專利名稱:高特異性高靈敏度的基因芯片及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種基因芯片,特別涉及一種高特異性高靈敏度的基因芯片及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù):
基因芯片技術(shù)是近十多年來(lái)生物研究技術(shù)的重大突破性進(jìn)展之一,其技術(shù)特征是將數(shù)量龐大的生物探針有序地固定在相對(duì)小的固體表面如玻璃或硅表面上,每個(gè)探針點(diǎn)通常直經(jīng)小于100微米。因此,在普通的顯微玻片上可排列成千上萬(wàn)個(gè)不同的生物探針。這種表面帶有高密度的玻片或硅質(zhì)片就是通常所說的生物芯片。帶有大量的特性各異的探針芯片和被測(cè)試物接觸反應(yīng)如核酸間的雜交反應(yīng)時(shí),可以同時(shí)檢測(cè)被測(cè)試物中各種復(fù)雜成份的存在及數(shù)量。目前,基因芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究中。此技術(shù)在近年來(lái)也逐步應(yīng)用在臨床診斷上?;蛐酒圃旆椒ù致钥煞譃閮纱箢愒缓铣煞ê忘c(diǎn)樣法。原位合成法就是直接在玻璃或硅載體表面上通過單體聚合來(lái)合成寡核苷酸探針。這種方法最先由美國(guó)的 Affymatrix公司開發(fā)成功,其技術(shù)特征是利用半導(dǎo)體工業(yè)上普遍采用的精密光刻蝕技術(shù)根據(jù)每個(gè)探針點(diǎn)上的序列制成一組模片,用這種模片可控制在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)各個(gè)探針點(diǎn)的反應(yīng)活性從而達(dá)到可控聚合反應(yīng)而獲得各探針點(diǎn)所需的探針序列。這種方法的最大優(yōu)勢(shì)是可在很小的表面上合成高密度的探針。但其主要缺點(diǎn)是此方法可塑性很差,不同的芯片設(shè)計(jì)就要制備一整套全新的模片。而另一大缺點(diǎn)是每個(gè)反應(yīng)循環(huán)各探針點(diǎn)涉及封閉和解封反應(yīng),因而影響聚合反應(yīng)的效率。由于每步聚合反應(yīng)的效率低和循環(huán)時(shí)間長(zhǎng),Affymetrix芯片技術(shù)生產(chǎn)的芯片,其探針長(zhǎng)度一般不超過25個(gè)堿基。后來(lái)由Nimblegen開發(fā)出的無(wú)模片原位合成技術(shù)徹底克服了 Affymetrix芯片技術(shù)的困難,即單體聚合反應(yīng)的效率顯著提高。 由Nimblegen無(wú)模片原位合成技術(shù)生產(chǎn)的芯片,其探針長(zhǎng)度可長(zhǎng)達(dá)80至100堿基。另一與 Affymetrix和Nimblegen技術(shù)不同的是Agilent公司原位合成芯片技術(shù)。Agilent技術(shù)是采用傳統(tǒng)的寡核苷酸合成方法,用高精度的點(diǎn)樣機(jī)將單體直接點(diǎn)印到預(yù)定探針點(diǎn)上進(jìn)行分步聚合反應(yīng),多步循環(huán)后生成所需探針序列。但這種點(diǎn)樣法在所得的芯片的探針密度方面難以逾越Nimblegen或Affymetrix技術(shù)。點(diǎn)樣法生物芯片技術(shù)是用點(diǎn)樣機(jī)將制備好的探針點(diǎn)印到載體表面上,經(jīng)紫外線交聯(lián)或化學(xué)縮聚反應(yīng),探針固化在表面上形成探針點(diǎn)陣列。這類芯片也叫微陣列 (Microarray)。與原位合成法不同的是,點(diǎn)樣法生產(chǎn)的芯片的探針序列幾乎是無(wú)長(zhǎng)度限制的。例如,用點(diǎn)樣法可將長(zhǎng)達(dá)300,000個(gè)堿基對(duì)的細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome)DNA制成探針微陣列,用于準(zhǔn)確測(cè)定人基因組中的拷貝數(shù)。常用的點(diǎn)樣法芯片制備方法是將DNA用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到帶有氨基的玻璃表面上,在一定濕度條件下用紫外線將 DNA交聯(lián)到表面上形成探針點(diǎn),隨后用化學(xué)方法將表面多余的氨基封閉以免因表面氨基質(zhì)子化形成正電性對(duì)帶負(fù)電的DNA試樣產(chǎn)生非特異性吸附造成高的背景信號(hào)。另一比較常用的方法是將探針點(diǎn)印到帶過氧基團(tuán)的玻璃表面上,但這種方法同樣存在將表面多余活性過氧基團(tuán)完全脫活的問題。以上所述的常用的點(diǎn)樣法,其基因芯片生產(chǎn)方法多用于制備對(duì)靈敏度或定量要求不高的基因芯片,如用于基因表達(dá)譜研究的芯片。對(duì)于靈敏度和定量準(zhǔn)確度要求極高的比較基因組雜交芯片,以上所提的兩種點(diǎn)樣法生產(chǎn)的芯片皆因高背景信號(hào)及靈敏度不足而在實(shí)際中很少應(yīng)用。由Cai及Bradley (美國(guó)專利6,048,695 ;6,858,713)開發(fā)的基于DNA化學(xué)修飾的基因芯片生產(chǎn)方法成功解決了生物芯片的低靈敏度及高背景信號(hào)問題。這種芯片制備方法的特點(diǎn)是將探針分子先硅氧烷化處理,使得經(jīng)處理過的探針帶有對(duì)玻璃或石英表面有特異反應(yīng)活性的硅醇基團(tuán)。經(jīng)這樣修飾的探針可和不經(jīng)活化處理的玻璃表面反應(yīng)形成共價(jià)結(jié)合。這種化學(xué)修飾的探針的一個(gè)最大優(yōu)點(diǎn)是探針間在脫水后能相互交聯(lián)形成三維的織物狀結(jié)構(gòu),因而大大提高雜交反應(yīng)效率。另外,因芯片表面無(wú)需活化及脫活處理,因此不會(huì)產(chǎn)生表面背景信號(hào)。但是,這種預(yù)修飾方法的一大缺點(diǎn)是硅烷化探針因互相間能發(fā)生交聯(lián)反應(yīng), 在溶液中存放時(shí)間長(zhǎng)時(shí)會(huì)因交聯(lián)作用而慢慢失效。點(diǎn)樣法制備的基因芯片和原位合成法生產(chǎn)的芯片相比通常有更高的靈敏度,其主要原因是所用的探針較長(zhǎng)因而覆蓋區(qū)間大。但這也同時(shí)帶來(lái)探針的特異性變動(dòng)性大和難以在探針設(shè)計(jì)上加以控制,因?yàn)辄c(diǎn)樣法所用的探針多為克隆的基因片段如cDNA片段。而用于比較基因組雜交芯片的探針可取自長(zhǎng)達(dá)300,000堿基對(duì)的細(xì)菌人工染色體DNA。這種來(lái)自基因組片段(genomic fragment)的DNA平均約一半是無(wú)特異性的重復(fù)性序列(r印etitive sequences)。這種重復(fù)性序列若不能有效封閉則會(huì)降低整個(gè)探針點(diǎn)特異性,甚至因此整個(gè)探針失去效用。但是,目前并沒有很有效的方法去除大基因組片段中的重復(fù)性序列而保存特異性序列(unique sequences)。點(diǎn)樣法與原位合成法相比,一個(gè)最大的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備要求不高和芯片成本低。而原位合成法生產(chǎn)的芯片的成本與芯片表面探針的密度關(guān)系不大。因此,對(duì)于探針密度不高的芯片原位合成法的生產(chǎn)成本高,毫無(wú)優(yōu)勢(shì)。例如,售價(jià)為一百萬(wàn)美元的Nimblegen原位合成法芯片生產(chǎn)系統(tǒng)一天M小時(shí)只能生產(chǎn)三個(gè)芯片,但一個(gè)10萬(wàn)美元的點(diǎn)樣機(jī)可以在M小時(shí)內(nèi)產(chǎn)出200個(gè)表面有一萬(wàn)個(gè)探針點(diǎn)的芯片。綜上所述,可知點(diǎn)樣法具有高靈敏度,但是特異性低;原位合成法具有高特異性, 但是靈敏度低,且生產(chǎn)成本高;而基于DNA化學(xué)修飾的基因芯片生產(chǎn)方法雖然解決了很多點(diǎn)樣法存在的技術(shù)難題,但其主要缺點(diǎn)是硅烷化修飾處理的探針在溶液中穩(wěn)定性降低,存放時(shí)間長(zhǎng)時(shí)會(huì)因交聯(lián)作用而慢慢失效。在探針數(shù)量較多的情況下,探針的失效會(huì)顯著增加芯片的生產(chǎn)成本。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足,提供一種高特異性高靈敏度的基因芯片。本發(fā)明的第二目的在于提供所述的高特異性高靈敏度的基因芯片的制備方法。本發(fā)明的第三目的在于提供所述高特異性高靈敏度的基因芯片的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種高特異性高靈敏度的基因芯片,為三層結(jié)構(gòu),底層為基質(zhì)載體,中間層為中介層,頂層為核酸探針層。所述的基質(zhì)載體為表面平整的固體,優(yōu)選為表面平整的玻璃、金屬、塑料或二氧化娃。所述的基質(zhì)載體經(jīng)超聲表面凈化處理及強(qiáng)酸活化后,進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)修飾使表面
氨基化、醛基化、環(huán)氧基團(tuán)化、或羧基化。所述的表面氨基化是用有末端氨基的硅氧烷處理潔凈表面。此類硅氧烷包括4-氨基丁基三乙氧基硅烷G-aminobutyltriethoxysilane) ;3-氨基丙基二甲基乙氧基娃燒(3-aminopropy ldimethy lethoxysi lane) ;3_氨基丙基甲基-二乙氧基娃燒(3-aminopropy lmethy ldiethoxy si lane) ;3_ 氨基丙基三乙氧基娃燒(3-aminopropyltriethoxysilane) ;3-氨基丙基三輕基娃燒 (3-aminopropylsilanetriol) ;3-氨基丙基三甲氧基娃燒(3-aminopropyltrimethoxysil ane)。所述的醛基化是用3-(三乙氧基硅基)丁醛[3-(trieth0XySilyl)butyl aldehyde]處理表面。所述的環(huán)氧基團(tuán)化是帶環(huán)氧基團(tuán)的硅氧烷化合物處理表面。能用的化合物包括2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷[2-(3,4ip0XyCyCl0heXyl) ethyltrimethoxysilane] ;2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三乙氧基硅烷[2-(3, 4-epoxycycIohexy1)ethyltriethoxysi lane] ;5,6-環(huán)氧己基三乙氧基娃燒[5, 6-epoxyhexyltriethoxysilane] ;3-縮水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷 [(3-glycidoxypropyl) mehtyldiethoxysilane] ;3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl) triethoxysilane] ;3_縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷 [(3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane]。所述的羧基化是用帶羧基的硅氧烷處理表面。此類化合物包括二氫_3-[3-(三乙氧基娃基)丙基]呋喃-2, 5-二酮[3- (triethoxysilyl) propylsuccinic anhydride]; W ^ ^ (carboxyethyl si lanetriol)。所述的中介層的組成物質(zhì)為無(wú)意義DNA序列或是帶羧基基團(tuán)的聚合物。無(wú)意義 DNA序列指的是與所用雜交反應(yīng)混合物無(wú)序列相似性即無(wú)雜交反應(yīng)的任何DNA序列。所述的無(wú)意義DNA序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為500 50000bp (base pair,堿基)。所述的帶羧基基團(tuán)的聚合物優(yōu)選為異丁烯馬來(lái)酸共聚物[Poly(isobutylene-co-maleic acid)];乙烯馬來(lái)酸酐共聚物 [Poly (ethylene-alt-maleic anhydride)];甲氧基乙烯馬來(lái)酸共聚物)[Poly (methyl vinyl ether-alt-maleic acid) ][Poly (acrylic acid-co-maleic acid)];聚(2-乙基丙烯酸)[Poly(2-ethylacrylic acid)];聚(2_ 丙基丙烯酸) [Poly(2-propylacrylic acid)] ;N-異丙基丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物[Poly(N-isopr opylacrylamide-co-methacrylic acid) ] ; M Ψ MW M M [Poly (methacrylic acid)]; 聚(N-異丙基丙烯酰胺)[Poly (N-isopropylacrylamide)];丙烯酸丙烯酰胺共聚物 [Poly (acrylamide-co-acrylic acid) ] ;sMMWMM (polyacrylic acid)。所述的核酸探針層中的核酸探針的長(zhǎng)度優(yōu)選為100 5000bp。所述的核酸探針通過化學(xué)合成法或是PCR方法進(jìn)行制備。PCR方法即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)。由于化學(xué)合成法得到核酸片段一般小于lOObp,因此所述的核酸探針通過化學(xué)合成法制備時(shí),還優(yōu)選將化學(xué)合成得到的DNA產(chǎn)物依次通過T4DNA磷酸化酶激酶和T4DNA連接酶(Ligase)作用,進(jìn)行連接反應(yīng),使其長(zhǎng)度為100 5000bp。所述的連接反應(yīng)優(yōu)選在組分為無(wú)意義DNA的中介層上進(jìn)行。核酸探針分子可以連接到中介層DNA分子的3’末端上。所述的連接反應(yīng)是DNA產(chǎn)物分子優(yōu)選在在輔助引物(helper primer)的協(xié)助下進(jìn)行連接反應(yīng)。所述的連接反應(yīng)的條件優(yōu)選如下先用T4磷酸化酶激酶于37°C作用DNA產(chǎn)物分子1小時(shí);接著加入T4連接酶和輔助引物,于15°C反應(yīng)18小時(shí);輔助引物的摩爾用量與核酸探針摩爾數(shù)相等;更具體如下將DNA探針、連接酶反應(yīng)緩沖液(pH7.6、50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液 Tris-HCl, IOmM MgCl2, 2mM 二硫蘇糖醇 dithothreitol,ImM ATP)和 T4DNA 磷酸化酶激酶 (Kinase)混合,于37°C反應(yīng);然后加入與核酸探針等摩爾的8 12bp隨機(jī)序列引物,終濃度為質(zhì)量體積比15%的PEG,及終濃度為10-20單位的T4DNA連接酶,在16°C下反應(yīng)16-30 小時(shí),探針分子互相串接成大于200bp的多單元探針分子;所述的PEG優(yōu)選為PEG8000 ;所述的輔助引物是長(zhǎng)度為8 16個(gè)堿基的核苷酸,其序列與探針分子的兩端分別有至少4堿基的互補(bǔ)吻合(圖1)。優(yōu)選的輔助引物是8 12bp組成的隨機(jī)序列,更優(yōu)選為 Nltl隨機(jī)序列輔助引物。通過連接反應(yīng),可以使得到的核苷酸探針分子量是原來(lái)的核苷酸分子量的至少10 倍。不同的核苷酸分子也可用這種方法連接成序列復(fù)雜性更高的探針。這種方法制備探針特別適用于制造高靈敏度和高特異性的比較基因組雜交芯片。中介層為含羧基的聚合物時(shí),核酸探針分子需要導(dǎo)入氨基,通過氨基與羧基的縮聚反應(yīng)將核酸探針分子聯(lián)結(jié)到中介層上。所述的核酸探針通過PCR方法進(jìn)行制備時(shí),優(yōu)選在PCR反應(yīng)中加入5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽(5-Aminoallyl-2' -deoxyuridine-5‘ -Triphosph ate)或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-三磷酸鈉鹽(5-Amin0allyl-2‘ -deoxycyti dine-5' -"Triphosphate)。5-氨基烯丙基-2 ‘-脫氧尿苷-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽可使得到的PCR產(chǎn)物為帶有氨基的核酸探針。所述的5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽的用量?jī)?yōu)選為每條核酸序列上帶有3 10個(gè)氨基為且。所述的PCR的條件優(yōu)選為先在93°C變性3分鐘,然后進(jìn)行下系列溫度循環(huán) 930C 30秒,55°C 30秒,72°C 30秒;進(jìn)行20次循環(huán)后,加入5-氨基烯丙基-2 ‘-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽,繼續(xù)循環(huán)10 次,最后在72°C延長(zhǎng)5分鐘;5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽在PCR反應(yīng)體系中的濃度為0. ImM;所述的核酸探針優(yōu)選通過紫外線OMnm紫外光)或化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)固化于中介層上。所述的帶有氨基的核酸探針更優(yōu)選通過下列的化學(xué)方法固定到成分為含羧基的聚合物的中介層上(1)氨基與中介層中羧基團(tuán)在EDC[1_乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,l-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]存在下縮合反應(yīng),形成酰胺鍵 (amide)。(2)氨基與有環(huán)氧基團(tuán)在pH 7. 5 10條件下產(chǎn)生開環(huán)反應(yīng)形成共價(jià)結(jié)合。(3)氨基化探針可直接與經(jīng)酯化活化處理的聚丙稀酸中介層形成酰胺鍵。所述的高特異性高靈敏度的基因芯片的制備方法,包含以下步驟(1)基質(zhì)載體的制備基質(zhì)載體經(jīng)超聲表面凈化處理及強(qiáng)酸活化后,可進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)修飾使表面氨基化、醛基化、環(huán)氧基團(tuán)化、或羧基化;優(yōu)選的基質(zhì)載體是低熒光背景的顯微玻片,經(jīng)超聲波水洗去除表面吸附物后在1-2M鹽酸中活化表面,表面經(jīng)脫水處理后可直接用于承載經(jīng)硅烷化處理的中介層。酸活化表面進(jìn)一步處理使其帶有氨基、醛基或環(huán)氧基團(tuán)。經(jīng)功能基團(tuán)修飾的表面可用于固定無(wú)化學(xué)修飾的中介層。所述的進(jìn)一步處理的步驟具體如下將硅烷化合物稀釋在乙醇或異丙醇中成0. IM溶液, 進(jìn)一步稀釋到質(zhì)量體積比50 % PEG300水溶液成硅烷化合物的終濃度為2mM的表面活化點(diǎn)印液。將表面活化點(diǎn)印液移到點(diǎn)印孔板(95或384孔板)。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到預(yù)設(shè)的玻片表面的探針點(diǎn)上,在50°C恒溫箱中固化36小時(shí)。用玻璃刀標(biāo)記玻片取向,將玻片浸入純水中洗去表面上的點(diǎn)印液,然后浸入無(wú)水丙酮中脫水。玻片在真空或充氮?dú)獾母稍锲髦斜4?。硅烷化合物為下列化合物可得氨基活化基團(tuán)4-氨基丁基三乙氧基娃燒(4-aminobutyltriethoxysilane) ;3_氨基丙基二甲基乙氧基娃燒(3-aminop ropy ldimethy lethoxy si lane) ;3_ 氨基丙基甲基-二乙氧基娃燒(3-aminopropylmet hy ldiethoxysi lane) ; 3_ M1 基丙基三乙氧基 燒(3-aminopropyltriethoxysilane);
3-氨基丙基三輕基娃燒(3-aminopropylsilanetriol) ;3-氨基丙基三甲氧基娃烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)。硅烷化合物為下列化合物可得過氧基活化表面2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷[2-(3,4ip0XyCyCl0heXyl) ethyltrimethoxysilane] ;2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三乙氧基硅烷[2-(3,
4-epoxycycIohexy1)ethyltriethoxysilane] ;5,6-環(huán)氧己基三乙氧基娃燒[5, 6-epoxyhexyltriethoxysilane] ;3-縮水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷 [(3-glycidoxypropyl) mehtyldiethoxysilane] ;3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl) triethoxysilane] ;3_縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷 [(3-glycidoxypropyl) trimethoxysilane]。硅烷化合物為下列化合物可得羧基活化表面 二氫-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮[3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride];羧乙基三羥基硅烷(carboxyethylsilanetriol)。用下列化合物可得醛基活化表面:3-(三乙氧基硅基)丁醛[3-(triethoxysilyl)butyl aldehyde]。(2)中介層與基質(zhì)載體連接中介層為無(wú)意義的DNA或帶有羧基的聚合物。①中介層為無(wú)意義的DNA時(shí),無(wú)意義的DNA可以點(diǎn)印到帶氨基的基質(zhì)載體的表面上,然后用紫外線將DNA與氨基交聯(lián),多余的表面氨基再用羧酐封閉去活。另一種方法是將無(wú)意義的DNA點(diǎn)印到帶環(huán)氧基的表面上,表面的環(huán)氧基團(tuán)可直接與DNA反應(yīng)形成交聯(lián)。②中介層為帶有羧基的聚合物時(shí),帶有羧基的聚合物可點(diǎn)印到帶氨基的表面上, 氨基與羧基在碳化二亞胺(Carbodiimide)的存在下縮合反應(yīng)形成交聯(lián)。但首選的方法是將羧基的聚合物硅烷化。如此處理的羧基聚合物可點(diǎn)印到經(jīng)酸洗但不經(jīng)修飾的玻璃表面上,固化后即成穩(wěn)定的帶羧基中介層。所述的帶有羧基的聚合物優(yōu)選為聚丙烯酸,特別優(yōu)選為通過如下方法制備得到的聚丙烯酸將分子量大于30萬(wàn)的聚丙烯酸溶于水中制成質(zhì)量體積比0. 1 %的聚丙烯酸溶液。取100 μ 1質(zhì)量體積比0. 1 %的聚丙烯酸溶液、100 μ 1 0. IM
3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液(ρΗ7.0)和50mg水溶性EDC[1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,l-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]混合溶解。 置60°C恒溫箱中反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)物過s印hadex-50柱兩次除去未發(fā)應(yīng)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷,得到反應(yīng)后的聚丙烯溶液。將反應(yīng)后的聚丙烯溶液移到96或384孔板。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到干凈玻璃表面,然后置60°C恒溫箱干燥固化22小時(shí)即得帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)的芯片載體。(3)高靈敏度高特異性探針的制備根據(jù)檢測(cè)目的進(jìn)行設(shè)計(jì),用化學(xué)合成法或PCR 方法進(jìn)行制備,其中①應(yīng)用化學(xué)合成法制備時(shí),得到的DNA產(chǎn)物連接,得到長(zhǎng)度為100 5000bp的高靈敏度高特異性探針;優(yōu)選依次通過T4DNA磷酸化酶激酶和T4DNA連接酶,在輔助引物的協(xié)助下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接的方式優(yōu)選為將DNA產(chǎn)物、連接酶反應(yīng)緩沖液(pH7.6、50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液iTris-HCl, IOmM MgCl2, 2mM 二硫蘇糖醇dithothreitol,ImM ATP)和T4DNA磷酸化酶激酶(Kinase)混合,于37°C反應(yīng);然后加入與核酸探針等摩爾的 8 12bp隨機(jī)序列引物,終濃度為質(zhì)量體積比15%的PEG 8000,及終濃度為10-20單位的連接酶,在16°C下反應(yīng)16-30小時(shí),探針分子互相串接成大于200bp的多單元探針分子,同時(shí)連接到中介層為無(wú)意義DNA探針點(diǎn)上。②通過PCR方法進(jìn)行制備時(shí),在PCR反應(yīng)中加入5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽,得到的帶有氨基修飾的高靈敏度高特異性探針。所述的PCR的條件優(yōu)選為先在93°C變性3分鐘,然后進(jìn)行下系列溫度循環(huán)93°C 30秒,55°C 30秒,72°C 30秒;進(jìn)行20次循環(huán)后,加入5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽,繼續(xù)循環(huán)10次,最后在72°C延長(zhǎng)5分鐘;5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽在PCR反應(yīng)體系中的濃度為 0. ImM。(4)將步驟(3)得到的高靈敏度高特異性的探針點(diǎn)印到步驟(2)得到的連接在基質(zhì)載體上的中介層的表面位點(diǎn)上。①中介層為無(wú)意義的DNA時(shí),對(duì)于化學(xué)合成法的核酸探針優(yōu)選的方法是通過連接酶連接到中介層中的無(wú)意義的DNA分子上。而對(duì)于PCR擴(kuò)增法制備的核酸探針或從克隆中提取的DNA片段,優(yōu)選的方法是用紫外線將探針分子交聯(lián)到中介層中無(wú)意義的DNA上。 此外,核酸探針分子也可用化學(xué)交聯(lián)物聯(lián)接到中介層上。這類化學(xué)交聯(lián)劑包括1,4_ 丁二醇二縮水甘油醚(l,4-Butanediol diglycidyl ether);甘油二縮水甘油醚(Glycerol diglycidyl ether) ;二L二(Diethylene glycol diglycidyl ether) ;1,
4-環(huán)己烷二甲醇二縮水甘油醚(l,4-Cyclohexanedimethanoldiglycidyl ether);新戊二酉享二(Neopentyl glycol diglycidyl ether)。紫外線交聯(lián)法的步驟優(yōu)選為將DNA探針稀釋到如下組成的點(diǎn)印液中50mMTris-HCl (pH7. 5),體積百分比乙二醇,0. 2M NaCl,體積百分比5% DMS0,質(zhì)量體積比 5% PEG300。探針濃度為50-150ng/y 1。用點(diǎn)樣機(jī)將探針溶液點(diǎn)印到有DNA中介層的探針點(diǎn)上。芯片用Mratalinker在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)5-15分鐘。然后,用純水漂洗芯片表面。芯片存于常溫干燥器中備用。用化學(xué)交聯(lián)劑將DNA探針交聯(lián)固化到有DNA中介層的探針點(diǎn)上,優(yōu)選的步驟是將 DNA探針稀釋到0. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 2)中,濃度控制在75ng/μ 1。用點(diǎn)樣機(jī)將探針溶液點(diǎn)印到有DNA中介層的探針點(diǎn)上。隨后點(diǎn)印上5mM的交聯(lián)劑溶液?jiǎn)?dòng)交聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)在常溫下進(jìn)行2-5小時(shí)。反應(yīng)后用純水漂洗芯片表面。芯片置于0. IM硫醇溶液中將殘留交聯(lián)劑去活。芯片存于常溫干燥器中備用。下列的化合物可用作交聯(lián)劑1,4_ 丁二醇二縮水甘油醚(1,4-Butanediol diglycidyl ether);甘油二縮水甘油醚(Glycerol diglycidyl ether) ;二甘醇二縮水甘油醚(Diethylene glycol diglycidyl ether) ;1,4_ 環(huán)己烷二甲醇二縮水甘油醚(l,4-Cyclohexanedimethanol diglycidyl ether);新戊二醇二縮水甘油醚(Neopentyl glycol diglycidyl ether)。也可用戊二醛等交聯(lián)劑將探針關(guān)聯(lián)到DNA中介層上。但交聯(lián)反應(yīng)后,在純水中漂洗芯片后置于2M硼氫化納溶液中反應(yīng)2-5小時(shí),然后置2M乙胺溶液(pH9-10)中常溫反應(yīng)30分鐘封閉未反應(yīng)的醛基。②中介層為帶有羧基的聚合物時(shí),這種中介層尤其適合用于固定帶有氨基修飾的 DNA探針。通過探針分子上氨基與中介層中羧基在碳化二亞胺(Carbodiimide)協(xié)助下產(chǎn)生的縮合反應(yīng),探針分子可共價(jià)連結(jié)到中介層上。中介層的羧基的聚合物也可經(jīng)活化處理使其對(duì)氨基有特異反應(yīng)活性。例如,中介層的羧基可以用羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole) 活化變成對(duì)氨基有強(qiáng)反應(yīng)性的?;溥?Acylimidazole)。?;溥蚺c氨基反應(yīng)可生成穩(wěn)定的酰胺鍵。另一羧基活化法是將羧基團(tuán)在EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,l-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]協(xié)助下與 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide,又稱Sulfo-ΜΒ)酯化反應(yīng)變成穩(wěn)定的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。NHS酯與氨基反應(yīng)也可生成酰胺鍵,得到高特異性高靈敏度的基因芯片。步驟(4)②中,當(dāng)中介層為聚丙烯酸中介層時(shí),將氨基化核酸探針用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,芯片移到65°C恒溫箱中干燥30分鐘,在原探針點(diǎn)上點(diǎn)上新鮮配制的含0. 2M EDC的50%二甲基亞砜(DMSO)水溶液。芯片移到37°C、濕度75-85%的恒溫箱反應(yīng)過夜(約22小時(shí))。芯片用去離子水漂洗,移到65°C恒溫箱中干燥20分鐘。芯片放置在干燥器中常溫保存。優(yōu)選為將聚丙烯酸中介層活化,再與氨基化核酸探針連接;所述的活化為將羧基酯化活化,從而氨基化探針與活化的羧基在溫和條件形成穩(wěn)定的酰胺鍵。所述的活化的具體步驟為①將羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole)溶于DMSO中制成0. 2M溶液,并將此溶液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在常溫下反應(yīng)2 小時(shí),用無(wú)水丙酮洗去反應(yīng)液;或者步驟(4)②為將EDC和N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS)分別溶于 DMSO 中制備 IM C備液。將兩種C備液稀釋到0. 2Μ、ρΗ7· 2的磷酸鈉溶液,制成0. IM EDC和0. IM sulfo-NHS的反應(yīng)液。將此液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到步驟(2)制備的帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在常溫下反應(yīng)3小時(shí),用體積
11百分比50%乙醇溶液洗去反應(yīng)液;所述的氨基化探針與活化的聚丙烯酸中介層的連接通過如下反應(yīng)進(jìn)行將氨基化探針稀釋到0. IM碳酸氫鈉溶液中(pH9. 0),濃度調(diào)至75ng/y 1。將探針液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到活化的聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在常溫(22 25°C )下反應(yīng)過夜。用TE(pH7. 6)緩沖液漂洗芯片,再用體積百分比80%乙醇溶液清洗即可。上述制備方法特別適用于大規(guī)模生產(chǎn)用于臨床檢測(cè)的基因芯片。所述的高特異性高靈敏度的基因芯片在臨床中的應(yīng)用,其特別適合作為檢測(cè)器材在臨床中進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明的原理本發(fā)明采用點(diǎn)樣法在技術(shù)操作上簡(jiǎn)易的優(yōu)點(diǎn),結(jié)合創(chuàng)新的探針制備方法及相配的芯片制作過程,從而使得生產(chǎn)基因芯片具備高靈敏度及高特異性優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的兩大技術(shù)關(guān)鍵是高靈敏度及高特異性探針制備和相配基因芯片載體的制備。本發(fā)明的芯片制造法主要采用化學(xué)合成法和PCR擴(kuò)增法制備的探針原料經(jīng)進(jìn)一步處理使得最終探針產(chǎn)物在固定于基質(zhì)上后探針分子能遠(yuǎn)離表面因而極大減少表面的空間阻隔效應(yīng),大大提高雜交反應(yīng)的效率。而本發(fā)明提供的相配套的基質(zhì)制備方法也是為此目的而設(shè)計(jì)。目前,DNA探針制備方法主要有三種①用化學(xué)合成法;②用PCR擴(kuò)增法;③從細(xì)菌克隆中提取DNA?;瘜W(xué)合成法制備的探針通常不會(huì)超過IOObp (base pair,即堿基),此方法的最大優(yōu)點(diǎn)是探針的反應(yīng)特異性能通過選擇獨(dú)特的探針序列進(jìn)行嚴(yán)格控制,探針純度及可靠性高而且成本相對(duì)較低;但主要缺點(diǎn)是探針長(zhǎng)度有限,用目前常用的探針固定方法難以將如此短的探針分子固定在載體表面上而又不影響其雜交性能。一般情況下,化學(xué)合成法探針會(huì)被過度關(guān)聯(lián)固化,至使其雜交靈敏度大大降低。因此,用化學(xué)合成法探針及點(diǎn)樣法生產(chǎn)的芯片一般無(wú)法用于高靈敏度要求的場(chǎng)合,比如檢測(cè)人類基因組片段的缺失。此類芯片多用于對(duì)靈敏性要求不高的低等生物,如細(xì)菌的研究。用PCR擴(kuò)增法可較易得到長(zhǎng)200 2000bp的DNA片段。在優(yōu)化條件下,用PCR擴(kuò)增法可獲得長(zhǎng)達(dá)10,OOObp的DNA片段。PCR 擴(kuò)增法制備的探針的特異性可以通過引物(primers)的選擇在一定程度控制,而所獲得探針片段長(zhǎng)度適宜,用常用的探針固定法如紫外線交聯(lián)可將探針固定在基質(zhì)表面上。但此法的缺點(diǎn)是單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)所得的探針量有限,不同擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物產(chǎn)率變動(dòng)懸殊。從細(xì)菌克隆中提取DNA片段用于生物芯片是最早但現(xiàn)在仍用的方法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是較易得到大量的探針,制備成本低,而且探針片段的長(zhǎng)度不受限制。但缺點(diǎn)是探針的特異性難以控制, 而且經(jīng)準(zhǔn)確定位的克隆來(lái)源有限。本發(fā)明方法的特征之一是用化學(xué)合成法所得的寡核苷酸通過如圖1所示的連接酶反應(yīng)可以生成長(zhǎng)度在200堿基以上的探針分子。這種復(fù)聚后的長(zhǎng)探針分子可直接點(diǎn)印到帶氨基、醛基或過氧基表面上進(jìn)行交聯(lián)固化。但這樣固化的探針分子在表面上呈平臥狀構(gòu)型(圖2),離表面近,空間自由度有限,因此雜交反應(yīng)效率并不理想。本發(fā)明提供的一種解決辦法是將表面上的探針點(diǎn)預(yù)先固上500-50000堿基的與被測(cè)試物無(wú)雜交反應(yīng)的DNA或合成高聚物中介層,后將探針分子交聯(lián)到中介層上(圖3),探針分子遠(yuǎn)離表面,空間自由度大為提高。可用的交聯(lián)方法包括紫外線交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)。適合的化學(xué)交聯(lián)劑為分子兩端帶有醛基如戊二醛或過氧基團(tuán)的化合物。本發(fā)明優(yōu)先選擇的方法是用連接酶直接將寡核苷酸在表面上進(jìn)行連接復(fù)聚反應(yīng),同時(shí)將生成的長(zhǎng)探針分子連接到中介層DNA分子的3’末端上。這樣固定的探針分子在溶液中呈伸直狀構(gòu)型(圖4),因此有極高的雜交反應(yīng)效率(圖5)。由PCR擴(kuò)增法制備的探針也可以直接點(diǎn)印到帶有預(yù)固化的DNA中介層的探針點(diǎn)上,然后用紫外線或化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)固化。更為有效的方法是在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中添加入少量的氨基脫氧苷三磷酸鈉,使得生成的探針平均每分子帶有3至10個(gè)氨基。這種氨基修飾的探針可用一系列化學(xué)方法固定到表面上。用聚丙烯酸作為中介層固化氨基化DNA探針和以上所述的用DNA作為中介層的效果相近,但用聚丙烯酸不存在被測(cè)試物與中介層產(chǎn)生交叉雜交(cross hybridization)的可能性。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)芯片靈敏度高而且可調(diào)本發(fā)明的最主要成就是系統(tǒng)解決了現(xiàn)有芯片制備技術(shù)的靈敏度相對(duì)較低的難題。 采用現(xiàn)有的點(diǎn)樣法制備的寡核苷酸(Oligonucleotide)芯片因靈敏度過低,無(wú)法用作比較基因組雜交芯片檢測(cè)復(fù)雜基因組如人類基因組中DNA拷貝數(shù)變化。而用原位合成法生產(chǎn)的芯片雖可用作比較基因組雜交芯片,但因靈敏度不足,往往結(jié)果并不完全可靠。本發(fā)明提供的探針制備方法及相配的芯片生產(chǎn)技術(shù),成功地將點(diǎn)樣法用于制造比較基因組雜交的寡核苷酸基因芯片。據(jù)估算,用本發(fā)明方法產(chǎn)生的比較基因組雜交的寡核苷酸基因芯片的靈敏度要高出原位合成法芯片的3-5倍。本發(fā)明方法的一大優(yōu)勢(shì)是芯片的靈敏度可以通過增加探針分子序列的復(fù)雜性進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如將多個(gè)來(lái)自同一基因組區(qū)間的探針混合,串接成長(zhǎng)的復(fù)雜探針分子制成芯片, 這樣的芯片的靈敏度比單個(gè)探針序列制成的芯片的靈敏度要高數(shù)倍。這種復(fù)合序列探針點(diǎn)的制備用原位合成法是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。(2)芯片具有高特異性芯片上探針的特異性是指探針對(duì)相似序列產(chǎn)生雜交發(fā)應(yīng)的分辯能力。這是芯片的一個(gè)重要指標(biāo)之一,它決定芯片定量測(cè)定的分辯率。探針的特異性能主要是由探針序列本身的獨(dú)特性(Uniqueness)決定,在很多情況下可選擇完全無(wú)交叉雜交反應(yīng)的探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。但很多探針序列并非完全獨(dú)特,例如在人的基因組中隨機(jī)挑選60bp的非重復(fù)性序列作為探針,有約20%的這類探針含有20bp以上的序列在基因組的另處可找到100%吻合 (Matched)的序列。這樣的探針點(diǎn)在正常雜交反應(yīng)條件下會(huì)富集各處有20bp吻合的序列, 大大降低其雜交反應(yīng)的特異性。傳統(tǒng)的補(bǔ)救方法是在雜交反應(yīng)后,用低鹽緩沖液在適當(dāng)溫度下漂洗(即苛洗,Stringent wash),可有效降低由相似序列引起的交叉雜交信號(hào)。但原位合成法芯片中的探針分子是通過單個(gè)硅氧鍵連接到表面上的,在苛洗條件下,硅氧鍵會(huì)水解斷裂,結(jié)果是雜交信號(hào)與探針一起被連根撥除。因此,原位合成法芯片的特異性不能通過雜交反應(yīng)后苛洗加以提高,其后果是約15-25%的探針會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。對(duì)此,本發(fā)明方法制備的芯片,每個(gè)探針分子與中介層形成極為穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接,而中介層是經(jīng)多觸點(diǎn)與基質(zhì)表面交聯(lián)在一起,這樣的探針分子與中介層形成的構(gòu)型,類似于樹木的根莖狀結(jié)構(gòu)。作為莖的探針分子遠(yuǎn)離固體表面,有利于雜交反應(yīng),而作為根的中介層因與表面交聯(lián), 能經(jīng)受最嚴(yán)苛的漂洗。我們的比較試驗(yàn)表明,用本發(fā)明方法制備的芯片,在苛洗條件下(IX SCC+0. 5% SDS, 650C )漂洗3小時(shí),探針無(wú)明顯的損失。但在相同條件下,原位合成法芯片會(huì)丟失95%以上的探針。(3)芯片有極高穩(wěn)定性
芯片的架上壽命(shelf life)也是衡量芯片技術(shù)優(yōu)劣的重要參數(shù)之一。本發(fā)明方法將探針連接到多聚線性分子中介層上,探針分子不經(jīng)飾處理,因而有效規(guī)避了 Cai和 Bradley基于修飾探針隨帶的探針在溶液中和表面上因探針分子間的自交聯(lián)引起的芯片靈敏度隨貯存時(shí)間不斷降低的問題。用Cai和Bradley方法制備的芯片在室溫下貯存超過6 個(gè)月芯片的靈敏度即有明顯的降低。但用本發(fā)明方法即使放置一年,其靈敏度仍無(wú)明顯改變(如圖8所示)。
圖1是連接酶反應(yīng)生成核苷酸多連體示意圖。圖2是探針分子直接與表面交聯(lián)的構(gòu)像示意圖。圖3是探針分子交聯(lián)到中介層的構(gòu)像示意圖。圖4是探針分子與DNA中介層分子的3’末端連接一起時(shí)的構(gòu)像示意圖。圖5是探針分子固定在有中介層和無(wú)中介層表面上雜交反應(yīng)效率比較圖。圖6是完全與未完全連接酶反應(yīng)對(duì)照凝膠電泳照片圖。圖7是Ducherme肌肉委縮癥芯片檢測(cè)到的異常與正常的比對(duì)結(jié)果曲線圖,其中X軸為探針序號(hào);Y軸為相對(duì)拷貝數(shù);曲線A為正常樣本與正常DNA雜交;曲線B為 Duchenne樣本與正常DNA雜交。圖8是本發(fā)明方法制備的芯片的穩(wěn)定性與用Cai和Bradley方法制備的芯片的穩(wěn)定性比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述,但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1Duchenne肌肉委縮癥是最常見的肌肉委縮癥。在約3500男孩中就有一例患者。 其成因是X染色體上的一個(gè)跨距約240萬(wàn)堿基對(duì)的基因缺失所致。這一區(qū)間的缺失可以用基因芯片按比較基因組雜交方法進(jìn)行檢測(cè)。(1)探針設(shè)計(jì)。如下的探針序列是從Ducherme區(qū)間的獨(dú)特基因組序列中選出。每個(gè)探針的解鏈溫度為75°C左右,為I組探針。探針A:5,-GATTATATCGTGATGGCCCTCCAAAACTCCAAGTGGACATCTCGGC-3,;
探針B:5,-CCCCTGGAGATGGCAGTAGAAGGCAGAGATGAAGATCATTTGCTGAC-3’ ;
探針C:5,-CCTAGACTGGAAACTAGCCTAAGGGGCCTTTCCTGTGTGTCCTTTC-3’ ;
探針D:5,-CGCCCCCCATTCTCTCTCCAGACAAGTATGATTCAGGTGGATCTTT-3’ ;
探針E:5,-CCAAATATCTTCCATCTTGCTGTCCTACCCTTCCTCCTTTGCTGATCTCTAC-3
探針F:5,-CCAATTCCAGGAACACAAAAAACCCATGCTAAAGCACAGCCCACAGTTC-3’ ;
探針G:5,-CCATTTTGTCGTCCGACAGGCGCAGGAAGTAGCGGAAGAAGTTCTC-3’ ;
探針H:5,-GCCTTACGAGGCAATGGCTAAAGACCCACTGGCCTTGATTCATAGATTC-3’ ;
探針J:5,-GCCATCCTCTGTTTTTCTAGGGGGTTGTAGGGAGGTGTCATGAATAAGAA-3’ ;
探針K:5,-CCTCTAGTTAATCCTCCCTGACATCTTTTCAGCCTACCCCCAACCC-3‘;0097]探針L :5’ -CCCTAACCTCAGGCCCAGCAGACCCTAAAATTAAACCCTCATTTTAACATTC-3,;
0098]探針M:5’ -CCTAAATTCACTTAGGTCAGTTCACAGCAGGTGGAATTTGAGGCAGTGTGC-3’ ;
0099]探針N:5’ -CCTTTCCCCCTACCCTTCTTTATTTGTGTGCACCTGGGATTTGTCTTC-3,;
0100]探針0:5’ -CCTTAAGCACCACCCTTCCATCCCCAGGCCAATACACATCATATTAC-3’ ;
0101]探針P :5’ -GCCATGCAAGCCTTCAGACCCATGCAAAGTCCTGTCTACCTAAATGAT-3,;
0102]探針Q :5’ -CCTGGGACACTGGGAGCAGGGTCTGTTTTTAACCTATCCCGAATATAAC-3,;
0103]探針R :5’ -CCCACCCCGCTCAAACTGCTGAGGAAGGTGAACCATGCAGTTCATC-3’ ;
0104]探針S :5’ -GCCAAGGCTAAAGGGATACACGGAGCCAGCAGTTAGAGGCATCTAG-3,;
0105]探針T 5 ’ -CCTAGAAAGCGTTCATTCTACTTCAGCAGGGAACTATGGCTGTGAAGGAAAAC-3 ’
0106]探針U :5’ -GCCTACTCGCCTCATAATATGGCTGAACCATCCTCAACCCTGAGTAAC-3,;
0107]探針V :5’ -CCAAAGCCAGATGACCATAACGACTTGATAGGGAGGGTTTCAAGAGAAC-3,;
0108]如下探針是從常染體選取的參照探針,為II組探針
0109]探針1 :5’ -CCTTACTCCCTGGCTTTTTAACACATTGGAGGCAAAGAAACCC-3,;
0110]探針2 :5’ -CGCCCGCCTTAATATGATTGGTTTTTGTTCCTGTCACTCTAGGATCCA-3’ ;
0111]探針3:5’ -CCGCCAAGACCTGTTTGCTGAGTCAGAGATAGAGGTAGCATACGATTTC-3 ’ ;
0112]探針4:5’ -GCCATCATTTTAATCCACCAAACTATCATTCTATTCATATTCACCATGAGGG-3 ’ ;
0113]探針5:5’ -AAATCATTTATGCAATCATATTATGCCAAACCTGTAATCACGACTGACCACGGC-3,
0114]探針6 :5’ -CCTGCTCCCAGGACGGGAGAGGGAAGGGTAAACGTCGTCTCGAC-3,;
0115]探針7 :5’ -CCAGATCCGCCATTAAACTCGCCCAGATCAGCAGCAAAGAGTAAAAGC-3’ ;
0116]探針8:5’ -GCCTAAAACTCATATCTGAGGATAAGAGATTGGAATTTATAGAATCATGGAA-3 ’ ;
0117]探針9:5’ -CCTTTCATCTTCCCTTACTCCGTGTCAGGAGCATCGTCAAGCAACC-3 ’ ;
0118]探針10:5’ -CATTACTGGACAACATAATCCGCAGTTCTGTGGGAAGCAGGAAGCG-3 ‘
0119]探針11:5’ -CAAGACTCACTAGCCTTTGAAGAACAGGAAGCAGCCCTGGACAGAG-3 ‘
0120]探針12 :5’ -GGTGGACTGAGTGGAAATGAGGCCAGTTTCTGCCTAGAGGACTCTT-3'
0121]探針13:5’ -GTGAAGGGCCCATTAAGGAAGCACTTCCCCTGGTCATGATATCTAG-3 ‘
0122]探針14 :5’ -CAAATCCACCATGTTACTTCTTTTCGTGCTTCTTGGTTAACTCCC-3,
0123]探針15 :5’ -CGAAGCCTGGAGCAGAGAAAGAGAGGGATTAAGGTTGGGAGAAAAG-3'
0124]探針16:5’ -CATCCACATGGTCCTGCTTCTCTATGATCACCCAGTGCTCCCCCAT-3 ‘
0125]探針17 :5’ -TGATGTAAAGGTCGTTGCCTTTGTAACTGTTCACCAGGCCTCTACC-3'
0126]探針18 :5,-AATCAAGACCGAGTGGTAAAGAGGCCACCGAAGGAGGGCAATTT-3,;
0127]探針19 :5’ -GAAAGTTCCCCTTCTCCCTTCCATGTGCTGTGGTCCCTAACTTT-3’ ;
0128]探針20 :5’ -TCCCTCCTGCCCTAGGAGCAAACAGGTATTCCTTGCTCCTGTTTAA-3’ ;
0129]探針21 :5’ -CATTGTTAGAACAGGCTGACTCTGCTCTCACAAACACAGGCATGCAG-3,;
0130]探針22 :5’ -CGAGAGGGCGGGACTGTAAACTGCTGGACTGGAGACTGGGCTATAT-3,;
0131]所有探針由服務(wù)商(Invitrogen)用化學(xué)合成法制備。
0132](2) Duchenne 芯片制備
0133]①取3 μ g 45-60bp的探針I(yè)組和II組分別混合后置于1. 5ml離心管中。均分別加入3μ 1 10 X Τ4磷酸化酶激酶緩沖液(組成為pH 7. 6、0. 5Μ Tris-HCl,0. IM MgCl2, 20mM 二硫蘇糖醇dithiothreitol),3 μ 1 IOmM ATP,補(bǔ)水至總體積為30 μ 1。加入5單位Τ4磷酸化酶激酶(New England Biolabs),混勻,置于37°C恒溫箱反應(yīng)1小時(shí)。然后,再加30 μ 1 2 倍連接反應(yīng)緩沖液(IOOmM Tris-HCKpH 7. 5), IOmM MgCl2, 2mM 二硫蘇糖醇,2mM ATP, 20% wt. PEG 8000),1000 單位 iM 連接酶(New England Biolabs)以及 2 μ g Nltl 隨機(jī)序列輔助引物anvitrogen),混勻,置于15°C恒溫箱反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)后,加入7μ 1 5Μ NaCl, 70 μ 1 異丙醇,混勻,置于_20°C冰箱中15分鐘或更長(zhǎng)。在14,OOOrpm下離心10分鐘,去除上清液, 用體積百分比80%的乙醇溶液漂洗沉淀,吸除乙醇溶液,空氣中風(fēng)干,得到長(zhǎng)度大于600bp 的多聚體(組I的探針形成高靈敏度高特異性探針,組II的探針形成的多聚體為對(duì)照)。 將高靈敏度高特異性探針溶解在IXTE緩沖液并置于-20°C冰箱中保存。從圖6中可以看出成功連接的高靈敏度高特異性探針條帶清晰,探針堿基數(shù)目大。與此對(duì)照,在T4連接酶用量或反應(yīng)時(shí)不足時(shí),連接產(chǎn)物分子量較低。②制備帶DNA中介層探針點(diǎn)的芯片載體取20yg Lambda DNA置于1. 5ml離心管中,用50mM NaOH溶液稀釋至250 μ 1,接著加入30 μ 1 5Μ NaCl和20 μ 1 0. IM 3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷(3-glycido xypropyltriethoxysilane)溶液,混勻,置60°C恒溫箱反應(yīng)2小時(shí)。加入300 μ 1異丙醇, 混勻,置于-20°C冰箱中15分鐘或更長(zhǎng)。在14,OOOrpm下離心10分鐘,去上清液,用體積百分比80%乙醇溶液洗滌沉淀,吸除乙醇溶液,空氣中風(fēng)干。將風(fēng)干的DNA溶于50mM NaOH 溶液中,濃度調(diào)節(jié)在100 350ng/ μ 1。加等體積0. 5Μ Tris-HCl (ρΗ7. 0),混勻。將DNA溶液移到96或384孔板。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到干凈玻璃表面,然后置60°C恒溫箱干燥固化22小時(shí)。常溫干燥環(huán)境下保存待用。干凈玻璃為低熒光背景的顯微玻片,經(jīng)超聲波水洗去除表面吸附物后在1-2M鹽酸中活化表面,表面經(jīng)脫水處理后可。③制備高靈敏度高特異性芯片將步驟①制備的高靈敏度高特異性探針稀釋到含質(zhì)量體積比10% PEG 300的 0. IM醋酸鉀溶液中,濃度調(diào)至lOOng/μ 1。移到384孔板中,用點(diǎn)樣機(jī)將探針液點(diǎn)印到步驟(2)制得的DNA中介層探針點(diǎn)的芯片載體的探針點(diǎn)上,芯片移到50°C恒溫箱中,在濕度 70-80 %條件下處理60分鐘,然后移到紫外線交聯(lián)箱(Stratalinker),在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)10分鐘。用純水漂洗芯片,芯片置于60%乙醇溶液中,在65°C恒溫箱中處理3 小時(shí),取出芯片使其自然風(fēng)干,然后置干燥器中保存。同時(shí)使用組II的探針形成的多聚體制備對(duì)照芯片。(3)測(cè)試樣本的熒光標(biāo)記取0. 5 μ g Duchnenne患者基因組DNA用hvitrogen的CGH試劑盒按照提供的操作步驟進(jìn)行熒光標(biāo)記,熒光標(biāo)記為cy5。取等量的正常男性對(duì)照DNA用同法制成cy3對(duì)照標(biāo)記物。(4)雜交反應(yīng)將步驟(3)制得的cy5標(biāo)記DNA和cy3標(biāo)記DNA在1. 5mL微試管中混合,加以50 μ g 人類Cot I DNA (約50 μ 1),再用5Μ NaCl調(diào)至終濃度為0. 5Μ,最后加等體積的異丙醇,混和后置于_20°C冰箱中20分鐘。離心沉淀DNA,去除上清液,加300 μ 1體積百分比80%乙醇溶液漂洗兩次。去除上清液后,沉淀立即用20μ1 TE溶解,加入100 μ 1組成如下的反應(yīng)液2. 5XSSC,體積百分比50%甲酰胺,質(zhì)量體積比12% PEG 17000,質(zhì)量體積比2% SDS0混和得雜交液,然后置于90°C加熱孔塊(Heating block)熱變性5分鐘。反應(yīng)液稍冷后移到高靈敏度高特異性芯片表面,用蓋玻片(Coverslip)蓋上并將反應(yīng)液展開。芯片封在帶濕度的雜交反應(yīng)盒中,在45°C下,在搖架的溫箱中緩慢搖動(dòng)下雜交過夜(約20-22小時(shí))。(4)后雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)后,將芯片浸在有30mL組分為1XSSC+0. 5% SDS+0. 2% Triton-100的清洗液的有蓋培養(yǎng)皿(Petri dish)中,待3-5分鐘,用鑷子將芯片與蓋玻片分離。用2OmL 上述清洗液在室溫(25°C )下漂洗兩次,除去清洗液,加入30mL新清洗液,移到60°C帶搖架的溫箱中緩慢搖動(dòng)下漂洗30分鐘。取出芯片,移到脫氧去離子水中漂洗兩次。用純氮?dú)庋杆俅蹈尚酒砻妗?5)熒光掃描及定量芯片用Perkin Elmer微陣列熒光掃描儀將芯片上的cy3和cy5熒光訊號(hào)掃描成像。探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度用GenPiX6. 0軟件分析定量。DNA的拷貝數(shù)由cy3與cy5在Ducherme 區(qū)的探針點(diǎn)與常染色體上探針點(diǎn)相對(duì)強(qiáng)度比較分析得出。圖7是一例Ducherme樣本的分析結(jié)果,分別是Ducherme樣本與正常DNA雜交得到的曲線和正常樣本與正常DNA雜交得到的曲線,結(jié)果表明與正常樣本相比,Ducherme樣本在Ducherme區(qū)間因有基因片段的缺失而呈現(xiàn)明顯的拷貝數(shù)變化(缺失)。實(shí)施例2(I)PCR擴(kuò)增法制備高靈敏度高特異性探針(氨基化DNA探針)取30ng人基因組DNA放到PCR反應(yīng)薄壁管中,加入引物 (5,-GACAAATCTTCAATCTCATTC-3,和 5,-GTGCTGAATAAGGTCTGA-3,)至最終濃度為 0. 5 μ M, dNTP 0. 2mM, 10單位Taq DNA聚合酶Qnvitrogen),10 μ 1 10倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液,加水到總體為100 μ 1。先在93°C變性3分鐘,然后進(jìn)行下系列溫度循環(huán)93°C 30秒,55°C 30秒,72 °C 30秒。進(jìn)行20次循環(huán)后,加入10 μ 1 l.OmM 5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽。繼續(xù)循環(huán)10次,最后在72°C延長(zhǎng)5分鐘,得到長(zhǎng)度為650bp的PCR 產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物移到1. 5ml細(xì)管中,加入10 μ 1 5Μ NaCl,100 μ 1異丙醇,置于_20°C冰箱中 15分鐘或更長(zhǎng)。在14,OOOrpm下離心10分鐘。吸去液體,用500 μ 1 80%乙醇溶液洗滌沉淀一次。室溫下風(fēng)干。DNA溶解于IOOmM磷酸鈉緩沖液(ρΗ7. 0)中,濃度為75ng/l·! 1。此溶液可直接點(diǎn)印到聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,l-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]協(xié)助下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。(2)制備帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)的芯片載體將分子量大于30萬(wàn)的聚丙烯酸溶于水中制成質(zhì)量體積比0. 的聚丙烯酸溶液。 取ΙΟΟμ 1質(zhì)量體積比0. 的聚丙烯酸溶液、ΙΟΟμ 1 0. IM 3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液(ρΗ7. 0)和50mg水溶性EDC[1-乙基_3_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽, l-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]混合溶解。置 60°C恒溫箱中反應(yīng) 2 小時(shí)。反應(yīng)物過s印hadex-50柱兩次除去未發(fā)應(yīng)的3_氨基丙基三乙氧基硅烷,得到反應(yīng)后的聚丙烯溶液。將反應(yīng)后的聚丙烯溶液移到96或384孔板。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到干凈玻璃表面 (干凈玻璃為低熒光背景的顯微玻片,經(jīng)超聲波水洗去除表面吸附物后在1-2M鹽酸中活化表面,表面經(jīng)脫水處理后可),然后置60°C恒溫箱干燥固化22小時(shí)即得帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)的芯片載體。芯片載體常溫干燥環(huán)境下保存待用。
(3)制備帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)的芯片將如上(1)制得的氨基化探針用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,芯片移到65°C恒溫箱中干燥30分鐘,在原探針點(diǎn)上點(diǎn)上新鮮配制的含0. 2M EDC的50%二甲基亞砜(DMSO)水溶液。芯片移到37°C、濕度75-85%的恒溫箱反應(yīng)過夜(約22小時(shí))。芯片用去離子水漂洗,移到65°C恒溫箱中干燥20分鐘。芯片放置在干燥器中常溫保存。(4)制備活化聚丙烯酸中介層的芯片載體步驟(2)制備的帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)的芯片載體可用如下兩種方法將羧基酯化活化。氨基化探針與活化的羧基在溫和條件形成穩(wěn)定的酰胺鍵。a)將羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole)溶于DMSO中制成0. 2M溶液,并將此溶液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到步驟(2)制備的帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在常溫下反應(yīng)2小時(shí),用無(wú)水丙酮洗去反應(yīng)液?;罨男酒d體可置于干燥器中常溫保存。b)將 EDC 和 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide,sulfo-NHS) 分別溶于DMSO中制備IM貯備液。將兩種貯備液稀釋到0. 2M和pH7. 2的磷酸鈉溶液,制成 0. IM EDC和0. IM sulfo-NHS的反應(yīng)液。將此液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到步驟(2)制備的帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在常溫下反應(yīng)3小時(shí),用體積百分比50%乙醇溶液洗去反應(yīng)液。載體風(fēng)干后置于干燥器中常溫保存。(5)用活化聚丙烯酸中介層的芯片載體和氨基化探針制備芯片將氨基化探針稀釋到0. IM碳酸氫鈉溶液中(pH9. 0),濃度調(diào)至75ng/y 1。將探針液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到步驟(4)制備的活化聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,在常溫(22 25°C )下反應(yīng)過夜。用TE (pH7. 6)緩沖液漂洗芯片兩次,再用體積百分比80%乙醇溶液清洗一次,芯片風(fēng)干后置于干燥器中常溫保存。(6)表面帶活性化學(xué)基團(tuán)探針點(diǎn)的基質(zhì)載體的制備將硅烷化合物稀釋在乙醇或異丙醇中成0. IM溶液,進(jìn)一步稀釋到質(zhì)量體積比50 % PEG300水溶液成硅烷化合物的終濃度為2mM的表面活化點(diǎn)印液。將表面活化點(diǎn)印液移到點(diǎn)印孔板(95或384孔板)。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到預(yù)設(shè)的玻片表面的探針點(diǎn)上,在50°C恒溫箱中固化36小時(shí)。用玻璃刀標(biāo)記玻片取向,將玻片浸入純水中洗去表面上的點(diǎn)印液,然后浸入無(wú)水丙酮中脫水。玻片在真空或充氮?dú)獾母稍锲髦斜4?。硅烷化合物為下列化合物可得氨基活化基團(tuán)4-氨基丁基三乙氧基硅燒(4-aminobutyltriethoxysilane) ;3_ 氨基丙基二甲基乙氧基娃燒(3-aminoprop y ldimethy lethoxy si lane) ;3_ 氨基丙基甲基-二乙氧基娃燒(3-aminopropy Imethy ldiethoxysilane) ;3-氛基丙基三乙氧基 5(3-aminopropyltriethoxysilane);
3-氨基丙基三輕基娃燒(3-aminopropylsilanetriol) ;3-氨基丙基三甲氧基娃烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)。硅烷化合物為下列化合物可得過氧基活化表面2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷[2-(3,4ip0XyCyCl0heXyl) ethyltrimethoxysilane] ;2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三乙氧基硅烷[2-(3,
4-epoxycycIohexy1) ethyltriethoxysi lane] ;5,6-環(huán)氧己基三乙氧基娃燒[5, 6-epoxyhexyltriethoxysilane] ;3-縮水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷 [(3-glycidoxypropyl) mehtyldiethoxysilane] ;3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl) triethoxysilane] ;3_縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl) trimethoxysilane]。硅烷化合物為下列化合物可得羧基活化表面 二氫-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮[3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride];羧乙基三羥基硅烷(carboxyethylsilanetriol)。用下列化合物可得醛基活化表面3-(三乙氧基硅基)丁醛[3-(triethoxysilyl)butyl aldehyde]。(7)紫外線交聯(lián)法制備基因芯片此方法能快速將探針固定到有DNA中介層的探針點(diǎn)。對(duì)靈敏度要求不高的芯片為首選法。步驟是將DNA探針稀釋到如下組成的點(diǎn)印液中50mM Tris-HCl (pH7. 5),體積百分比乙二醇,0. 2M NaCl,體積百分比5% DMS0,質(zhì)量體積比5% PEG300。探針濃度為50-150ng/yl。用點(diǎn)樣機(jī)將探針溶液點(diǎn)印到有DNA中介層的探針點(diǎn)上。芯片用 Mratalinker在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)5-15分鐘。然后,用純水漂洗芯片表面。芯片存于常溫干燥器中備用。(8)化學(xué)交聯(lián)法制備基因芯片用化學(xué)交聯(lián)劑也可很方便將DNA探針交聯(lián)固化到有DNA中介層的探針點(diǎn)上。步驟是將DNA探針稀釋到0. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 2)中,濃度控制在75ng/y 1。用點(diǎn)樣機(jī)將探針溶液點(diǎn)印到有DNA中介層的探針點(diǎn)上。隨后點(diǎn)印上5mM的交聯(lián)劑溶液?jiǎn)?dòng)交聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)在常溫下進(jìn)行2-5小時(shí)。反應(yīng)后用純水漂洗芯片表面。芯片置于0. IM硫醇溶液中將殘留交聯(lián)劑去活。芯片存于常溫干燥器中備用。下列的化合物可用作交聯(lián)劑1,4_ 丁二醇二縮水甘油醚(1,4-Butanediol diglycidyl ether);甘油二縮水甘油醚(Glycerol diglycidyl ether) ;二甘醇二縮水甘油醚(Diethylene glycol diglycidyl ether) ;1,4_ 環(huán)己烷二甲醇二縮水甘油醚(l,4-Cyclohexanedimethanol diglycidyl ether);新戊二醇二縮水甘油醚(Neopentyl glycol diglycidyl ether)。也可用戊二醛等交聯(lián)劑將探針關(guān)聯(lián)到DNA中介層上。但交聯(lián)反應(yīng)后,在純水中漂洗芯片后置于2M硼氫化納溶液中反應(yīng)2-5小時(shí),然后置2M乙胺溶液(pH9-10)中常溫反應(yīng)30分鐘封閉未反應(yīng)的醛基。(9)帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)的基因芯片制備方法將方法(7)制備的氨基化DNA探針溶液點(diǎn)印到帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,隨后點(diǎn)印0. IM的EDC DMSO溶液。在常溫Q2_25°C )下反應(yīng)2_4小時(shí)。芯片經(jīng)純水漂洗后風(fēng)干,置于干燥器中常溫下保存。(10)無(wú)中介層探針點(diǎn)的基因芯片制備方法對(duì)于靈敏度要求不高的基因芯片,DNA探針可直接交聯(lián)到帶活性化學(xué)基團(tuán)的探針點(diǎn)表面上。雖然存在多種化學(xué)方法可將DNA探針固化到表面上,本發(fā)明方法因活性基團(tuán)只限在探點(diǎn)內(nèi),因此本方法制備的基因芯片比通常用的整個(gè)表面都活化的芯片有更低的背景信號(hào),芯片因此也具有比傳統(tǒng)方法制備的芯片有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。各不同化學(xué)方法的操作步驟基本類似。首先,探針DNA稀釋在含20% DMSO的0. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 2) 中,探針濃度控制在50-150ng/y 1。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到用方法5制備的帶活性化學(xué)基團(tuán)探針點(diǎn)上。然后按不同活性基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的后處理步驟將探針固化。本方法不但適用于基因芯片的制備,還可用于制備其他生物芯片如蛋白質(zhì)芯片。制備基因芯片的探針長(zhǎng)度最好在100堿基以上,帶摻合氨基的探針效果更好。下列是不同化學(xué)基團(tuán)固化反應(yīng)在點(diǎn)印探針后的后處理方法。過氧基表面芯片存放在室溫下濕度為70-80%的環(huán)境中16-M小時(shí),用純水漂洗
19后浸在含25%硫醇的50%酒精中保存?zhèn)溆谩0被砻嫘酒?0-80%濕度環(huán)境下用Mratalinker在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)5-15分鐘。然后,用純水漂洗芯片表面。芯片存于常溫干燥器中備用。醛基表面芯片存放在室溫下濕度為70-80%的環(huán)境中3-8小時(shí),純水中漂洗芯片后置于2M硼氫化納溶液中反應(yīng)2-5小時(shí),芯片在純水中漂洗后移到2M乙胺溶液(pH9-10) 中常溫反應(yīng)30分鐘,芯片在純水中漂洗兩次。丙酮表面脫水后干燥器中常溫保存?zhèn)溆?。?shí)施例3 有中介層與無(wú)中介層芯片的靈敏度比較(I)DNA探針及芯片制備用如下四組引物(primer pairs)和用30ng的人基因組DNA在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(94°C 變性2分鐘,30次如下循環(huán)94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 20秒;最后72°C下2分鐘)下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。分別得到長(zhǎng)為337bp、52;3bp、322bp、及258bp的特異性探針約2 μ g。引物1-15,-TGGAACCAATGCACCTACA-3,
引物1-25,-GCGTGTGGATTGATGGAA-3‘;
引物2-15,-CACTCCTTCCAGGGTGGAA-3’
引物2-25,-TGGGAGCATCCAAGCAGA-3‘;
引物3-15,-AGACATCTTGGTCTGTAG-3’ ;
引物3-25,-GTGAATATCAAATACATGTT-3’
引物4-15,-AACCTCATGCTCCCTGCAG-3’
引物4-25,-CAAAGGCCAGAGAATAGTG-3‘。將所得探針經(jīng)乙醇沉淀處理純化,然后溶于點(diǎn)印液中(50mM Tris-HCl (pH7. 5),體積百分比乙二醇,0. 2M NaCl, 5% DMS0,質(zhì)量體積比5% PEG300),探針濃度調(diào)為75ng/ μ 1。將探針液點(diǎn)印到用實(shí)例1方法⑵②制備的帶Lambda DNA中介層的探針點(diǎn)上,芯片用Mratal inker在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)10分鐘。然后,用純水漂洗芯片表面。此為有中介層芯片。芯片風(fēng)干后備用。將探針液點(diǎn)印到用實(shí)例2方法(6)制備的帶氨基的玻片表面探針點(diǎn)上,在80% -90%濕度條件下,芯片用Mratalinker在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)10分鐘,用清水洗凈表面,由此得無(wú)中介層芯片。(2)芯片雜交試驗(yàn)由步驟(1)制備的有中介層和無(wú)中介層芯片各取一塊,在合成面對(duì)面結(jié)構(gòu)夾間用雙面薄透明粘帶將兩芯片粘定,中間隔成厚度約為30微米的間隙。將含3 μ g帶熒光標(biāo)記的基因組DNA的雜交反應(yīng)液(標(biāo)記的具體驗(yàn)操作及雜交反應(yīng)液和實(shí)例1中相同)充于間隙中,在60°C下反應(yīng)23小時(shí),用純水清洗芯片,氮?dú)獯蹈珊笥肞E ScannArray5000掃描儀錄取熒光圖像。如圖5所示兩種芯片的靈敏度有明顯的差別。定量分析比較結(jié)果表明有中介層的探針點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度是相應(yīng)無(wú)中介層探針點(diǎn)的20到50倍。實(shí)施例4直接連接法制備基因芯片將T4連接酶稀釋到連接反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl (pH 7. 5),IOmM MgCl2, 2mM 二硫蘇糖醇,ImMATPjj^ PEG 8000)中,濃度為100單位/ μ 1。用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到實(shí)施例 1步驟(2)②制備的帶DNA中介層探針點(diǎn)的芯片載體上的探針點(diǎn)上。將實(shí)施例1步驟( ③制備的高靈敏度高特異性探針稀釋在連接反應(yīng)緩沖液中,濃度調(diào)控到lOOng/μ 1,加入IObp隨機(jī)序列(Nltl)輔助引物至終濃度為20ng/y 1。將此探針溶液點(diǎn)印到如上已附有T4連接酶的探針點(diǎn)上。將芯片放到濕度為60-70%、溫度16°C的恒溫箱反應(yīng)18-20小時(shí)。然后,用純水漂洗芯片表面。芯片存于常溫干燥器中備用。實(shí)施例5穩(wěn)定性比較用Cai和Bradley方法制備的芯片在室溫下貯存超過6個(gè)月芯片的靈敏度即有明顯的降低。但用本發(fā)明方法制備得到的高特異性高靈敏度的基因芯片(實(shí)施例1制備的) 即使放置一年,其靈敏度仍無(wú)明顯改變(如圖8所示)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化, 均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高特異性高靈敏度的基因芯片,其特征在于為三層結(jié)構(gòu),底層為基質(zhì)載體,中間層為中介層,頂層為核酸探針層;所述的基質(zhì)載體為經(jīng)過超聲表面凈化處理及強(qiáng)酸活化的表面平整的固體,或是經(jīng)過超聲表面凈化處理及強(qiáng)酸活化后再進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)修飾使表面氨基化、醛基化、環(huán)氧基團(tuán)化或羧基化的表面平整的固體;所述的中介層的組成物質(zhì)為無(wú)意義DNA序列、帶羧基基團(tuán)的聚合物或是硅烷化的帶羧基基團(tuán)的聚合物;無(wú)意義DNA序列指的是與所用雜交反應(yīng)混合物無(wú)序列相似性即無(wú)雜交反應(yīng)的任何DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高特異性高靈敏度的基因芯片,其特征在于所述的表面氨基化是用有末端氨基的硅氧烷處理潔凈表面;有末端氨基的硅氧烷為 4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷、3-氨基丙基甲基-二乙氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三羥基硅烷或3-氨基丙基三甲氧基硅烷中的一種或至少兩種;所述的醛基化是用3-(三乙氧基硅基)丁醛處理表面;帶環(huán)氧基團(tuán)的硅氧烷化合物為2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷、2-(3,4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三乙氧基硅烷、5, 6-環(huán)氧己基三乙氧基硅烷、3-縮水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷或3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷中的一種或至少兩種;所述的環(huán)氧基團(tuán)化是帶環(huán)氧基團(tuán)的硅氧烷化合物處理表面;所述的羧基化是用帶羧基的硅氧烷處理表面;帶羧基的硅氧烷為二氫_3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮或羧乙基三羥基硅烷中的一種或兩種;所述的無(wú)意義DNA序列的長(zhǎng)度為500 50000bp ;所述的帶羧基基團(tuán)的聚合物為異丁烯馬來(lái)酸共聚物、乙烯馬來(lái)酸酐共聚物、甲氧基乙烯馬來(lái)酸共聚物)、丙烯酸馬來(lái)酸共聚物、聚O-乙基丙烯酸)、聚(2-丙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚(N-異丙基丙烯酰胺)、丙烯酸丙烯酰胺共聚物或聚丙烯酸中的一種或至少兩種;所述的核酸探針層中的核酸探針的長(zhǎng)度為100 5000bp ;所述的核酸探針的制備方法為化學(xué)合成法或PCR方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高特異性高靈敏度的基因芯片,其特征在于所述的核酸探針為通過化學(xué)合成法制備時(shí),得到的DNA產(chǎn)物需要進(jìn)行連接反應(yīng),得到長(zhǎng)度為100 5000bp的核酸探針;所述的核酸探針為通過PCR方法進(jìn)行制備時(shí),在PCR反應(yīng)中加入5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽,得到的帶有氨基修飾的核酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異性高靈敏度的基因芯片,其特征在于所述的連接反應(yīng)包括如下步驟將化學(xué)合成法制備得到的DNA產(chǎn)物、連接酶反應(yīng)緩沖液和T4 DNA磷酸化酶激酶混合,于37°C反應(yīng);然后加入與核酸探針等摩爾的8 12bp隨機(jī)序列引物,終濃度為質(zhì)量體積比15%的聚乙二醇,及終濃度為10-20單位的T4DNA連接酶,在16°C下反應(yīng) 16 30小時(shí),得到互相串接、長(zhǎng)度為100 5000bp的核酸探針;連接酶反應(yīng)緩沖液的組成如下pH7. 6、50mM Tris-HCl, IOmM MgCl2, IOmM 二硫蘇糖醇,ImM ATP ;所述的PCR反應(yīng)的條件為先在93°C變性3分鐘,然后進(jìn)行下系列溫度循環(huán)93°C 30 秒,55°C 30秒,72°C 30秒;進(jìn)行20次循環(huán)后,加入5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷_5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽,繼續(xù)循環(huán)10次,最后在72°C 延長(zhǎng)5分鐘;5-氨基烯丙基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸鈉鹽或5-氨基烯丙基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸鈉鹽在PCR反應(yīng)體系中的濃度為0. ImM。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異性高靈敏度的基因芯片,其特征在于所述的聚乙二醇為平均分子量大于2000乙二醇線性多聚物如PEG3400,PEG8000, PEG17000 ;所述的輔助引物是長(zhǎng)度為8 16個(gè)堿基的核苷酸,其序列與探針分子的兩端分別有至少4堿基的互補(bǔ)吻合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高特異性高靈敏度的基因芯片,其特征在于所述的連接反應(yīng)在組分為無(wú)意義DNA的中介層上進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的高特異性高靈敏度的基因芯片的制備方法,其特征在于(1)基質(zhì)載體的制備基質(zhì)載體經(jīng)超聲表面凈化處理及強(qiáng)酸活化后使用;或是進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)修飾使表面氨基化、醛基化、環(huán)氧基團(tuán)化或羧基化后使用;(2)中介層與基質(zhì)載體連接①中介層為無(wú)意義的DNA時(shí),將無(wú)意義的DNA點(diǎn)印到帶氨基的基質(zhì)載體的表面上,然后用紫外線將DNA與氨基交聯(lián),多余的表面氨基再用羧酐封閉去活;或是是將無(wú)意義的DNA點(diǎn)印到帶環(huán)氧基的基質(zhì)載體的表面上,表面的環(huán)氧基團(tuán)直接與DNA反應(yīng)形成交聯(lián);②中介層為帶有羧基的聚合物時(shí),帶有羧基的聚合物點(diǎn)印到帶氨基的基質(zhì)載體的表面上,氨基與羧基在碳化二亞胺的存在下縮合反應(yīng)形成交聯(lián);或首先將帶有羧基的聚合物硅烷化,再點(diǎn)印到經(jīng)超聲表面凈化處理及強(qiáng)酸活化后基質(zhì)載體的表面;(3)高靈敏度高特異性探針的制備根據(jù)檢測(cè)目的進(jìn)行設(shè)計(jì)、制備得到;(4)高特異性高靈敏度的基因芯片的制備將步驟C3)得到的高靈敏度高特異性的探針連接到步驟O)中的已連接在基質(zhì)載體上的中介層上,得到高特異性高靈敏度的基因芯片。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高特異性高靈敏度的基因芯片的制備方法,其特征在于步驟(1)中所述的基質(zhì)載體為低熒光背景的顯微玻片,其處理過程為經(jīng)超聲波水洗去除表面吸附物后在1 2M鹽酸中活化表面,表面經(jīng)脫水處理后直接用于承載經(jīng)硅烷化處理的中介層;或是酸活化表面進(jìn)一步處理使其帶有氨基、醛基或環(huán)氧基團(tuán),用于固定無(wú)化學(xué)修飾的中介層;步驟O)中所述的帶有羧基的聚合物為過如下方法制備得到的聚丙烯酸將分子量大于30萬(wàn)的聚丙烯酸溶于水中制成質(zhì)量體積比0. 的聚丙烯酸溶液;取100 μ 1前述制備得到的質(zhì)量體積比0. 的聚丙烯酸溶液、100 μ 1 pH7. 0,0. IM 3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液和50mg水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,混合溶解,置 60°C恒溫箱中反應(yīng)2小時(shí),得到的反應(yīng)物過sephadex-50柱兩次除去未發(fā)應(yīng)的3_氨基丙基三乙氧基硅烷,得到反應(yīng)后的聚丙烯溶液;步驟中所述的連接包括以下情形①中介層為無(wú)意義的DNA時(shí),化學(xué)合成法的核酸探針是通過連接酶連接到中介層中的無(wú)意義的DNA分子上;PCR方法法制備的核酸探針或從克隆中提取的DNA片段,是用紫外線交聯(lián)法將探針分子交聯(lián)到中介層中無(wú)意義的DNA上;或者通過化學(xué)交聯(lián)物將核酸探針分子連接到中介層,化學(xué)交聯(lián)劑為1,4_ 丁二醇二縮水甘油醚、甘油二縮水甘油醚、二甘醇二縮水甘油醚、1,4_環(huán)己烷二甲醇二縮水甘油醚或新戊二醇二縮水甘油醚;②中介層為帶有羧基的聚合物時(shí),與帶有氨基修飾的核酸探針反應(yīng)固定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高特異性高靈敏度的基因芯片的制備方法,其特征在于 步驟中所述的紫外線交聯(lián)法包括如下步驟將DNA探針稀釋到如下組成的點(diǎn)印液中 pH7. 5、50mM Tris-HCl,體積百分比1 %乙二醇,0. 2M NaCl,體積百分比5% DMS0,質(zhì)量體積比5% PEG300,探針濃度為50-150ng/ μ 1 ;用點(diǎn)樣機(jī)將探針溶液點(diǎn)印到有DNA中介層的探針點(diǎn)上,芯片用Mratalinker在254nm波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián)5-15分鐘;然后,用純水漂洗芯片表面,芯片存于常溫干燥器中備用;步驟中所述的通過化學(xué)交聯(lián)物將核酸探針分子連接到中介層的步驟如下將核酸探針稀釋到PH7. 2、0. IM磷酸鈉緩沖液中,核酸探針的濃度為75ng/y 1 ;接著用點(diǎn)樣機(jī)將探針溶液點(diǎn)印到有DNA中介層的探針點(diǎn)上,隨后點(diǎn)印上5mM的交聯(lián)劑溶液?jiǎn)?dòng)交聯(lián)反應(yīng),反應(yīng)在常溫下進(jìn)行2-5小時(shí);反應(yīng)后用純水漂洗芯片表面,芯片置于0. IM硫醇溶液中將殘留交聯(lián)劑去活;步驟(4)②中,當(dāng)所述的中介層為聚丙烯酸中介層時(shí),將氨基化核酸探針用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)印到帶聚丙烯酸中介層探針點(diǎn)上,芯片移到65°C恒溫箱中干燥30分鐘,在原探針點(diǎn)上點(diǎn)上新鮮配制的含0. 2M EDC的50%二甲基亞砜水溶液;芯片移到37°C、濕度75-85%的恒溫箱反應(yīng)過夜;反應(yīng)后的芯片用去離子水漂洗,移到65°C恒溫箱中干燥20分鐘。
10.權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的高特異性高靈敏度的基因芯片在臨床中作為檢測(cè)器材的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高特異性高靈敏度的基因芯片及其制備方法與應(yīng)用。該高特異性高靈敏度的基因芯片為三層結(jié)構(gòu),底層為基質(zhì)載體,中間層為中介層,頂層為核酸探針層。其中,核酸探針為根據(jù)檢測(cè)目的通過化學(xué)合成法或PCR法制備得到,得到的基因芯片不僅具有特異性,而且具有高出原位合成法芯片3-5倍的靈敏度。由于核酸探針分子不經(jīng)飾處理,因而有效規(guī)避了基于修飾探針隨帶的探針在溶液中和表面上因探針分子間的自交聯(lián)引起的芯片靈敏度隨貯存時(shí)間不斷降低的問題,因此本發(fā)明所述的基因芯片穩(wěn)定性高。將核酸探針固定于中介層上,核酸探針分子能遠(yuǎn)離表面因而極大減少表面的空間阻隔效應(yīng),大大提高雜交反應(yīng)的效率,進(jìn)一步提高該基因芯片的特異性和靈敏度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102168146SQ20111012984
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者蔡偉文 申請(qǐng)人:蔡偉文