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      一種產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌及發(fā)酵生產(chǎn)天然黑色素方法

      文檔序號:524833閱讀:486來源:國知局
      專利名稱:一種產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌及發(fā)酵生產(chǎn)天然黑色素方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于微生物研究技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌及發(fā)酵生產(chǎn)天然黑色素方法。該天然黑色素具有抗輻射、抗氧化作用,生產(chǎn)方法低成本、產(chǎn)量高,應(yīng)用廣泛。
      背景技術(shù)
      色素在人類的生產(chǎn)生活中被廣泛應(yīng)用在食品、印染、化妝品、醫(yī)藥、塑料、顏料等方面。由于化學(xué)合成色素對人體的毒性作用屢見報(bào)道,比之合成色素,天然色素所具有得環(huán)保、無污染、對人體無危害的特點(diǎn)。因此,天然色素的研究與應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注,社會可接受性極強(qiáng)。同時海洋生物資源的開發(fā)利用日益受到國家的重視,海洋生物由于特殊的生境能產(chǎn)生陸地生物所不具有的活性物質(zhì),已得到科技界的公認(rèn)。為此,科學(xué)界已把尋找資源的目標(biāo)轉(zhuǎn)向海洋微生物。黑色素(Melanin)是廣泛存在與動物、植物和微生物體中結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的黑色難溶性色素的總稱。這種色素能提高生物生存、競爭的能力。天然的黑色素不僅能吸收大部分可見光,還能吸收紫外線、χ射線、Y射線等多種輻射,因此,它具有保護(hù)體內(nèi)細(xì)胞免受輻射損傷的功能?;谔烊缓谏剡@一性質(zhì),目前國外已將其應(yīng)用與生產(chǎn)防曬和各類防輻射眼鏡等,但國內(nèi)尚未有這方面的應(yīng)用。黑色素還具有清除自由基、抗氧化的功能。由酪氨酸酶催化產(chǎn)生的黑色素阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化??扇苄院谏卦隗w外實(shí)驗(yàn)顯示具有抑制艾滋病病毒感染宿主細(xì)胞的作用,并認(rèn)為此類黑色素可能成為一種有效的抗病毒類新藥。黑色素還能用來治療某些與黑色素缺乏有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如著色性干皮病、帕金森氏癥、 老年性癡呆癥、亨廷氏舞蹈病等。一般自生物種分離純化產(chǎn)黑色素條件要求高,生長周期長,色素產(chǎn)量低,穩(wěn)定性差,國內(nèi)應(yīng)用較少。利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然色素,具有成本低廉、產(chǎn)出高等優(yōu)勢,應(yīng)用前景廣闊。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明涉及一種產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌及發(fā)酵生產(chǎn)天然黑色素方法。1、一種天然黑色素的生產(chǎn)方法,其特征在于其從一種海洋細(xì)菌培養(yǎng)物中提取黑色素,該菌須在含有酪氨酸(L-Tyr),同時含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏或牛肉粉,陳海水,控制初始PH為6. 1-7.8條件下進(jìn)行培養(yǎng);培養(yǎng)物采用高速離心去除菌體,調(diào)整清夜pH為2-4, 室溫孵育后離心去雜質(zhì),烘至恒重,有機(jī)溶劑洗脫得黑色素純品即天然黑色素。2、一種高產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌,其特征在于該菌隸屬于假交替單胞菌屬 (Pseudoalteromonas sp),其保藏號為 CGMCC 1782。本發(fā)明目的是提供了一種以添加酪氨酸為底物利用海洋細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的新工藝。一種以添加酪氨酸為底物利用海洋細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的方法及提純工藝, 在溫度^±2°C,葡萄糖為碳源0. -0.2%,蛋白胨為主要氮源0.4% -0.6%,另添加CaCl2O. 01% -0. 02%,并以L-酪氨酸(L-Tyr)O. 15% -0. 3% g為高產(chǎn)黑色素底物,以天然海水作為培養(yǎng)基用水,調(diào)節(jié)初始PH為7. 0,作為發(fā)酵生產(chǎn)黑色素條件。黑色素的提取和純化是將以上條件下將菌培至48h,發(fā)酵液過濾離心后除菌,以鹽酸調(diào)節(jié)清液PH為2 3,靜置12h,12000rpm高速離心,棄清夜將沉淀物置100°C烘干至恒重,即得到黑色素粗品,再經(jīng)三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分別洗滌粗品并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后以100°C干燥既得黑色素純品,純品黑色素色澤飽滿,對光、熱均有較好穩(wěn)定性,產(chǎn)量高。本發(fā)明的另一個目的為提供一種產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌。一種高產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌,其代號為DH-166,本發(fā)明所提供的海洋細(xì)菌DH-166 已于2006年8月16日在中國普通微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行了保藏,地址為北京市中關(guān)村北一條13號中科院微生物研究所,郵政編碼100080,保藏號為CGMCC 1782。該菌為革蘭氏陰性,菌體為短桿菌,側(cè)生兩根鞭毛,未觀察到芽孢產(chǎn)生,有運(yùn)動性, 為嚴(yán)格好氧菌。葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)陰性,不產(chǎn)氣,淀粉酶試驗(yàn)陰性,明膠酶試驗(yàn)陽性,卵磷脂酶試驗(yàn)陽性,氧化酶試驗(yàn)陽性,硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性,檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性,H2S產(chǎn)生試驗(yàn)陽性,精氨酸雙水解試驗(yàn)陰性,經(jīng)16srDNA序列分析為I^seudoalteromonas sp.。該菌株在15°C _35°C均能生長,為最適生長溫度。在鹽度0% -8%范圍內(nèi)均能生長,控制培養(yǎng)基鹽度為2% -3%情況下生長狀況較佳。色素產(chǎn)生菌對培養(yǎng)條件有一定的要求,在以葡萄糖0. -0.2%,蛋白胨 0. 4% -0.6%,L-TyO. 2 % -0.4%,CaCl2O. 01 % -0. 02 %,天然海水為培養(yǎng)基用水,瓊脂 1.5%-20% (液體培養(yǎng)無需添加),初始pH為6. 1-7. 8的培養(yǎng)條件下可快速生長并可見黑色素產(chǎn)出,該條件可通過發(fā)酵系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。
      具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的涉及一株高產(chǎn)黑色素海洋細(xì)菌及色素提取方法包括以下實(shí)施例,下面的實(shí)施例可進(jìn)一步說明本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。具體實(shí)施案例11、菌株的活化與純化DH166在初始pH7. 2,陳海水為培養(yǎng)基用水的2216E培養(yǎng)基上生長情況尚可,菌落呈黑色,表面光滑,直徑2 3mm,菌落周圍的培養(yǎng)基有較為明顯黑色素產(chǎn)生。挑取周圍呈現(xiàn)明顯黑色的菌落,進(jìn)一步培養(yǎng)。2、菌株的液體培養(yǎng)控制牛肉膏0. 5%,蛋白胨0. 5%,海水為培養(yǎng)基用水配制液體培養(yǎng)基,控制培養(yǎng)基鹽度為3%,分裝至容量為IOOOml三角瓶中,調(diào)節(jié)pH為7. 2,以搖床控制培養(yǎng)條件為^°C,生長狀況較佳。3、發(fā)酵設(shè)備高密度培養(yǎng)發(fā)酵罐高密度培養(yǎng);以葡萄糖0. 15%,蛋白胨0.56%, L-Ty, 2. 5%, CaCl2O. 01%,天然海水為培養(yǎng)基用水,初始pH為7.2的培養(yǎng)條件下可快速生長并可見黑色素產(chǎn)出,經(jīng)二級擴(kuò)培,擴(kuò)大至7升發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),控制轉(zhuǎn)速150rpm,溫度 28. 5°C,罐壓 0. 003MPa。4、黑色素的提取經(jīng)60h培養(yǎng),下罐獲取發(fā)酵液,添加0.5%的明礬作為絮凝劑,經(jīng) 24h冷藏沉淀,取上清液以鹽酸調(diào)節(jié)pH為2,4°C _6°C低溫靜置10小時,12000rpm高速離心,棄清夜將沉淀物置80°C烘干至恒重,即得到黑色素粗品,再經(jīng)三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分別洗滌粗品并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后以80°C干燥既得黑色素純品,產(chǎn)量可達(dá)1. 275g/L。
      具體實(shí)施案例21、菌株的活化與純化DH166在初始pH7. 6,陳海水為培養(yǎng)基用水的2216E培養(yǎng)基上生長情況尚可,菌落呈黑色,表面光滑,直徑2 3mm,菌落周圍的培養(yǎng)基有較為明顯黑色素產(chǎn)生。挑取周圍呈現(xiàn)明顯黑色的菌落,進(jìn)一步培養(yǎng)。2、菌株的液體培養(yǎng)控制牛肉膏0,5%,蛋白胨0.5%,海水為培養(yǎng)基用水配制液體培養(yǎng)基,控制培養(yǎng)基鹽度為3%,分裝至容量為IOOOml三角瓶中,調(diào)節(jié)pH為7. 6,以搖床控制培養(yǎng)條件為^°C,生長狀況較佳。3、發(fā)酵設(shè)備高密度培養(yǎng)發(fā)酵罐高密度培養(yǎng);以葡萄糖0. 15%,蛋白胨0.56%, L-Ty, 2. 5%, CaCl2O. 01%,天然海水為培養(yǎng)基用水,初始pH為7.6的培養(yǎng)條件下可快速生長并可見黑色素產(chǎn)出,經(jīng)二級擴(kuò)培,擴(kuò)大至7升發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),控制轉(zhuǎn)速150rpm,溫度 28. 5°C,罐壓 0. 003MPa。4、黑色素的提取經(jīng)60h培養(yǎng),下罐獲取發(fā)酵液,添加0. 5%的明礬作為絮凝劑,經(jīng) 24h冷藏沉淀,取上清液以鹽酸調(diào)節(jié)pH為2,4°C _6°C低溫靜置10小時,12000rpm高速離心,棄清夜將沉淀物置80°C烘干至恒重,即得到黑色素粗品,再經(jīng)三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分別洗滌粗品并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后以80°C干燥既得黑色素純品,產(chǎn)量可達(dá)1. 275g/L。海洋細(xì)菌的分離純化及16S鑒定實(shí)驗(yàn)自東海海水中分離出一株高產(chǎn)胞外黑色素的細(xì)菌DH166。利用PCR技術(shù)對其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增,測序后將所得的序列進(jìn)行相似性搜索,結(jié)果顯示與其相似度最高的菌為 Pseudoalteromonas sp.幾-300,其相似度為96. 18 % ·初步鑒定DH166屬假交替單胞菌屬G^seudoalteromonas)的一個新種。序列已提交到GenBank,序列收錄號為DQ493656。 DH166具有產(chǎn)黑色素速度快,產(chǎn)量高且大量向培養(yǎng)基分泌等優(yōu)點(diǎn)。鑒于DH166的產(chǎn)黑色素特性,將成為該屬的一個新的菌種資源DH166在海水配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長良好,菌落呈黑色,表面光滑, 直徑2 3mm,由于細(xì)菌向培養(yǎng)基中分泌色素,菌落周圍的培養(yǎng)基呈現(xiàn)黑色。該菌株在 150C -350C均能生長,觀士 2°C為最適生長溫度。在鹽度0 % -8 %范圍內(nèi)均能生長,控制培養(yǎng)基鹽度為2% -3%情況下生長狀況較佳。在酪氨酸培養(yǎng)基中,可以觀察到細(xì)菌向周圍的培養(yǎng)基中分泌黑色色素,酪氨酸對于色素的產(chǎn)量具有明顯的促進(jìn)作用。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示該菌為革蘭氏陰性,菌體為短桿菌,側(cè)生兩根鞭毛,未觀察到芽孢產(chǎn)生,有運(yùn)動性,為嚴(yán)格好氧菌。葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)陰性,不產(chǎn)氣,淀粉酶試驗(yàn)陰性,明膠酶試驗(yàn)陽性,卵磷脂酶試驗(yàn)陽性,氧化酶試驗(yàn)陽性,硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性,檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性,H2S產(chǎn)生試驗(yàn)陽性,精氨酸雙水解試驗(yàn)陰性。將細(xì)菌接種在平板上,28°C培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于50 μ L無菌蒸餾水中,于 100°C水浴加熱5min,8000rpm離心,取上清作為PCR模板DNA。擴(kuò)增16S rRNA 基因的正向引物為 27F 5,-AGAGTTTGATC (C/A) TGGCTCAG-3,(對應(yīng)于E. coli 16S rRNA基因的第8 27個堿基位置),反向引物1492R:5,-TACGG(C/T) TACCTTGTTACGACTT-3,(對應(yīng)于 Ε· coli 16S rRNA 基因的第 1492 1510 個堿基位置)。在 100μ L 的 PCR 反應(yīng)體系中含有10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ L, dNTP Mixture 8 μ L, 弓丨物各2 μ L,Taq DNA聚合酶0. 6 μ L (5U/μ L),DNA模板2 μ L。PCR反應(yīng)條件為96°C預(yù)變性6min ;接94 °C變性lmin,5(TC復(fù)性lmin,72°C延伸2min,30個循環(huán);最后72°C溫育 6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。經(jīng)16srDNA序列分析為 Pseudoalteromonassp. 0搖瓶培養(yǎng)高產(chǎn)黑色素條件優(yōu)化;黑色素產(chǎn)生菌對培養(yǎng)條件有一定的要求,在以葡萄糖0. 1%,蛋白胨0.4%,L-Ty, 2. 5%, CaCl2O. 01 %,天然海水為培養(yǎng)基用水,瓊脂1.5% (液體培養(yǎng)無需添加),初始PH為7. O的培養(yǎng)條件下可快速生長并可見黑色素產(chǎn)出,該條件可通過發(fā)酵系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。黑色素提純;將已培養(yǎng)至48h的發(fā)酵液過濾離心后除菌,以鹽酸調(diào)節(jié)清液PH為2, 靜置10小時,12000rpm高速離心,棄清夜將沉淀物置100°C烘干至恒重,即得到黑色素粗品,再經(jīng)三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分別洗滌粗品并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后以100°C干燥既得黑色素純品,純品黑色素色澤飽滿,對光、熱均有較好穩(wěn)定性。
      權(quán)利要求
      1.一種天然黑色素的生產(chǎn)方法,其特征在于其從一種海洋細(xì)菌培養(yǎng)物中提取黑色素, 該菌須在含有酪氨酸,同時含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏或牛肉粉,陳海水,控制初始PH 為6. 1-7. 8條件下進(jìn)行培養(yǎng);培養(yǎng)物采用高速離心去除菌體,調(diào)整清夜pH為2-4,室溫孵育后離心去雜質(zhì),烘至恒重,有機(jī)溶劑洗脫得黑色素純品即天然黑色素。
      2.權(quán)利要求1所述的一種天然黑色素的生產(chǎn)方法的海洋細(xì)菌,其特征在于該菌隸屬于假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas sp,其保藏號為CGMCC 1782。
      全文摘要
      本發(fā)明屬于微生物研究技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌及發(fā)酵生產(chǎn)天然黑色素方法。從一種海洋細(xì)菌培養(yǎng)物中提取黑色素,該菌須在含有酪氨酸(L-Tyr),同時含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏或牛肉粉,陳海水,控制初始pH為6.1-7.8條件下進(jìn)行培養(yǎng);培養(yǎng)物采用高速離心去除菌體,調(diào)整清夜pH為2-4,室溫孵育后離心去雜質(zhì),烘至恒重,有機(jī)溶劑洗脫得黑色素純品即天然黑色素。該菌隸屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp),其保藏號為CGMCC No.1782。該天然黑色素具有抗輻射、抗氧化作用,生產(chǎn)方法低成本、產(chǎn)量高,應(yīng)用廣泛。
      文檔編號C12P1/04GK102229965SQ20111012990
      公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月11日
      發(fā)明者杜宗軍, 邢翔, 陳冠軍 申請人:山東大學(xué)威海分校
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