專利名稱：一種中國對蝦耐受高pH性狀的分子標(biāo)記及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，涉及蝦類耐受高PH相關(guān)分子標(biāo)記和遺傳鑒定技術(shù)，尤其涉及一種中國對蝦耐受高PH性狀的分子標(biāo)記及其鑒定方法。
背景技術(shù)：
中國對蝦cAi/^asis)自然資源主要分布在我國的黃、渤海海域及朝鮮半島沿海。在上世紀(jì)90年代初產(chǎn)量達(dá)到20萬噸以上，連續(xù)多年居世界首位，其中中國對蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)量占全國對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%以上，但1993年遭受白斑病的重創(chuàng)后， 對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)嚴(yán)重滑坡，年產(chǎn)量長期在5萬噸左右徘徊，所造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)上百億元人民幣。養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了生長速度減緩、對病害和環(huán)境脅迫抵御能力下降等問題，經(jīng)分析認(rèn)為優(yōu)良種質(zhì)資源匱乏、病害流行及養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境惡化是限制中國對蝦健康養(yǎng)殖的重要因素，而品種是養(yǎng)殖的基礎(chǔ)，因此盡早培育出耐受逆環(huán)境能力強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣的優(yōu)良新品種 (系)，對于擴(kuò)大中國對蝦養(yǎng)殖面積，充分利用鹽堿灘涂沼澤，提高農(nóng)民收入，推動經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。pH是中國對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中重要的環(huán)境因子，它直接影響對蝦的存活、生長和滲透調(diào)節(jié)等生理功能。在養(yǎng)殖環(huán)境中PH受諸多因素的影響，大量換水、陰天暴雨和浮游植物優(yōu)勢種群的突然改變或消失以及水質(zhì)嚴(yán)重污染等都會導(dǎo)致PH的急劇變化。在水生動物中關(guān)于PH的研究集中在對生物機(jī)體攝食(Charles L. 1980)、生長、存活、滲透壓調(diào)節(jié)(Geoff L A , 1992; Dawn Μ. Scott, 200δ)、對抗病力影響(J. Castro Rosas, 200δ)以及生理生化反應(yīng)(David L·，1990 ；Richard. F, 1996 ；Hugues Lemonnier, 2004 ；Stephen G. Reid, 2000 ；Sayyed Mohammad Hadi Alavi, 2005 ；Ru Liu, 2010)。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)技術(shù)是由Li和Qurios于2001年研究蕓薹屬 (Brassica species)植物時(shí)開發(fā)出的新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是借助特定引物對基因組開放式閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP技術(shù)可較緊密連鎖基因組表達(dá)序列，有利于目標(biāo)性狀候選基因的篩選，且具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、條帶易回收、引物成本低以及部分共顯性等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析(Budak H，2004)、雜交優(yōu)勢估計(jì)(Riaz A，2001)、比較基因組學(xué)研究(Li G，2003)、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建(Lin Z X，2009)及相關(guān)基因定位(Alwala，2009)等研究中，但是在水產(chǎn)動物研究領(lǐng)域研究應(yīng)用還較少，僅在羅氏沼蝦 (Macrobrachium Rosenbergii)(周勁松，2006)、日本沼蟲下(Macrobrachium nipponensis) (姚建華，2008)和草魚{ftenopharyngodon idellus)(張志偉，2007 ；丁煒東，2008)的研究中見過報(bào)道。傳統(tǒng)的育種方法主要利用表型差異選擇優(yōu)良性狀，但其受環(huán)境因素影響和選擇強(qiáng)度的限制，對遺傳力低的性狀選擇難度大、選擇周期長耗時(shí)多，分子育種方法應(yīng)運(yùn)而生，而且迅猛發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)為其提供了技術(shù)支持。目前中國對蝦育種性狀的選擇包括生長速度(劉萍，2007;何玉英，2007)和抗病力(孟憲紅，2005; Yue Zhiqin, 2005)，而將選育與環(huán)境逆因素相結(jié)合，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，目前國內(nèi)外還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中利用傳統(tǒng)育種方法篩選具有優(yōu)良性狀的中國對蝦所存在的難度大且周期長缺陷，提供了一種中國對蝦耐受高PH性狀的分子標(biāo)記及其鑒定方法，可以快速篩選到中國對蝦目標(biāo)性狀的基因，利用本發(fā)明所述方法可以對中國對蝦進(jìn)行快速篩選，篩選周期較短，且操作簡單方便，可以適應(yīng)行業(yè)發(fā)展的需要。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種中國對蝦耐受高PH性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5 所示。擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的SRAP特異引物為 SEQ ID NO. 1 :5’ -TGAGTCCAAACCGGAAT-3，； SEQ ID NO. 2 :5’ -GACTGCGTACGAATTTGA-3’。擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的SCAR特異引物為 SEQ ID NO. 3 :5，-GCTCCTTCGGCTTCA-3’ ； SEQ ID NO. 4 :5’ -ATCAGGTCGTAATGC-3，。本發(fā)明還提供了一種中國對蝦耐受高PH性狀的鑒定方法，它包括以下步驟
(1)采集中國對蝦尾棘肌肉，提取基因組DNA;
(2)選用SCAR特異引物，對步驟(1)提取的待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述 SCAR特異引物為
SEQ ID N0. 3 :5，-GCTCCTTCGGCTTCA-3’ ； SEQ ID N0. 4 :5，-ATCAGGTCGTAATGC-3，；
(3)將步驟( 所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析其電泳圖譜，如擴(kuò)增出339bp大小的特異片段，則說明待測樣品遺傳上具有耐受高PH性狀；如沒有擴(kuò)增出特異長度大小的特異片段，則說明待測樣品遺傳上對高PH敏感。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(1)中采用酚氯仿方法提取基因組DNA。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟O)中的PCR反應(yīng)體系為總體積20 μ L，包含 1. OU Taq 酶，2. Ommol/L 的 Mg2+，40. Ong 的模板 DNA, 0. 125mmol/L 的 dNTP 以及 0. 4 μ mol/ L的引物。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(2)中的PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性， 5min ；然后 94°C變性 0. 5min，47. 6°C，0. 5min，72°C，lmin，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)。72°C延伸 5min, 4°C保存。本發(fā)明所述中國對蝦耐受高pH性狀的分子標(biāo)記的篩選方法采用2001年Li和 Qurios發(fā)明的SRAP分析方法，首先應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)篩選中國對蝦耐受高pH性狀的相關(guān)特異SRAP標(biāo)記，克隆測序，進(jìn)行序列分析后，設(shè)計(jì)合適的特異引物，將SRAP特異標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定方便的SCAR標(biāo)記，結(jié)合這些特異SCAR標(biāo)記，建立中國對蝦耐受高pH性狀鑒定方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
1、本發(fā)明可在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)對中國對蝦是否耐受高PH性狀進(jìn)行直接檢測，不受環(huán)境條件和時(shí)間的限制。
4
2、本發(fā)明可對中國對蝦在各個(gè)生長發(fā)育時(shí)期檢測其是否耐受高pH性狀，有利于中國對蝦育種過程中具備優(yōu)良性狀中國對蝦家系或群體的選擇。3、相比于傳統(tǒng)的暫養(yǎng)、脅迫試驗(yàn)等操作消耗一周時(shí)間和精力，利用本發(fā)明進(jìn)行中國對蝦耐受高PH性狀檢測，可在1天內(nèi)獲得檢測結(jié)果，省時(shí)省力。4、利用本發(fā)明進(jìn)行中國對蝦耐受高pH性狀檢測，可在遺傳上確定個(gè)體是否存在耐受高PH基因，與表型上耐受高pH區(qū)分開，有利于選育性狀的選擇。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清
林疋。


圖1是本發(fā)明中中國對蝦高pH脅迫試驗(yàn)的正態(tài)分布圖。圖2為本發(fā)明中脅迫產(chǎn)生的耐受組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)的特異SCAR標(biāo)記電泳圖， 339bp的片段表示特異SCAR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3為本發(fā)明中脅迫產(chǎn)生的敏感組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)的特異SCAR標(biāo)記電泳圖， M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1
本發(fā)明的技術(shù)方案包括兩大步驟(一)篩選和克隆中國對蝦耐受高PH性狀相關(guān)特異 SRAP標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化為特異SCAR標(biāo)記；(二)建立中國對蝦耐受高pH性狀的鑒定方法。(一)篩選和克隆中國對蝦耐受高pH性狀相關(guān)特異SRAP標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化為特異SCAR 標(biāo)記包括以下步驟
1、中國對蝦高pH脅迫試驗(yàn)及其肌肉DNA的提取 1)中國對蝦高pH脅迫試驗(yàn)
從試驗(yàn)基地中每家系隨機(jī)取樣50尾健康中國對蝦，暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池對應(yīng)圍格內(nèi)，嚴(yán)格統(tǒng)一的日常管理。暫養(yǎng)三天后，利用NaOH調(diào)節(jié)水體pH值為9. 2 (半致死pH值)進(jìn)行脅迫試驗(yàn)四次，每M小時(shí)一次脅迫試驗(yàn)。脅迫后每隔池將死亡個(gè)體撈出，記錄死亡時(shí)間。根據(jù)攻毒后個(gè)體存活時(shí)間建立正態(tài)分布圖，如圖1所示，淘汰大多數(shù)中間類型，取兩端各5個(gè)家系混合作為敏感組和耐受組。2 )中國對蝦肌肉DNA的提取
按照常規(guī)酚氯仿方法從敏感組和耐受組中國對蝦尾棘肌肉樣品中提取基因組DNA，步驟如下
a.取肌肉組織lOOmg，剪碎后放入1.5ml離心管中，加入pH8. 0的TE溶液(10mmol/L Tris-Cl, 10mmol/L EDTA) 475 μ 1，切碎剪細(xì)；
b.加入10% (pH7. 2) SDS 溶液 25 μ 1，混勻；
c.加入10mg/ml RNase 2 μ 1，37°C消化 0. 5_lh ；d.加入500μ 1平衡后的重蒸酚抽提兩次，每次lOmin，12000rpm離心lOmin，取上清；
e.加酚氯仿(1:1)各300μ 1，抽提一次，10min，12000rpm離心lOmin，取上清；
f.加600μ 1氯仿抽提一次，5min, 5000rpm離心lOmin，取上清；
g.加入1/25(約20 μ 1)體積的5Μ的NaCl溶液，混勻后再加入兩倍體積(約 700 μ 1) _20°C保存的無水乙醇沉淀DNA ；
h.沉淀的DNA用70%的乙醇洗滌過夜，次日離心去乙醇后，靜放使殘留乙醇揮發(fā)完全后，用50 μ 1滅菌水充分溶解，并于65°C水浴中滅活5-lOmin，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^瓊脂糖電泳和核酸檢測儀檢測DNA質(zhì)量，最終將DNA稀釋為160ng/ μ L。2、分群分析法(BSA)基因池的建立和SRAP引物的篩選 1)分群分析法(BSA)基因池的建立
提取脅迫試驗(yàn)獲得的敏感組和耐受組樣本肌肉DNA，各20份，每份樣本取10μ )ΝΑ溶液混合構(gòu)成相應(yīng)的敏感池和耐受池。2) SRAP引物的篩選
SRAP引物都是“填充序列+核心序列+選擇性堿基”組成，正反向引物分別依靠“核心序列(CCGG和ΑΑΤΤ)”結(jié)合擴(kuò)增基因組的開放閱讀框(ORFs)和啟動子、內(nèi)含子，獲得基于內(nèi)含子和外顯子的SRAP多態(tài)性標(biāo)記，根據(jù)已報(bào)道的科研文獻(xiàn)篩選獲得10條正向引物和11條反向引物，正向引物與反向引物兩兩配對組合產(chǎn)生110對引物組合，引物見表1。表1 SRAP引物編號及序列
權(quán)利要求
1.一種中國對蝦耐受高PH性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦耐受高PH性狀的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的SRAP特異引物為SEQ ID NO. 1 :5’ -TGAGTCCAAACCGGAAT-3，；SEQ ID NO. 2 :5’ -GACTGCGTACGAATTTGA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦耐受高PH性狀的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的SCAR特異引物為SEQ ID NO. 3 :5，-GCTCCTTCGGCTTCA-3’ ；SEQ ID NO. 4 :5，-ATCAGGTCGTAATGC-3，。
4.一種中國對蝦耐受高PH性狀的鑒定方法，其特征在于它包括以下步驟(1)采集中國對蝦尾棘肌肉，提取基因組DNA;(2)選用SCAR特異引物，對步驟(1)提取的待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述 SCAR特異引物為SEQ ID NO. 3 :5，-GCTCCTTCGGCTTCA-3’ ；SEQ ID NO. 4 :5，-ATCAGGTCGTAATGC-3，；(3)將步驟( 所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析其電泳圖譜，如擴(kuò)增出339bp大小的特異片段，則說明待測樣品遺傳上具有耐受高pH性狀；如沒有擴(kuò)增出特異長度大小的特異片段，則說明待測樣品遺傳上對高PH敏感。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國對蝦耐受高pH性狀的鑒定方法，其特征在于所述步驟(1)中采用酚氯仿方法提取基因組DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國對蝦耐受高pH性狀的鑒定方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系為總體積20 μ L，包含1.0U T^酶，2. Ommol/L的Mg2+，40. Ong 的模板 DNA，0. 125mmol/L 的 dNTP 以及 0. 4μ mol/L 的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種中國對蝦耐受高pH性狀的鑒定方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性，5min ；然后94°C變性0. 5min，47. 6°C，0. 5min， 72°C，lmin，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5min，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中國對蝦耐受高pH性狀的分子標(biāo)記及鑒定方法，本發(fā)明對中國對蝦耐受高pH特異序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)標(biāo)記的篩選、克隆、測序、特異引物設(shè)計(jì)及特異標(biāo)記的驗(yàn)證；根據(jù)獲得的特異序列及設(shè)計(jì)的特異引物建立了中國對蝦耐受高pH性狀PCR鑒定方法。建立中國對蝦耐受高pH特異SRAP標(biāo)記篩選方法，從110對SRAP引物組合中篩選到1對引物組合產(chǎn)生1條耐受高pH特異SRAP片段，并首次構(gòu)建了中國對蝦耐受高pH性狀PCR鑒定方法。本發(fā)明具有先進(jìn)、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，在中國對蝦抗逆選育，增強(qiáng)中國對蝦環(huán)境適應(yīng)力，推廣養(yǎng)殖面積等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK102154287SQ20111013653
公開日2011年8月17日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者何玉英, 李健, 李吉濤, 王清印, 陳華增, 陳萍 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所