專利名稱：一種優(yōu)化的高活性人溶菌酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的人溶菌酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)全稱為1，4_ β -N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。它由英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Fleming在1922年首先在人的唾沫、眼淚和鼻涕中發(fā)現(xiàn)，因其能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁而具有溶菌作用而得其名。溶菌酶是人和動(dòng)物體液和組織中的一種重要的防御因子，具有殺菌效果強(qiáng)，殺菌譜廣，穩(wěn)定性強(qiáng)，易被機(jī)體所接受的特點(diǎn)，還能促進(jìn)免疫功能恢復(fù)，并且沒(méi)有任何毒副作用和不良反應(yīng)。因此溶菌酶作為一種生物制劑，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料工業(yè)和臨床醫(yī)學(xué)。 人溶菌酶參與機(jī)體的防御機(jī)制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，在飼料、食品工業(yè)上也具有廣泛的用途。目前，國(guó)外已有小規(guī)模將人溶菌酶用于臨床的報(bào)道，治療效果也較好，且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。人溶菌酶是溶菌酶中的一種，通常人溶菌酶是從人奶或胎盤中少量提取獲得。由于其來(lái)源困難，不能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，采取DNA重組技術(shù)，從原核或真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人溶菌酶是解決其供需矛盾的有效途徑。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用，雖已積累大量經(jīng)驗(yàn)，但也存在諸多不足之處，如菌株生長(zhǎng)速度慢、密度不高、外源蛋白的表達(dá)和翻譯后加工都不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人溶菌酶所存在的菌株生長(zhǎng)速度慢、密度不高且外源蛋白的表達(dá)和翻譯后加工不理想的不足，提供了一種優(yōu)化的高活性人溶菌酶基因及其表達(dá)載體，本發(fā)明利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)作為生產(chǎn)人溶菌酶的表達(dá)系統(tǒng)，它具有生產(chǎn)成本低、操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、表達(dá)效率高、轉(zhuǎn)錄后加工修飾和良好的發(fā)酵與分泌性能等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明優(yōu)化后的人溶菌酶基因經(jīng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的人溶菌酶具有高活性、高表達(dá)量的優(yōu)點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的高活性人溶菌酶基因HZ，它具有序列表SEQ ID N0:1的堿基序列，克隆所述基因的特異性引物為
引物 Fl :5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ 引物 Rl :5’ -ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’ 引物 AOXl :5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ 3’ - GCAAATGGCATTCTGACATCC -5，
本發(fā)明還提供了一種高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO: 1編碼的SEQ ID NO:2 的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了含有所述人溶菌酶基因HZ的重組載體，所述重組載體為 PUC18-T-HZ 禾口 pPICZ α A -HZ。
本發(fā)明還提供了所述人溶菌酶在作為飼料添加劑、食品添加劑和制藥中的應(yīng)用， 所述人溶菌酶可制備用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤的藥物，所述人溶菌酶與甘氨酸、植酸、聚合磷酸鹽物質(zhì)配合使用。本發(fā)明選擇活性較強(qiáng)的人溶菌酶基因，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并人工合成優(yōu)化后的人溶菌酶基因，將其與PUC18-T載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中獲得重組質(zhì)粒PUC18-T-HZ，以重組質(zhì)粒pUClS-T-HZ為模板，用F1、R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段HZ。將合成的優(yōu)化后的人溶菌酶基因與真核載體pPICZ α A連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PPICZ α A -HZ。將重組質(zhì)粒pPICZ α A -HZ線性化后經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中，篩選能在MD和匪上生長(zhǎng)良好的Mut+的菌落，然后經(jīng)抗生素kocin篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，于觀250 r/min搖床培養(yǎng)至 0D_為2.0 — 6.0左右，離心收集菌體，后轉(zhuǎn)接到裝有新鮮BMMY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)進(jìn)行最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的探索，以確定表達(dá)的最佳條件。誘導(dǎo)結(jié)束后，培養(yǎng)液室溫離心收集上清，將誘導(dǎo)上清進(jìn)行SDS-PAGE，得到與預(yù)期一致大小約為15. 26kD的目的條帶， Western blot中將SDS-PAGE中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兔抗人溶菌酶的單抗作為一抗，用羊抗兔IgG的酶標(biāo)抗體作為二抗，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。結(jié)果表明，目的條帶與兔抗人溶菌酶的單抗發(fā)生特異反應(yīng)，確證重組畢赤酵母分泌表達(dá)了人溶菌酶HZ。 用溶壁微球菌平板溶圈法鑒定表達(dá)產(chǎn)物的活性，檢測(cè)得知具有明顯抑菌活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
本發(fā)明采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以獲得高表達(dá)量、高活性的人溶菌酶，不受原材料來(lái)源的限制，克服了以其他方式獲取溶菌酶的成本高、表達(dá)量低和活性低的缺點(diǎn)。通過(guò)高活性、低成本溶菌酶的生產(chǎn)與推廣應(yīng)用，不僅對(duì)我國(guó)飼料畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，同時(shí)也可產(chǎn)生巨大的生態(tài)效益。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清林疋。


圖1是Genbank中現(xiàn)有人溶菌酶基因序列與本發(fā)明優(yōu)化后人溶菌酶基因序列對(duì)比圖譜。圖2是本發(fā)明中以重組質(zhì)粒PUC18-T-HZ為模板，用F1、R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，圖中1表示DL2000 DNA marker ； 2表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3是本發(fā)明中重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-HZ的構(gòu)建圖譜。圖4是本發(fā)明中重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-HZ的PCR鑒定電泳圖譜，1表示DL2000 DNA marker ；2 表示質(zhì)粒 pPICZ α A-HZ 的 PCR 產(chǎn)物。圖5是本發(fā)明中重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-HZ的酶切鑒定電泳圖譜，圖中1表示 DL2000 DNA marker ；2和3表示表達(dá)載體pPICZ α A-HZ經(jīng)EcoR I +Not I酶切后產(chǎn)物。圖6是本發(fā)明中重組菌株的通用引物AOXl的PCR驗(yàn)證圖譜，1，2，3，4，5表示 GS115/ pPICZ α A-HZ 的 PCR 產(chǎn)物；6 表示 DL2000 DNA marker 圖7是本發(fā)明中人溶菌酶蛋白SDS-PAGE的凝膠圖譜，圖中1表示蛋白MW Marker ； 2表示重組菌株GS115/ pPICZaA-HZ表達(dá)上清；3表示重組菌株GS115/ pPICZ a A誘導(dǎo)上清。圖8是本發(fā)明中牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9是本發(fā)明中人溶菌酶蛋白的Western blot分析圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1
一、溶菌酶基因的選擇、優(yōu)化和合成 1、溶菌酶基因的選擇
來(lái)源不同的溶菌酶活性存在差異，人溶菌酶活性比雞蛋清溶菌酶高3倍；而從牛、馬、 羊等動(dòng)物的乳汁中分離出的溶菌酶，其溶菌活性也遠(yuǎn)低于人溶菌酶；植物溶菌酶對(duì)溶壁小球菌的溶菌活性不超過(guò)雞蛋清溶菌酶的1 / 3。因此本發(fā)明選擇活性較強(qiáng)的人溶菌酶基因進(jìn)行表達(dá)。2、溶菌酶基因序列的優(yōu)化
外源基因的內(nèi)在特性如密碼子偏好性是影響外源蛋白有效表達(dá)的重要因素。本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，將溶菌酶基因的酵母低頻密碼子優(yōu)化成高頻密碼子，以提高目的蛋白的翻譯速度和表達(dá)量。人溶菌酶基因的核苷酸序列與Genbank中人溶菌酶基因序列對(duì)比如附圖1所示。在附圖1中，圖譜上面一條序列是Genbank中人溶菌酶基因序列(NCBI序列號(hào) NM_000239.幻，下面一條是優(yōu)化后的人溶菌酶基因序列，兩者對(duì)比后的黑色部分為相同堿基，白色部分為相異堿基。附圖1表明，與Genbank中人溶菌酶基因序列相比，優(yōu)化后的人溶菌酶基因有77
個(gè)堿基發(fā)生了置換，但氨基酸序列并沒(méi)有改變。在人溶菌酶的C-端上加入5個(gè)氨基酸的肽鏈，使溶菌酶具有脂溶性，便于插入革蘭氏陰性菌的脂多層中，可以在脂多層表面形成一個(gè)洞，切斷下層的β-1，4糖苷鍵而發(fā)揮溶菌作用。因此在人溶菌酶基因序列3’端加上編碼5個(gè)氨基酸的基因序列。通過(guò)專業(yè)軟件分析，在基因序列的5’端和3’端分別加上EcoR I.Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)如表1下劃線所示的核苷酸。3、優(yōu)化的人溶菌酶基因序列的合成
所述優(yōu)化后的人溶菌酶基因序列由上海生工公司合成。合成的人溶菌酶基因HZ全序列如SEQ ID Νο:1所示。AAGGTTTTTGAAAGATGTGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGATGGTTACAGAGGTATT TCTTTGGCTAATTGGATGTGTTTGGCAAAGTGGGAATCTGGTTACAACACTAGAGCTACTAACTACAATGCAGGTGA TAGATCTACTGATTACGGTATCTTCCAGATCAACTCTAGATACTGGTGTAACGATGGTAAGACTCCAGGTGCTGTTA ACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCTGCTTTGTTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTTGCATGTGCTAAGAGAGTTGTT AGAGATCCACAGGGTATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAACAGATGCCAAAACAGAGATGTTAGACAGTATGTTCA AGGTTGTGGTGTTTTCTTCGTTGCTCCATAAGCGGCCGC
由SEQ ID Νο:1的核苷酸序列編碼的人溶菌酶蛋白序列如SEQ ID Νο:2。
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGK TPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVFFVAP
其分子量為15洸1. 41Daltons。二、重組質(zhì)粒pUC18-T_HZ的構(gòu)建
所采用的載體是商業(yè)購(gòu)買的PUC18-T載體，構(gòu)建載體的宿主細(xì)胞是DH5 α。1、新合成的人溶菌酶基因與pUClS-T載體連接
將所述合成好的人溶菌酶基因與PUC18-T載體連接，連接體系如下
Solution I10μ1pUC18-T μ 合成產(chǎn)物HZ9μ1總體積20μ1
離心混勻后，16°C低溫水浴連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化。2、DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
(1)取DH5a菌種，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜；
(2)取單個(gè)菌落，接種于含2mL LB液體培養(yǎng)基的10 mL試管中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按轉(zhuǎn)種于含50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至0D600值達(dá)到0. 3-0. 5左右時(shí)取出；
(3)無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的用冰預(yù)冷的50mL聚丙烯離心管中，在冰上放置 10 min ；
(4)于4°〇以4000 rpm離心10 min，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min使殘留液體流盡；
(5)用10mL冰預(yù)冷的0. 1 mol/LCaC12溶液重懸細(xì)胞沉淀，冰上放置5 min ；
(6)于4°C以4000 rpm離心10 min,回收菌體；
(7)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min使殘留液體流盡；
(8)用1mL冰浴預(yù)冷的0. 1 mol/LCaC12重懸細(xì)胞沉淀；
(9)用冷卻的無(wú)菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于預(yù)冷的無(wú)菌微量離心管中，每管200μ 。3、合成的人溶菌酶基因與pUClS-T載體連接后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化將上述制得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化步驟如下
(1)將獲得的連接產(chǎn)物10PL加入200 PL感受態(tài)細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，以及不加入任何質(zhì)粒DNA的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照；
(2)輕輕混勻后，立即冰浴30min ；
(3)將裝有混合物的離心管移入預(yù)加溫至42°C的循環(huán)水浴中，恰好靜置90 s；
(4)將離心管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，放置2min ；
(5)在超凈臺(tái)里，將離心管中的混合物加到800PL預(yù)熱至37 ！的LB液體培養(yǎng)基中；
(6)輕輕顛倒混勻，將混合物于37！振蕩培養(yǎng)45 min；
(7)將培養(yǎng)的菌液以3000rpm離心5 min，在超凈臺(tái)里棄掉部分上清，留約100 μ 上清，用加樣器重懸菌體沉淀；
(8)取菌液涂布于含Amp的LB平板上，37！倒置培養(yǎng)過(guò)夜。4、重組質(zhì)粒的序列測(cè)定
為了進(jìn)一步確定上述步驟所得到的重組質(zhì)粒，將陽(yáng)性菌液由測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，并用DNAMar軟件分析插入片段的正確性。將最終鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為PUC18-T-HZ。三、重組質(zhì)粒pPICZ α A-HZ的構(gòu)建
所采用的酵母表達(dá)載體為PPICZ α A，構(gòu)建載體的宿主細(xì)胞是大腸桿菌DH5 α。1、設(shè)計(jì)引物
根據(jù)新合成的人溶菌酶基因序列設(shè)計(jì)上下游引物Fl、R1，及合成通用引物Α0Χ1，所述引物均由上海生工公司合成，所述引物的序列如下，下劃線部分堿基代表相應(yīng)酶切位點(diǎn) 表1 :PCR擴(kuò)增所用引物
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化的高活性人溶菌酶基因HZ，其具有序列表SEQ ID NO: 1的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人溶菌酶基因HZ，其特征在于克隆所述基因的特異性引物為引物 Fl :5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ ； 引物 Rl :5’ -ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’ ； 引物 AOXl :5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ ； 3’ - GCAAATGGCATTCTGACATCC -5，。
3.一種高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO: 1編碼的SEQ ID N0:2的氨基酸序列。
4.重組載體，其含有權(quán)利要求1所述的人溶菌酶基因HZ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pUClS-T-HZ和 pPICZa A-HZ0
6.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的人溶菌酶在作為飼料添加劑、食品添加劑和制藥中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人溶菌酶在制藥中的應(yīng)用，其特征在于所述人溶菌酶在制備用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種人溶菌酶在制藥中的應(yīng)用，其特征在于所述人溶菌酶與甘氨酸、植酸、聚合磷酸鹽物質(zhì)配合使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的高活性人溶菌酶基因及其表達(dá)載體，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化并人工合成人溶菌酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ，將重組質(zhì)粒pPICZαΑ-HZ線性化后轉(zhuǎn)到畢赤酵母中，篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組畢赤酵母分泌表達(dá)了高活性的人溶菌酶，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯抑菌活性。本發(fā)明采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以獲得高表達(dá)量、高活性的人溶菌酶，克服了以其他方式獲取溶菌酶的成本高、表達(dá)量低和活性低的缺點(diǎn)。通過(guò)高活性、低成本溶菌酶的生產(chǎn)與推廣應(yīng)用，不僅對(duì)我國(guó)飼料畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，同時(shí)也可產(chǎn)生巨大的生態(tài)效益。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102229939SQ20111013640
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者孫同毅, 張大偉, 王希輝 申請(qǐng)人:青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司