細(xì)胞分化、再生的研究。本發(fā)明中，Mathl基因由美國(guó)基因公司高維強(qiáng)教授提供。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1分離耳蝸大上皮嵴細(xì)胞取Ptl-P3大鼠于75%酒精浸泡5min，沿頭頸相接處斷頭，眼科剪自枕骨大孔去除大部分頂骨及全部腦組織，暴露顱中窩和顱后窩，完整取出聽(tīng)泡；將聽(tīng)泡置于pH = 7. 4的PBS 溶液中，在解剖顯微鏡下(Olympus公司)打開(kāi)聽(tīng)泡，剝離蝸殼，去除骨性耳蝸，自底轉(zhuǎn)逐漸剝離基底膜(撕除螺旋韌帶及螺旋神經(jīng)節(jié))；立即將基底膜移入0.5mg/mL嗜熱菌蛋白酶 (Sigma公司)溶液(由pH = 7. 4的0. 01mol/L的PBS溶液配制而成，同時(shí)加入5U/ μ L的 DNase (Promage公司)中，37°C孵育27min ；在高倍顯微鏡下，將基底膜上的上皮細(xì)胞薄片用鎢絲針從所連接的結(jié)締組織上撕下；將分離除的上皮薄片接種于96孔培養(yǎng)板，并用吸管進(jìn)行輕柔的吹打，使用10(%DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加入20ng/mL的EGF。每2d換液一次，進(jìn)行原代培養(yǎng)4d以淘汰內(nèi)外毛細(xì)胞。實(shí)施例2建立耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系用含有SV40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒與大上皮嵴細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入20ng/mL EGF及8 μ g/mL polybrene。在兩次感染后(各乩)，換成10% DMEM培養(yǎng)基(加入20ng/mL 的EGF)。培養(yǎng)IOd后，利用0.125%胰酶消化作用，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至M孔培養(yǎng)板中。通過(guò)每日倒置顯微鏡觀察，數(shù)天后可以看到感染細(xì)胞的克隆，在0. 125%胰酶消化作用的同時(shí)， 利用吸管進(jìn)行單克隆的提取進(jìn)而獲得細(xì)胞的純化。將提取的細(xì)胞單克隆接種至96孔培養(yǎng)板進(jìn)行增殖和傳代。轉(zhuǎn)染 孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前池，每孔換400 μ L 無(wú)血清培養(yǎng)基；取1 μ g prv5-EGFP質(zhì)粒和2 μ L Lipoofectamine 2000分別溶于100 μ L轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)液中，將二者逐滴混勻，室溫下靜置20min，以形成DNA-Lipoof ectamine 2000復(fù)合物；每一 M孔培養(yǎng)板細(xì)胞中加入100 μ L復(fù)合物，并輕輕震搖，37°C培養(yǎng)Mi后，去除培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)液。G418篩選法純化細(xì)胞G418的配制取Ig G418溶于ImL lmol/L的HEPES液中，加蒸餾水至IOmL,過(guò)濾
消毒，4°C保存。細(xì)胞培養(yǎng)取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 6h左右開(kāi)始加藥。制備篩選培養(yǎng)基按梯度濃度100 μ g/mL、150 μ g/mL、200 μ g/mL、300 μ g/mL，用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。加G418篩選吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。
換液根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3d更換一次篩選培養(yǎng)基。確定最佳篩選濃度在篩選14d內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度，最佳篩選濃度為150μ g/mL。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)24h或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1 4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50-70 %匯合時(shí)；加G418去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3d更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選10-14d后，可見(jiàn)有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)；挑單克隆制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10 μ L。在96孔板中加入培養(yǎng)基150 μ L/孔，再加入細(xì)胞懸液10 μ L/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖，得到永生化耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。單克隆鑒定細(xì)胞培養(yǎng)Mh、48h、72h、％h后，提取總RNA，做RT-PCR檢測(cè)。Mathl 基因表達(dá)如圖1所示。圖1表明，本發(fā)明中制得的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)有Mathl基因。實(shí)施例3建立耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系用含有SV40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒與大上皮嵴細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入20ng/mL EGF及8 μ g/mL polybrene。在兩次感染后(各乩)，換成10% DMEM培養(yǎng)基(加入20ng/mL 的EGF)。培養(yǎng)IOd后，利用0.125%胰酶消化作用，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至M孔培養(yǎng)板中。通過(guò)每日倒置顯微鏡觀察，數(shù)天后可以看到感染細(xì)胞的克隆，在0. 125%胰酶消化作用的同時(shí)， 利用吸管進(jìn)行單克隆的提取進(jìn)而獲得細(xì)胞的純化。將提取的細(xì)胞單克隆接種至96孔培養(yǎng)板進(jìn)行增殖和傳代。轉(zhuǎn)染 孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前池，每孔換400 μ L 無(wú)血清培養(yǎng)基；取1 μ g prv5-EGFP質(zhì)粒和2 μ L Lipoofectamine 2000分別溶于100 μ L轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)液中，將二者逐滴混勻，室溫下靜置20min，以形成DNA-Lipoof ectamine 2000復(fù)合物；每一 M孔培養(yǎng)板細(xì)胞中加入100 μ L復(fù)合物，并輕輕震搖，37°C培養(yǎng)Mi后，去除培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)液。G418篩選法純化細(xì)胞G418的配制取Ig G418溶于ImL lmol/L的HEPES液中，加蒸餾水至IOmL,過(guò)濾
消毒，4°C保存。細(xì)胞培養(yǎng)取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 6h左右開(kāi)始加藥。制備篩選培養(yǎng)基按梯度濃度100 μ g/mL、150 μ g/mL、200 μ g/mL、300 μ g/mL，用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。加G418篩選吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。換液根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每5d更換一次篩選培養(yǎng)基。確定最佳篩選濃度在篩選IOd內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度，最佳篩選濃度為150 μ g/mL。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)24h或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1 4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50-70 %匯合時(shí)；加G418去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每5d更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選14d后，可見(jiàn)有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)；挑單克隆制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10 μ L。在96孔板中加入培養(yǎng)基150 μ L/孔，再加入細(xì)胞懸液10 μ L/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖，得到耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。單克隆鑒定細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例2， 表明本發(fā)明中制得的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)有Mathl基因。實(shí)施例4對(duì)本發(fā)明制得的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)選取本發(fā)明制得永生化耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的第20代細(xì)胞，以1 X IOVmL接種于 24孔培養(yǎng)板，于接種后第2d進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染；隨機(jī)選取10個(gè)培養(yǎng)孔，吸除培養(yǎng)液， 加入ad-Mathl-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液(1 2稀釋)，覆蓋皿底即可，于5% C02/95%空氣、37°C培養(yǎng)箱中孵育2 汕后，吸除病毒液， 加入150μ g/mLG418篩選培養(yǎng)基，于5% C02/95%空氣、37°C培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每隔2d換液，每日觀察培養(yǎng)基顏色、透明度及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。對(duì)ad-Mathl-EGFP組及ad_EGFP組標(biāo)本均選擇感染后第4d進(jìn)行固定，使用4%多聚甲醛固定40min后，進(jìn)行抗myosin Vila抗體的免疫細(xì)胞組化熒光染色，用熒光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系能夠表達(dá)毛細(xì)胞的標(biāo)記蛋白Myosin VIIa0實(shí)施例5本發(fā)明制得的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系導(dǎo)入噪聲致聾的耳蝸模型分化獲得毛細(xì)胞制備噪聲致聾的耳蝸模型成年大鼠體重150 200g，ABR基線(xiàn)閾值正常(15_50dB SPL)，脈沖聲(電火花脈沖發(fā)聲器)爆震動(dòng)物200發(fā)，壓力峰值為145. OdB SPL，脈寬80ms。 噪聲致聾7天后測(cè)ABR閾值，閾值引不出或在IOOdB SPL以上者為備選動(dòng)物。將實(shí)施例2制得的永生化耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系經(jīng)骨階導(dǎo)入上述噪聲致聾的耳蝸模型，在解放軍總醫(yī)院動(dòng)物所常規(guī)飼養(yǎng)，分別在14天和1月后處死取材。將實(shí)施例2制得的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系經(jīng)骨階導(dǎo)入上述噪聲致聾的耳蝸模型后， 該耳蝸大上皮嵴細(xì)胞能夠成活，且表達(dá)毛細(xì)胞的標(biāo)記蛋白Myosin Vila,同時(shí)發(fā)育成具有毛細(xì)胞特征的靜纖毛簇，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。進(jìn)一步表明，本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系能夠產(chǎn)生毛細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系可以應(yīng)用于毛細(xì)胞的分化、再生的研究。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系，其特征在于，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4719。
2.一種耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，通過(guò)病毒載體向耳蝸大上皮嵴細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SV40大T抗原，然后通過(guò)脂質(zhì)體LipOOfectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)入含有Mathl基因的質(zhì)粒prv5-EGFP，經(jīng)G418篩選獲得耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，還包括基因檢測(cè)的步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述基因檢測(cè)為RT-PCR。
6.保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4719的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系在毛細(xì)胞分化、再生研究中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種保藏編號(hào)為CGMCC No.4719的耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。該細(xì)胞系通過(guò)病毒載體將SV40大T抗原轉(zhuǎn)染入耳蝸大上皮嵴細(xì)胞，再將編碼Math1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒prv5-EGFP導(dǎo)入，然后應(yīng)用G418篩選獲得抗G418陽(yáng)性細(xì)胞并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選得到耳蝸大上皮嵴細(xì)胞系。該細(xì)胞系生長(zhǎng)速度快，易于培養(yǎng)，導(dǎo)入噪聲致聾的耳蝸模型后，能夠表達(dá)毛細(xì)胞特征性標(biāo)記蛋白myosin VIIa，且能夠發(fā)育成具有毛細(xì)胞特征的靜纖毛簇。該細(xì)胞系便于推廣，可應(yīng)用于毛細(xì)胞分化、再生的研究。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102229912SQ201110129069
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者楊仕明, 翟所強(qiáng), 郭維 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院