專利名稱：河流環(huán)境樣品中微生物dna的簡易提取的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種河流環(huán)境樣品中微生物DNA的簡易提取，該方法借助生物技術手段，對環(huán)境樣品進行處理，屬于環(huán)境科學與生物工程技術領域。
背景技術：
環(huán)境樣品是一種十分復雜的體系，一般由多種生物組成且化學成分復雜，如河流底泥是由細菌等微生物和原生動物、后生動物等微型動物組成的生態(tài)系統(tǒng)與膠體物質結合所形成的絮狀體顆粒。因此，環(huán)境樣品具有菌群結構多樣、菌群功能復雜、可能含有腐殖酸、 有機物、重金屬等DNA雜交和PCR擴增抑制劑等特點。以往提取的河流底泥DNA中含有較多腐殖酸等雜質，雜質會嚴重影響后續(xù)的分子生物學實驗操作，同時針對河流底泥細菌群落多樣性的研究也鮮有報道。另外，目前商業(yè)化的底泥DNA提取試劑盒其效果仍不理想，難以滿足各種分子生物學實驗操作的需求。因此，建立簡便、有效的底泥DNA提取方法勢在必行。在河流底泥DNA提取過程中發(fā)現(xiàn)，底泥中的懸浮物、膠體物質、硫化物、腐殖質等對溶菌酶、蛋白酶K和Taq酶的活性有抑制作用，導致提取的DNA量少，純度不夠，不能準確地反應底泥中微生物的多樣性和種群豐度。若抑制物含量高則會影響PCR反應的效果， 導致PCR產量低甚至擴增失敗，成為后續(xù)變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術、單鏈構象多態(tài)性 (SSCP)技術等分子操作的限速步驟。Stach等比較了 4種純化土壤微生物總DNA粗提液的方法結果表明，DNA純度是影響PCR成功的關鍵，同時采用的DNA提取方法能否使環(huán)境微生物細胞完全裂解和DNA充分釋放則是影響環(huán)境微生物多樣性檢測結果的關鍵因素。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有河流環(huán)境樣品中微生物DNA提取步驟繁多、操作時間長、所用試劑價格昂貴，以及提取的DNA量少、純度不夠，不能準確地反應河流環(huán)境樣品中微生物的多樣性和種群豐度等問題，而提供的一種河流環(huán)境樣品中微生物DNA的簡易提取方法。該方法可將大量腐殖酸和蛋白質去除，所得環(huán)境樣品微生物的DNA可直接用于PCR 等分子操作，并利用PCR-DGGE技術進行細菌多樣性分析，表明該方法能夠有效地反映河流環(huán)境樣品中細菌多樣性和種群豐度等問題。本發(fā)明提供的河流環(huán)境樣品中微生物DNA的簡易提取方法，是將河流環(huán)境樣品分為水樣和底泥樣品兩部分，分別對其進行微生物DNA的提取，同時該方法也可以作為其中任何一種環(huán)境樣品的單獨提取方法，具體步驟是第1、河流環(huán)境樣品中微生物細胞裂解第1. 1、河流水樣中微生物細胞裂解第1. 1. 1、河流水樣的富集處理取2L水樣經0. 22um滅菌膜過濾后，收集濾膜，將其剪碎置于IOmL無菌離心管中， 加入2mL無菌水，漩渦震蕩5分鐘，SOOOrpm離心10分鐘，得到富集的上清液；
第1. 1. 2、河流水樣中微生物細胞裂解量取2mL第1. 1. 1、步處理后的水樣于IOmL無菌離心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer, DNA Extraction Buffer 1 IOOmmol Tris-HClUOOmmol Na2EDTA^ 1. 5mol NaCl和質量濃度為的PVP30000。同時向IOmL離心管中加入0. 5mL 50mg/mL的溶菌酶，漩渦震蕩直至混勻；37°C水浴2h，加入Im質量濃度為20%的SDS，65°C水浴30分鐘，中間輕輕搖晃離心管2-3次，8000rpm離心15分鐘，取上清；第1. 2、底泥樣品中微生物細胞裂解第1. 2. 1、稱取Ig底泥于IOmL無菌離心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer, 渦震蕩10分鐘，加入ImL質量濃度為20%的SDS，漩渦充分；將離心管置于液氮中30s，再置于65°C水浴20分鐘；重復此操作1-2次，取出樣品，SOOOrpm離心15分鐘；將上清液轉移置另一 IOmL無菌離心管中，待用；第1. 2. 2、向第 1. 2. 1 步的沉淀物中加入 2mL DNA Extraction Buffer 和 0. 5ml 50mg/mL的溶菌酶，漩渦震蕩直至混勻；37°C水浴池，加入ImL質量濃度為20%的SDS，65°C 水浴30分鐘，中間輕輕搖晃離心管2-3次，SOOOrpm離心15分鐘，將上清液與第1. 2. 1、步的上清液混合；第2、粗DNA溶液的獲得向第1、步得到的河流水樣和底泥樣品的微生物細胞裂解上清液中，分別加入等體積的苯酚氯仿異戊醇=25 24 1的混合液，上下顛倒抽提；12000rpm離心10分鐘，取上清；用氯仿異戊醇=M 1的混合液再抽提一次，12000rpm離心10分鐘，取上
清液；第3、微生物DNA的獲得向第2、步抽提后的上清液中分別加入0. 1倍體積的NaAc和0. 6倍體積的異丙醇，-20°C放置Ih ； 12000rpm離心20分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1_2次，自然風干， 用50 μ L TE溶解即環(huán)境樣品微生物DNA，TE溶液包括pH 8. 0的10mmol/L Tris-HCl和pH 8.0 的 lmmol/L EDTA。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明所述的方法是利用液氮反復凍融法、SDS法、溶菌酶法等方法組合，能夠使河流環(huán)境樣品中細菌細胞充分裂解并使DNA完全釋放，經PCR-DGGE技術進行細菌多樣性分析后表明，該方法能夠有效的反映河流環(huán)境樣品中微生物的完整性和多樣性。通過異丙醇等有機溶劑沉淀后，用紫外分光光度計測定0皿60/0D230為1. 35、0D260/0D280值為 1. 65(注:0D260/0D230 >2.0時，腐殖酸和有機酸含量極低；0D260/0D280 > 1. 7時蛋白質含量極低)，可直接應用于分子操作，具有很強的實用性。


圖1、提取環(huán)境樣品中微生物DNA的電泳圖譜；第1泳道天津海河水樣中微生物DNA第2泳道天津海河底泥樣品中微生物DNA第3泳道遼寧渾河水樣中微生物DNA第4泳道遼寧渾河底泥樣品中微生物DNA
第5泳道天津地區(qū)土壤中微生物DNA第6 泳道Marker λ -Hind III DNA圖2、提取河流環(huán)境中微生物DNA擴增16S rDNA電泳圖譜；第1 泳道Marker :DL 2000第2泳道天津海河水樣中微生物DNA
第3泳道天津海河底泥樣品中微生物DNA第4泳道遼寧渾河水樣中微生物DNA第5泳道遼寧渾河底泥樣品中微生物DNA第6泳道天津地區(qū)土壤中微生物DNA第7泳道陰性對照圖3、提取環(huán)境樣品中微生物DNA PCR-DGGE電泳圖譜；第1、2泳道天津海河水樣中微生物DNA第3、4泳道天津地區(qū)土壤中微生物DNA第5、6泳道天津海河底泥樣品中微生物DNA第7、8泳道遼寧渾河底泥樣品中微生物DNA第9、10泳道遼寧渾河水樣中微生物DNA
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的應用范圍并不僅限于此，對于普通土壤、活性污泥、湖泊沉積物、池塘底泥及各種水樣等微生物的DNA都有較好的提取效率。實施例1 天津海河環(huán)境樣品中微生物DNA的提取1、底泥樣品中微生物DNA的提取(1)底泥樣品中微生物細胞裂解稱取Ig底泥于IOmL無菌離心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，漩渦震蕩 10分鐘，加入ImL質量濃度為20%的SDS，漩渦充分。將離心管置于液氮中30s后，再置于 65°C水浴20分鐘；重復此操作1-2次。取出樣品，SOOOrpm離心15分鐘。將上清液轉移置另一 IOmL無菌離心管中，待用。向沉淀物中加入2mL DNA Extraction Buffer和0. 5ml 50mg/mL的溶菌酶，漩渦震蕩直至混勻。37°C水浴池，加入ImL質量濃度為20%的SDS，65°C水浴30分鐘，中間輕輕搖晃離心管2-3次，SOOOrpm離心15分鐘。將以上兩步得到的上清液混合。⑵粗DNA溶液的獲得向(1)步獲得的上清液中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)混合液，上下顛倒抽提。12000rpm離心10分鐘，取上清。用氯仿/異戊醇04 1)再抽提一次，12000rpm離心10分鐘，吸取上清。(3)底泥樣品中微生物DNA的獲得向(2)步抽提后的上清液中加入0. 1倍體積的NaAc和0. 6倍體積的異丙醇，-20°C 放置lh。12000rpm離心20分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1_2次，自然風干，用TE溶解即底泥樣品中微生物DNA。
2、水樣中DNA的提取取2L水樣經0. 22um滅菌膜過濾，收集濾膜，將其剪碎置于IOmL無菌離心管中，加入2mL無菌水，漩渦震蕩5分鐘，SOOOrpm離心10分鐘，得到富集的上清液。(1)水樣中微生物細胞裂解量取anL處理后的水樣于IOmL無菌離心管中，加入^nL DNA Extraction Buffer 和0. 5mL 50mg/mL的溶菌酶，漩渦震蕩直至混勻。37°C水浴池，加入ImL質量濃度為20% 的SDS，65°C水浴30分鐘，中間輕輕搖晃離心管2-3次，8000rpm離心15分鐘，取上清。⑵粗DNA溶液的獲得向(1)步獲得的上清液中分別加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1) 混合液，上下顛倒抽提。12000rpm離心10分鐘，取上清。用氯仿/異戊醇04 1)再抽提一次。12000rpm離心10分鐘，取上清。(3)水樣中微生物DNA的獲得向(2)步抽提后的上清液中加入0. 1倍體積的NaAc和0. 6倍體積的異丙醇，-20°C 放置lh。12000rpm離心20分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1_2次，自然風干，用50 μ L TE溶解即水樣中微生物DNA。利用實施實例1所述方法提取來自天津海河環(huán)境樣品中微生物的DNA，用紫外分光光度計測定提取DNA的0擬60/0D230、0擬60/0D280值，結果見表1。表1結果顯示用發(fā)明內容中所述方法提取的天津海河水樣、底泥樣品中微生物DNA的0擬60/0D230都接近1. 35， 說明提取的DNA溶液中腐殖酸類含量較低；0擬60/0D280值接近于1. 65，表明提取的DNA溶液中蛋白質含量較低。因此，本發(fā)明適合提取天津海河環(huán)境樣品中的微生物DNA。表1提取天津海河環(huán)境樣品中微生物DNA純度檢測
權利要求
1.河流環(huán)境樣品中微生物DNA的簡易提取，其特征在于該方法是將河流環(huán)境樣品分為水樣和底泥樣品兩部分，分別對其進行微生物DNA提取，同時該方法也可以作為其中任何一種環(huán)境樣品的單獨提取方法，具體步驟是 第1、河流環(huán)境樣品中微生物細胞裂解第1. 1、河流水樣中微生物細胞裂解第1. 1. 1、河流水樣的富集處理取2L水樣經0. 22um滅菌膜過濾，收集濾膜，將其剪碎置于IOmL無菌離心管中，加入 2mL無菌水，漩渦震蕩5分鐘，SOOOrpm離心10分鐘，得到富集的上清液； 第1. 1. 2、河流水樣中微生物細胞裂解量取2mL第1. 1. 1、步處理后的水樣于IOmL無菌離心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer, DNA Extraction Buffer 1 IOOmmol Tris-HClUOOmmol Na2 EDTAU. 5mol NaCl 和質量濃度為1%的PVP30000 ；同時向IOmL離心管中加入0. 5mL 50mg/mL的溶菌酶，漩渦震蕩直至混勻；37°C水浴池，加入ImL質量濃度為20%的SDS，65°C水浴30分鐘，中間輕輕搖晃離心管2-3次，8000rpm離心15分鐘，取上清； 第1. 2、底泥樣品中微生物細胞裂解第1. 2. 1、稱取Ig底泥樣品于IOmL無菌離心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer, 漩渦震蕩10分鐘，加入ImL質量濃度為20%的SDS，漩渦充分；將離心管置于液氮中30s，再置于65°C水浴20分鐘；重復此操作1-2次；取出樣品，SOOOrpm離心15分鐘；將上清液轉移置另一 IOmL無菌離心管中，待用；第 1. 2. 2、向第 1. 2. 1 步的沉淀物中加入 2mL DNA Extraction Buffer 和 0. 5ml 50mg/ mL的溶菌酶，漩渦震蕩直至混勻；37°C水浴2h，加入ImL質量濃度為20%的SDS，65°C水浴 30分鐘，中間輕輕搖晃離心管2-3次，SOOOrpm離心15分鐘，將上清液與第1. 2. 1步的上清液混合；第2、粗DNA溶液的獲得向第1步得到的河流水樣和底泥樣品的微生物細胞裂解上清液中，分別加入等體積的苯酚氯仿異戊醇=25:24:1的混合液，上下顛倒抽提；12000rpm離心10分鐘，取上清；用氯仿異戊醇=24:1的混合液再抽提一次，12000rpm離心10分鐘，取上清液； 第3、微生物DNA的獲得向第2步抽提后的上清液中分別加入0. 1倍體積的NaAc和0. 6倍體積的異丙醇，-20°C放置Ih ； 12000rpm離心20分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1_2次，自然風干， 用50 μ L TE溶解即環(huán)境樣品微生物DNA，TE溶液包括pH 8. 0的10 mmol/L Tris-HCl和pH 8. 0 的 1 _1/L EDTA。
全文摘要
一種河流環(huán)境樣品中微生物DNA的簡易提取。本發(fā)明方法將河流環(huán)境樣品分為水樣和底泥樣品兩部分，分別對其中的微生物DNA進行提取，同時該方法也可以作為其中任何一種環(huán)境樣品的單獨提取方法。利用液氮反復凍融法、SDS法、溶菌酶法等方法組合，能夠使環(huán)境樣品中微生物細胞充分裂解，DNA完全釋放，經PCR-DGGE技術進行細菌多樣性分析后表明，該提取方法能夠有效地反映河流環(huán)境樣品中微生物的完整性和多樣性。
文檔編號C12N15/10GK102229926SQ201110136379
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月24日 優(yōu)先權日2011年5月24日
發(fā)明者任君, 張宏杰, 毛大慶, 羅義 申請人:南開大學