專(zhuān)利名稱(chēng)：桃枝條潰瘍病菌的特異性pcr鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬有害生物分子診斷領(lǐng)域，具體涉及一種桃枝條潰瘍病菌(Phomopsis amygdali)的特異性PCR鑒別方法。
背景技術(shù)：
桃(Primus persica)屬溫帶落葉果樹(shù)，是原產(chǎn)于我國(guó)的一種果樹(shù)。桃樹(shù)品種很多， 世界上大約有3000余個(gè)品種，其中我國(guó)有1000種以上。根據(jù)它們對(duì)氣候條件的適應(yīng)性、生長(zhǎng)特性和果實(shí)特點(diǎn)，可分為若干品種群。以果實(shí)性狀和成熟期分類(lèi)，具體如下①按果形分為普通桃、扁形桃(即蟠桃)。② 按果皮茸毛有無(wú)分為毛桃、油桃，其中油桃是普通桃的單項(xiàng)變異。③按核與果肉的粘離度分為離核、粘核和半粘核。其中粘核是進(jìn)化類(lèi)型，離核品種果肉組織較松，有成熟不勻的現(xiàn)象。 粘核品種果肉較致密，纖維少，果肉成熟度較為均勻，宜加工制罐。④按果肉質(zhì)地分為肉溶質(zhì)、肉不溶質(zhì)及硬肉桃3種類(lèi)型。其中溶質(zhì)型果實(shí)成熟時(shí)柔軟多汁，適宜鮮食。溶質(zhì)型又可分為軟溶質(zhì)型和硬溶質(zhì)型。不溶質(zhì)型果實(shí)成熟時(shí)質(zhì)地堅(jiān)韌，富彈性，適于加工制罐(但還要求果肉不染紅色)。硬肉桃果實(shí)初熟時(shí)果肉硬而脆，完熟時(shí)呈粘質(zhì)，并變面，故以完熟前食用品質(zhì)為佳。⑤按果肉顏色分為白肉桃、黃肉桃和紅肉桃。⑥按果實(shí)生長(zhǎng)日期分為特早熟品種、早熟品種、中熟品種和晚熟品種、特晚熟品種。以生態(tài)分類(lèi)，具體如下①北方品種群。主要分布于華北、西北、華中一帶。以山東、 河北、北京、山西、河南、陜西、甘肅及新疆栽培較多。本品種群比較抗寒和耐旱，不耐溫暖多濕氣候。②南方品種群。主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南的江蘇、浙江、四川、貴州、湖北及湖南等省。該地區(qū)屬于北亞熱帶和中亞熱帶的濕潤(rùn)性氣候。本品種群又可分為水蜜桃、硬肉桃和蟠桃3種類(lèi)型。水蜜桃果實(shí)多圓形，頂部平圓，果皮易剝離，果肉柔軟多汁，不耐貯運(yùn)。硬肉桃果實(shí)頂端有短尖，縫合線(xiàn)淺，肉質(zhì)硬脆質(zhì)密，汁液較少，較耐貯運(yùn)。蟠桃果肉柔軟多汁，多為水蜜桃型。③南歐品種群。系由我國(guó)甘肅、新疆向西傳入歐洲后經(jīng)長(zhǎng)期馴化形成的品種。 主要分布在地中海沿岸諸國(guó)。該地區(qū)屬地中海式氣候，在我國(guó)北方栽培比較適宜。我國(guó)除黑龍江省外，其他各省、市、自治區(qū)都有桃樹(shù)栽培，主要經(jīng)濟(jì)栽培地區(qū)在華北、華東各省，較為集中的地區(qū)有北京海淀區(qū)、平谷縣，天津薊縣，山東肥城、益都、青島，河南商水、開(kāi)封，河北撫寧、遵化、深縣、臨漳，陜西寶雞、西安，四川成都，遼寧大連，浙江奉化， 上海南匯、奉賢，江蘇無(wú)錫、徐州。據(jù)2007年資料統(tǒng)計(jì)全國(guó)栽培面積已超過(guò)900萬(wàn)畝，生產(chǎn)桃40萬(wàn)噸，居世界第一位。寧波奉化、無(wú)錫陽(yáng)山水蜜桃以及上海南匯水蜜桃、奉賢黃桃名聞遐邇。種桃已成為我國(guó)各地農(nóng)民重要的主要經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源。桃樹(shù)上傳統(tǒng)的病害種類(lèi)很多，如樹(shù)脂病、縮葉病、褐腐病等等，已為我國(guó)廣大果農(nóng)所熟悉。2009年春季在浙江嘉興錦繡黃桃基地、上海南匯水蜜桃基地的部分果園內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的枝條潰瘍病，株發(fā)病率達(dá)30-40%，導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。該病害在秋季通過(guò)葉痕，在春季通過(guò)芽、芽鱗痕、花、果痕等侵染桃樹(shù)樹(shù)枝，潰瘍主要以枝條上節(jié)點(diǎn)為中心，初期紅褐色， 逐漸下陷成茶褐色，病害發(fā)展到初夏時(shí)可以殺死幼嫩枝條導(dǎo)致枝枯，并由此導(dǎo)致發(fā)病枝條果實(shí)不能長(zhǎng)大而失去商品性。桃樹(shù)枝條潰瘍是一種由Wiomopsis amygdali病菌侵染所致的真菌病害，目前在我國(guó)還未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)際上該病于1934年在美國(guó)新澤西州首次發(fā)現(xiàn)，隨后在上世紀(jì)40-50年代相繼在馬里蘭、特拉華、弗吉尼亞、紐約、馬薩諸塞等州發(fā)現(xiàn)，上世紀(jì)90年代后在阿拉巴馬、 佐治亞和南卡羅來(lái)那等美國(guó)東南部地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明經(jīng)對(duì)我國(guó)上海、浙江嘉興等地的水蜜桃、黃桃枝條潰瘍的病原進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其病原一致，均為Phomopsis amygdali病菌，但該病菌危害桃枝條的情況在我國(guó)至今還未見(jiàn)報(bào)道。由于桃果實(shí)腐爛的發(fā)生也很?chē)?yán)重，本發(fā)明同時(shí)還對(duì)其也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其病原并不是Wiomopsis amygdali，而是Wiomopsis屬內(nèi)的其它菌種，且存在不同種病原真菌的混合侵染現(xiàn)象。危害桃枝條潰瘍、桃果實(shí)腐爛的病菌雖然是同屬不同種，其菌落、孢子形態(tài)相似，但在分子水平卻有明顯差異。因此，建立桃枝條潰瘍病菌的快速檢測(cè)方法，對(duì)于該病的快速診斷及防治具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種桃枝條潰瘍病菌(Phomopsis amygdali)的特異性PCR鑒別方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白。本發(fā)明從引起上海等地區(qū)水蜜桃、黃桃潰瘍、腐爛的果實(shí)上分離得到多種 Phomopsis屬的病原真菌(Phomopsis spp.)，發(fā)現(xiàn)它們的病原菌與桃枝條潰瘍病菌 Phomopsis amygdali的形態(tài)相似。將這些病原真菌委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序， 分別獲得了水蜜桃、黃桃枝條潰瘍病菌株，水蜜桃、黃桃果腐病菌株等多種Phomopsis屬病原真菌，經(jīng)DNA相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)水蜜桃和黃桃枝條潰瘍病病原菌其分子特征序列相似性達(dá)99%的，而水蜜桃、黃桃果腐病病菌與枝條潰瘍病菌相似性?xún)H在89-95. 9%。這說(shuō)明桃枝條潰瘍病菌與桃果腐病菌雖然在形態(tài)上相似而難以區(qū)分，但是通過(guò)分子特征序列是可以辨別區(qū)分的。因此，本發(fā)明提供一種桃枝條潰瘍病菌的特異性PCR鑒別方法，針對(duì)桃枝條潰瘍病菌與桃果腐病菌的分子特征序列差異，設(shè)計(jì)多個(gè)引物對(duì)，分別對(duì)桃枝條潰瘍病菌、桃果實(shí)腐爛病菌進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)。其中擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μ 1，包括模板DNA 1 μ L，引物對(duì)(正、反向引物)各2 μ L， dNTP 混合物(2. OmM/每種)2 μ L，PCR 反應(yīng)緩沖液(IOX) 2 μ L，MgCl2 溶液(25mmol/L) 2 μ L， Taq酶(lu/ μ L) 0· 4 μ 1，補(bǔ)充去離子水至20 μ L·擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 3min 1 個(gè)循環(huán)；95°C 45sec，55-60 °C 30sec，72°C 30sec，;35 循環(huán)；72°C IOmin 1 個(gè)循環(huán)。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Agrose凝膠電泳后分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有引物對(duì)4的PCR 擴(kuò)增方法可以特異性擴(kuò)增出桃枝條潰瘍病菌(Phomopsis amygdali)在326bp的目標(biāo)片段， 但不能在所有相似的桃果腐爛病菌以及美國(guó)的Wiomopsis sp.菌中擴(kuò)增出目標(biāo)片段；采用引物對(duì)6的PCR擴(kuò)增方法雖然可以擴(kuò)增出桃枝條潰瘍病菌(Phomopsis amygdali)在309bp 的目標(biāo)片段，但是在1個(gè)果腐Phomopsis病菌菌株和1個(gè)來(lái)自美國(guó)的Phomopsis菌株中也擴(kuò)增出相同的309bp片段，同時(shí)在另1個(gè)果腐Phomopsis菌株中擴(kuò)增出750_1000bp的片段。 由此說(shuō)明引物對(duì)4可以用于桃枝條潰瘍病菌的特異性PCR擴(kuò)增檢測(cè)以及水蜜桃、黃桃枝條潰瘍病菌和其他Wiomopsis屬內(nèi)、屬外的病原真菌的鑒別，而引物對(duì)6卻不能。所述引物對(duì)4和引物對(duì)6的序列分別如下引物對(duì)4:正向引物Pa_F2 5，GCCGGCCCCCTTCTG 3，反向引物Pa-R2 5，GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3，引物對(duì)6:正向引物Pa-F3 5，GGCCCCTCGTTCCTGAC 3，
反向引物 Pa-R2 5，GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3，本發(fā)明的桃枝條潰瘍病菌的特異性PCR鑒別方法可作為一種鑒定桃枝條潰瘍病菌Phomopsis amygdali,以及Phomopsis屬內(nèi)、屬外其它菌種的有效手段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)鑒別快速完成鑒定時(shí)間僅需3-4小時(shí)；傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法需要時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于本發(fā)明涉及的擬莖點(diǎn)屬病原真菌其形態(tài)鑒定僅僅所必須的分生孢子器誘導(dǎo)就需要14天以上的時(shí)間。2)方法靈敏本發(fā)明可以檢測(cè)出IOOfg以上的病菌DNA數(shù)量。3)特異性好能夠鑒別桃樹(shù)枝條以及果實(shí)上的擬莖點(diǎn)屬病原真菌，傳統(tǒng)的通過(guò)分生孢子器以及分生孢子形態(tài)難于區(qū)別。4)操作簡(jiǎn)便本發(fā)明僅僅需要1臺(tái)PCR擴(kuò)增儀以及PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的常規(guī)試劑。因此本發(fā)明的方法具有非常高的實(shí)用價(jià)值。


圖1為桃枝條潰瘍病原菌株的觀察結(jié)果，其中A為該菌株的早期菌落，B為該菌株的中期菌落，C為該菌株的后期結(jié)果。圖2為多個(gè)引物對(duì)PCR擴(kuò)增桃枝條潰瘍病菌菌株的凝膠電泳圖，其中M Marker ； 1-2 引物對(duì)1 ；3-4 引物對(duì)2 ；5-6 引物對(duì)3 ；7-8 引物對(duì)4 ；9-10 引物對(duì)5 ； 11-12 引物對(duì)6 ； 13 陰性對(duì)照。圖3為引物對(duì)4、6特異性PCR鑒別桃枝條潰瘍病菌株的凝膠電泳圖，其中M Marker ；1-10 =PCR引物對(duì)4 ； 11-20 =PCR引物對(duì)6 ；21 陰性對(duì)照；A 桃果實(shí)腐爛病菌株；B 美國(guó)桃樹(shù)Wiomopsis sp.病菌株；C 桃枝條潰瘍病菌株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1病原菌株的采集與獲取桃枝條潰瘍病菌株和桃果實(shí)腐爛病菌株均是從上海、浙江等地的水蜜桃、黃桃的潰瘍枝條和腐爛果實(shí)病樣采集而得到。將它們的病組織采用表面次氯酸鈉或酒精消毒后， 置于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)(馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂20克，蒸餾水1000毫升)上，25°C條件下培養(yǎng)2-3天后，將從病組織上長(zhǎng)出的菌絲轉(zhuǎn)至另外兩個(gè)新的PSA培養(yǎng)基上。其中一個(gè)培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行病菌形態(tài)觀察。圖1為桃枝條潰瘍病菌株的觀察結(jié)果， 其中A為該菌株的早期菌落，呈白色；B為該菌株的中期菌落，出現(xiàn)白色顆粒；C為該菌種的后期結(jié)果逐漸發(fā)展成黑色的分生孢子器，其頂部會(huì)形成淡黃色的粘狀物分生孢子，分別為呈橢圓形α型孢子和線(xiàn)形β型孢子。桃果實(shí)腐爛病菌株的菌落、分生孢子形態(tài)與桃枝條潰瘍病的相似。另一個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)3-4天后，挑起分離物的菌絲塊接種于健康的水蜜桃、黃桃的枝條或果實(shí)上，保濕48-78小時(shí)后(100%相對(duì)濕度)恢復(fù)到正常生長(zhǎng)條件，將出現(xiàn)相同癥狀(桃潰瘍病為下陷成茶褐色病斑癥狀，桃果腐病為圓形果實(shí)腐爛斑癥狀)的病枝或病果， 再次通過(guò)表面次氯酸鈉或酒精消毒病組織后置于PSA培養(yǎng)基分離，分離出在菌落形態(tài)(白色)、孢子形態(tài)(橢圓形α型孢子和線(xiàn)形β型孢子)與原先接種的病菌相同的分離物，分別獲得2個(gè)桃枝條潰瘍病菌株和7個(gè)桃果實(shí)腐爛病菌株。實(shí)施例2桃枝條潰瘍和桃果實(shí)腐爛病菌株的分子特征序列的測(cè)定將上述采集獲得的桃條潰瘍病菌株和桃果實(shí)腐爛病菌株分別用查氏培養(yǎng)液(蔗糖30g，硝酸納3g，磷酸氫二鉀lg，七水硫酸鎂0. 5g，氯化鉀0. 5g，七水硫酸亞鐵0. Olg,蒸餾水1000毫升)24°C、100轉(zhuǎn)/分、黑暗條件下培養(yǎng)4-5天后，用雙層紗布過(guò)濾獲得病菌菌絲體，然后用尿素提取法提取病菌菌絲體基因組的DNA。所述尿素提取法具體步驟如下將0. 5g研磨好的菌絲樣品加入IOmL尿素提取液 (7mol/LUrea、50mmol/L Tris-HCl ρΗ 8· 0、62· 5mmol/L NaCl、1 % SDS)，搖勻，12000r/min 離心5min，吸取上清液，上清液12000r/min再次離心5min，將上清液移入另一新管中，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1，體積比)溶液，用力振蕩數(shù)次混勻，120001·/ min離心5min ；取上清到一新管中加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (ρΗ 5. 2)，-20°C放置20min, 12000r/min離心5min ；棄上清液，倒置使管壁液體流盡，70 %無(wú)水乙醇洗沉淀，室溫放置干燥5 lOmin，溶于200 μ L雙蒸水中，加入RNase Α(10 μ g/ μ L) 2 μ L，37°C水浴 30min, _20°C保存?zhèn)溆谩?duì)上述提取獲得的病菌菌絲體基因組DNA進(jìn)行病菌特征序列的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μ 1，包括模板DNA 1 μ L，引物P-Fl和P-Rl (IOpmol/μ L)各2 μ L，dNTP混合物 (2. OmM/ 每種)2yL，PCR 反應(yīng)緩沖液(IOX) 2 μ L，MgCl2 溶(25mmol/L) 2 μ L, Taq 酶(lu/ μ L) 0.4 μ 1，補(bǔ)充去離子水至20 μ 1。其中，所述引物P_F1、P-Rl的序列分別如下P-Fl :5，TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3，；P-Rl :5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’擴(kuò)增條件為94°C3min 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin，55°C 30sec，72°C 40sec，;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin 1個(gè)循環(huán)。將上述擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序，分別獲得水蜜桃枝條潰瘍病菌株的分子特征序列(SEQ ID No 1)、黃桃枝條潰瘍病菌株的分子特征序列 (SEQ ID No 2)、水蜜桃果腐爛病5個(gè)菌株的分子特征序列(SEQ ID No 3、4、5、6、7)、黃桃果腐爛病2個(gè)菌株的分子特征序列(SEQ ID No 8、9)。實(shí)施例3 水蜜桃和黃桃的枝條潰瘍病菌株、桃果腐病菌株的分子特征序列相似性比對(duì)
將上述獲得的水蜜桃和黃桃的枝條潰瘍病菌、水蜜桃枝條潰瘍病菌株與水蜜桃果腐病病菌株的分子特征序列分別進(jìn)行相似性比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蜜桃和黃桃的枝條潰瘍病菌(SEQ ID Nol和2)的分子特征序列相似性為99% ；水蜜桃枝條潰瘍病菌(SEQ ID No 1) 與水蜜桃果實(shí)腐爛病病菌(SEQ ID No 5)的分子特征序列相似性為89%，具體比對(duì)如下。1、水蜜桃和黃桃枝條潰瘍病菌分子特征序列相似性比對(duì)(灰色標(biāo)示處為堿基不同處)上SEQID No 1下SEQID No 2
gctgga--gc gcctcggcgc acccagaaac cctttgtgaa cttatacctt actgttgcct gctggaacgc gcctcggcgc acccagaaac cctttgtgaa cttatacctt actgttgcctcggcgcaggc cggccccctt ctgggggccc ctcgttcctg acgaggagca ggctcgccggcggcgcaggc cggccccctt ctgggggccc ctcgttcctg acgaggagca ggctcgccgg
cggccaagtt aactcttgtt tttattgtga aactctgaga ataaaacata aatgaatcaa cggccaagtt aactcttgtt cttattgtga aactctgaga ataaaacata aatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata
aactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata
agtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctc
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tggtattccggagggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcctggcttggtg
tggtattccggagggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcctggcttggtg
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ggactccgagcgcagtagttaaaccctcgctttggaaggactggcggtgccctgccgtta
ggactccgagcgcagtagttaaaccctcgctttggaaggactggcggtgccctgccgtta
aacccccaac tcttgaaaat ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc aacccccagc tcttgaaaat ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaagcatatcaataa gcggaatatcaataa gcgga2、水蜜桃枝條潰瘍病和水蜜桃果腐病的病菌分子特征序列相似性比對(duì)(灰色標(biāo)示處為堿基不同處)上SEQID No 1下SEQID No 5
gctgga一一gc gcctcggcgc acccagaaac cctttgtgaa cttatacctt actgttgcct gctgggaggg gcctaggcgc acccagaaac cctttgtgaa cttatacctt t-tgttgcct
cggcgcaggc cggccccctt ctgggggccc ctcgttcctg acgaggagca ggctcgccgg cggcgcatgc tggcctcta- --gtaggccc ctcaccccgg tggaggagac ggcacgccgg
權(quán)利要求
1.一種桃枝條潰瘍病菌的特異性PCR鑒別方法，其特征在于，采用引物對(duì)4進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，其正向引物序列為Pa-F2 5，GCCGGCCCCCTTCTG 3，，反向引物序列為Pa_R2 5， GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性PCR鑒別方法，其特征在于，所述桃枝條潰瘍病菌為 Phomopsis amygdalio
3.權(quán)利要求1所述的特異性PCR鑒別方法在桃枝條潰瘍病菌鑒別中的應(yīng)用。
4.引物對(duì)4或其延伸或縮短序列在桃枝條潰瘍病菌特異性PCR鑒別中的應(yīng)用。
5.引物對(duì)4或其延伸或縮短序列在Wiomopsisamygdali與Wiomopsis屬內(nèi)其他病原菌種鑒別中的應(yīng)用。
6.引物對(duì)4或其延伸或縮短序列在Wiomopsisamygdali與Wiomopsis屬外其他病原菌種鑒別中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種桃枝條潰瘍病菌的特異性PCR鑒別方法，采用引物對(duì)4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其正向引物序列為Pa-F25’GCCGGCCCCCTTCTG 3’，反向引物序列為Pa-R25’GCCTGCCTCGTTTTTACACA3’；所述的桃枝條潰瘍病菌為Phomopsis amygdali。本發(fā)明的桃枝條潰瘍病菌的特異性PCR鑒別方法可作為一種鑒定桃枝條潰瘍病菌Phomopsis amygdali，以及Phomopsis屬內(nèi)、屬外其它菌種的有效手段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便，所需實(shí)驗(yàn)條件不高，因此有非常高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102229985SQ20111013655
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者戴富明, 曾蓉, 陸金萍 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院