專利名稱：用腸桿菌sy-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物酶，尤其是涉及一種用陰溝腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶O^e-SOD)的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)簡稱S0D，是一種廣泛存在于自然界的生物酶，具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)。1930年，由Keilin和 Marm發(fā)現(xiàn)SOD。當(dāng)時(shí)，他們僅認(rèn)為是一種蛋白質(zhì)，并命名為血銅蛋白。1968年，美國生化專家Fridovich和Mccord從牛紅細(xì)胞中提取出S0D，并報(bào)告SOD有清除自由基的作用。羅伯·佛契哥特、費(fèi)瑞·慕拉德和路伊格納洛3位美國科學(xué)家共同發(fā)現(xiàn)自由基所引起的各種分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的改變，并指出SOD是以自由基為底物的生物酶，是人體內(nèi)重要的自由基清除劑。因此1998年度的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予他們。現(xiàn)人們已從動(dòng)物、植物和微生物等各種生物體內(nèi)分離得到SOD。按所含金屬種類不同SOD可分為Cu，Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD 和 Ni-S0D4 種?，F(xiàn)在市場上出售的SOD大多都從血液中提取，屬于Cu，Zn-SOD。其分子由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含有一個(gè)銅離子和一個(gè)鋅離子，分子量在32000左右。由于從動(dòng)物血液中提取S0D，難以消除各種病毒及外源污染，因此從動(dòng)物血液中提取Cu，Zn-SOD有很大的風(fēng)險(xiǎn)。 歐盟已于1999年頒布法令，禁止從動(dòng)物血液中提取的SOD用于人類。盡管目前歐盟之外的國家和地區(qū)尚無類似規(guī)定，但用其他更安全的、更經(jīng)濟(jì)的提取或合成方法取代從動(dòng)物血液中提取S0D，將是一個(gè)趨勢。從植物中提取SOD也有其明顯的局限性，如植物生長周期長，植物的栽培受到季節(jié)和地域限制也很大，因此從微生物中獲得SOD的研究在國內(nèi)外興起。目前，美國、日本和加拿大等國已經(jīng)開始采用微生物菌種及基因重組等生物工程技術(shù)來獲得S0D。我國也有從微生物提取SOD的報(bào)道。例如，王歲樓等(王歲樓.等，工業(yè)微生物，1997，27 O) 45-47)報(bào)道用甲笨破壁法從耐高溫酒精活性干酵母中提取S0D，在初步優(yōu)化的提取條件下SOD產(chǎn)量可達(dá)1097U/g。楊明琰等(楊明琰.等，食品科學(xué)，2005, ) 159-161)從釀酒酵母BUV094發(fā)酵液中提取得到的S0D，其比活為1015U/mg。從當(dāng)前報(bào)道看，微生物生產(chǎn)SOD產(chǎn)量都不高，這不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此獲得高產(chǎn)的菌種及其穩(wěn)定培養(yǎng)的方法是工業(yè)化大生產(chǎn)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用陰溝腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法。本發(fā)明所采用的菌株是從福建省武夷山保護(hù)區(qū)土壤中分離出的革蘭氏陰性細(xì)菌， 該菌為革蘭陰性粗短桿菌，寬約0. 6 1. 1 μ m，長約1. 2 3. 0 μ m,周身鞭毛，無芽孢無莢膜，兼性厭氧，在LB培養(yǎng)基上就能生長形成大而濕潤的黏液狀菌落。鑒定該菌株為陰溝腸桿菌SY-8 (Enterobacter cloacae SY-8)，該菌株已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 保藏日期為2011年02月沘日，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 4622。所述用陰溝腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法包括以下步驟1)取液氮保藏的菌株陰溝腸桿菌SY-8，接入裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中振蕩培養(yǎng)， 使菌株復(fù)蘇；在步驟1)中，所述菌株與LB培養(yǎng)基的體積比可為1 (10 200)，最好為 1 100;所述LB培養(yǎng)基的組成為每升LB培養(yǎng)基中含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，pH = 7. 2 ；所述振蕩培養(yǎng)的條件可為溫度為觀 37°C，最好為30°C，置于150 MOr/min，最好為200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。2)將復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，即可獲得發(fā)酵液；在步驟2)中，所述復(fù)蘇后的菌液的體積百分比用量可為LB培養(yǎng)基的 10%; 所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度可為觀 37°C，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間可為16 Mh ；所述誘導(dǎo)劑可采用 !^3+或H202，所述!^3+的濃度可為100 500mg/L，所述H202的體積比可為 5% ； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間可為M 48h。3)將發(fā)酵液離心，獲得菌體，將菌體重懸于磷酸緩沖液(PBS buffer)制得含菌體菌懸液，再將菌懸液破碎，然后通過離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，即為鐵型超氧化物歧化酶粗酶液，再將鐵型超氧化物歧化酶粗酶液經(jīng)硫酸氨分級沉淀，得到的沉淀物再用磷酸緩沖液(PBS buffer)重懸后用丙酮沉淀，即可得到純化的鐵型超氧化物歧化酶。在步驟幻中，所制得的含菌體菌懸液中含有菌體10% (w/v)；所述將菌懸液破碎可通過高壓細(xì)胞破碎方法破碎；所述硫酸氨分級沉淀中硫酸氨的濃度可為35% 80% (W/ V)，在硫酸氨65%的濃度中可以獲得90%的酶活性；所述丙酮沉淀中丙酮的用量按體積百分比可為磷酸緩沖液重懸液的30% 50%，最好為36%。通過上述方法獲得的超氧化物歧化酶經(jīng)ICP-AES分析，發(fā)現(xiàn)每毫克蛋白含狗2+， Cu2+/Zn2+, Mn2+，Ni2+金屬離子的含量分別為 2. 3μ g，0. 01/0. 008 μ g，0· 005 μ g，0· 006 μ g。 說明該酶是鐵型的超氧化物歧化酶0^-SOD)。變性與非變蛋白質(zhì)電泳分析(SDS-PAGE)證明，每個(gè)酶分子為有含有兩個(gè)相同的亞基。經(jīng)計(jì)算可知每個(gè)蛋白質(zhì)亞基中含1個(gè)二價(jià)鐵離子。鐵型超氧化物歧化酶可以清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基，延緩由于自由基侵害而出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，即延緩衰老和脂褐素沉淀的出現(xiàn)。因此，該酶可以添加到化妝品中，也可以制成噴霧型制劑用于保養(yǎng)皮膚。鐵型超氧化物歧化酶可以提高人體因自由基誘發(fā)的疾病的抵抗力，包括對炎癥、腫瘤、白內(nèi)障和自身免疫疾病等有明顯的作用。因此，它也可作為食品添加劑使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1腸桿菌SY-8在5L發(fā)酵罐生產(chǎn)SOD1.菌種的復(fù)蘇取液氮保藏的種子菌，按1 100比例接入裝有300ml液體培養(yǎng)基(pH 7 8)的 IOOOml三角瓶中，在好氧、常壓、30°C條件下將其置于200轉(zhuǎn)/分鐘搖床中振蕩培養(yǎng)過夜使菌種復(fù)蘇。2.腸桿菌SY-8在5L發(fā)酵罐生產(chǎn)SOD將復(fù)蘇后的菌種按照菌液與培養(yǎng)基1 20的比例轉(zhuǎn)接入裝有3L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)24h之后，加入200mg/L的狗3+或體積比為2% H2O2為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 之后收集菌體進(jìn)行SOD提取。結(jié)果表明用200mg/L的!^3+作為誘導(dǎo)劑時(shí)，每升發(fā)酵液可生提取出3000IU/mg的鐵型超氧化物歧化酶2. 16g ；用2%的H2A作為誘導(dǎo)劑時(shí)，每升發(fā)酵液可生提取出3000IU/mg的鐵型超氧化物歧化酶為2. 032g。實(shí)施例2不同濃度!^3+和H2A誘導(dǎo)培養(yǎng)對產(chǎn)量的影響按實(shí)施例1的方案在不同!^3+和H2O2濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)對產(chǎn)量的影響。不同濃度1 3+ 和H2A對產(chǎn)量的影響結(jié)果如表1所示。表1不同濃度!^3+和H2A對產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述腸桿菌 SY-8 (Enterobacter cloacae SY-8)已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2011年02月28日，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 4622 ；所述用陰溝腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法包括以下步驟1)取液氮保藏的菌株陰溝腸桿菌SY-8，接入裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中振蕩培養(yǎng)，使菌株復(fù)蘇；2)將復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，即可獲得發(fā)酵液；3)將發(fā)酵液離心，獲得菌體，將菌體重懸于磷酸緩沖液制得含菌體菌懸液，再將菌懸液破碎，然后通過離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，即為鐵型超氧化物歧化酶粗酶液，再將鐵型超氧化物歧化酶粗酶液經(jīng)硫酸氨分級沉淀，得到的沉淀物再用磷酸緩沖液重懸后用丙酮沉淀，即可得到純化的鐵型超氧化物歧化酶。
2.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述菌株與LB培養(yǎng)基的體積比為1 10 200，最好為1 100。
3.如權(quán)利要求2所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述LB培養(yǎng)基的組成為每升LB培養(yǎng)基中含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉 10g, pH = 7. 2。
4.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述振蕩培養(yǎng)的條件為溫度為觀 37°C，最好為30°C，置于150 MOr/min，最好為200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述復(fù)蘇后的菌液的體積百分比用量為LB培養(yǎng)基的 10%。
6.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為觀 37°C，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為16 Mh。
7.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟幻中，所述誘導(dǎo)劑采用1 3+或H2O2，所述1 3+的濃度為100 500mg/L，所述H2A 的體積比為 5% ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為M 48h。
8.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟幻中，所制得的含菌體菌懸液中含有菌體10%。
9.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟幻中，所述將菌懸液破碎是通過高壓細(xì)胞破碎方法破碎。
10.如權(quán)利要求1所述的用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，在步驟幻中，所述硫酸氨分級沉淀中硫酸氨的濃度為35% 80% ；所述丙酮沉淀中丙酮的用量按體積百分比為磷酸緩沖液重懸液的30% 50%，最好為36%。
全文摘要
用腸桿菌SY-8發(fā)酵生產(chǎn)鐵型超氧化物歧化酶的方法，涉及一種生物酶取液氮保藏的菌株陰溝腸桿菌SY-8，接入裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中振蕩培養(yǎng)使菌株復(fù)蘇；將復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后，得發(fā)酵液，離心，獲得菌體，再重懸于磷酸緩沖液制得含菌體菌懸液，再將菌懸液破碎，然后通過離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，即為鐵型超氧化物歧化酶粗酶液，再將鐵型超氧化物歧化酶粗酶液經(jīng)硫酸氨分級沉淀，得沉淀物再用磷酸緩沖液重懸后用丙酮沉淀，得純化的鐵型超氧化物歧化酶。鐵型超氧化物歧化酶可清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基，延緩由于自由基侵害而出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，即延緩衰老和脂褐素沉淀的出現(xiàn)。
文檔編號C12N9/08GK102154235SQ20111013265
公開日2011年8月17日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者程揚(yáng)健, 鄭良山 申請人:福建百奧生物科技有限公司