專利名稱：蛻膜、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)的快速獲取以及小分子修飾的基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種快速有效的蛻膜、胎盤MSC獲取和修飾的方法，具體地說是利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和合理的組織處理技術(shù)提高獲得蛻膜、胎盤MSC得率和速度，快速鑒定，并利用小核糖核酸和孕酮等小分子對(duì)MSC進(jìn)行修飾，進(jìn)一步改進(jìn)MSC免疫調(diào)節(jié)功能的方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。MSC具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞。同時(shí)MSC除了具有干細(xì)胞的一般生物學(xué)特點(diǎn)外，還具有免疫調(diào)節(jié)功能。此外該細(xì)胞還具有來(lái)源相對(duì)方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥的特性。因此近年來(lái)MSC已成為干細(xì)胞研究中的熱點(diǎn)，在免疫疾病治療、造血干細(xì)胞移植、組織工程、基因工程等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。MSC可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MSC移植能夠明顯延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間和減少異基因造血干細(xì)胞移植GVHD，我們也成功利用MSC移植治療了數(shù)十例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。目前認(rèn)為MSC通過分泌各種免疫調(diào)節(jié)分子，與免疫細(xì)胞的接觸誘導(dǎo)嵌合體形成以及抑制體內(nèi)DC細(xì)胞免疫活性從而誘導(dǎo)免疫耐受。目前的研究表明MSC還可以治療缺血性疾病。MSC和外周血干細(xì)胞聯(lián)合移植可以促進(jìn)乳腺癌患者和高危急性髓性白血病患者的造血恢復(fù)，并沒有相關(guān)的負(fù)作用，顯示了良好的促造血恢復(fù)的能力。MSC細(xì)胞的這種治療效果與MSC分泌各種造血因子及生成骨髓基質(zhì)從而有利于造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增、造血干細(xì)胞移植后的歸巢及植入、可縮短移植后骨髓造血功能恢復(fù)的時(shí)間有關(guān)。同時(shí)在大鼠大腦動(dòng)脈阻塞和心肌梗死模型的研究中均發(fā)現(xiàn)，MSC細(xì)胞具有改善病癥的作用。同時(shí)MSC作為一種干細(xì)胞，也具有干細(xì)胞多向分化潛能，MSC可以治療先天性骨形成不良、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)和赫爾利綜合征，在帕金森癥，老年癡呆癥，脊椎損傷，燒傷的治療也有報(bào)道。這些結(jié)果都提示了 MSC具有廣泛的治療功能，目前世界各國(guó)均投入大量的人力物力財(cái)力進(jìn)行廣泛和深入的研究。但上述的治療方案都需要大量的MSC進(jìn)行移植，因此建立穩(wěn)定有效快速的MSC資源庫(kù)具有極為重要的意義。一般認(rèn)為MSC在骨髓組織中的含量最豐富，但是隨著年齡的老化，自體骨髓中MSC數(shù)目顯著降低、增殖分化能力大幅度衰退，并存在病毒感染的潛在危險(xiǎn)，同時(shí)供體MSC的采集困難，使得尋找骨髓以外其它可替代的MSC “資源庫(kù)”的研究被提上日程。目前，已經(jīng)從脂肪、胚胎、羊膜液、胎盤、蛻膜及臍帶等骨髓以外的組織中分離出MSC。而在這些組織中，蛻膜及胎盤屬于醫(yī)療廢棄物，最容易獲得，且對(duì)其研究及應(yīng)用不涉及倫理學(xué)問題，并且具有穩(wěn)定大量的來(lái)源，因此具有研究的價(jià)值。目前的研究表明，蛻膜及胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞存在于蛻、膜及胎盤沃頓膠和血管周圍組織中，在該部位培養(yǎng)獲取的成纖維細(xì)胞樣，表達(dá)a-平滑肌肌動(dòng)蛋白及多種MSC標(biāo)記物(⑶29、⑶44、⑶51、⑶105、SH2、SH3)，但不表達(dá)內(nèi)皮或白細(xì)胞特殊抗原⑶34、⑶45。同時(shí)在蛻膜及胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5-氮胞苷，MSC向心肌細(xì)胞分化，改變培養(yǎng)條件還可向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞分化，提示了蛻膜及胎盤MSC細(xì)胞和骨髓MSC細(xì)胞具有相同的表型和分化潛能 。目前用于分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有4種，即流式細(xì)胞分選法、磁珠分離法、密度梯度離心法和貼壁篩選法。對(duì)流式細(xì)胞分選法和磁珠分離法來(lái)說，因迄今尚未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性很強(qiáng)的表面標(biāo)記物，研究者需要選用多個(gè)表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)；此外，這兩種方法對(duì)細(xì)胞活性的影響較大、實(shí)驗(yàn)條件要求較高，并不利于細(xì)胞的分離分選，故目前尚未廣泛應(yīng)用。密度梯度離心法由于需要較精密的儀器和合適的分離液，對(duì)細(xì)胞也有一定的影響，并不適合用于大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。而貼壁篩選法，所獲的細(xì)胞形態(tài)均一，增殖速度快，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便，成本低，有望成為較實(shí)用的生產(chǎn)方法。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了蛻膜及胎盤MSC細(xì)胞的獲取方法，獲取效率相對(duì)較低，速度較慢。我們改進(jìn)了傳統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞消化方法和消化酶的配方，采用半組織貼壁方法可以大量快速的獲取蛻膜及胎盤MSC細(xì)胞。并有很高的獲得效率和得率。本方法簡(jiǎn)單易行，更有利于用于生產(chǎn)實(shí)踐。此外MSC通過基因修飾可以作為攜帶外源基因的良好載體，已經(jīng)有人把細(xì)胞因子，如IL23、EPO等導(dǎo)入MSC細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入體內(nèi)后獲得長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)。有人把IFNP的基因?qū)隡SC內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤的微環(huán)境容易使MSC植入，進(jìn)入腫瘤內(nèi)的MSC通過分泌IFNP細(xì)胞因子抑制腫瘤生長(zhǎng)，顯示了 MSC具有可能的腫瘤生物治療功能。提示了通過合理的基因修飾方式，可以進(jìn)一步改善MSC的功能，更合理的用于實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明在得到的蛻膜及胎盤MSC基礎(chǔ)上，利用小核糖核酸和孕酮對(duì)MSC進(jìn)行了修飾，對(duì)MSC的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了改進(jìn)，更利于臨床運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過優(yōu)化蛻膜及胎盤組織消化酶配方和消化細(xì)胞貼壁的方式，快速有效利用蛻膜及胎盤等醫(yī)療廢棄物為資源獲取蛻膜及胎盤MSC以及快速M(fèi)SC鑒定，并通過小核糖核酸和激素等小分子對(duì)MSC細(xì)胞進(jìn)行合理的修飾改善MSC免疫調(diào)節(jié)功能的方法，具體如下剪取剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦蛻膜及胎盤，置于無(wú)菌預(yù)冷的PBS中保存。蛻膜及胎盤經(jīng)過嚴(yán)格的病原體檢測(cè)確認(rèn)安全后使用。超凈工作臺(tái)中，將蛻膜及胎盤組織放于DMEM/F12培養(yǎng)基中剪成2mm3左右的組織塊。常規(guī)蛻膜及胎盤組織消化使用的酶為膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合液，如果想將組織完全消化往往需要比較長(zhǎng)的時(shí)間，影響原代細(xì)胞狀態(tài)。而如果消化時(shí)間較短，不能將組織完全消化，則會(huì)影響分離效率。并且這種消化方式對(duì)組織塊的粉碎或者剪碎的要求比較高，大塊未剪碎的組織常常不能完全消化。同時(shí)，使用膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合液消化的組織多成粘稠狀，需要大量的緩沖液稀釋，多次沖洗才能獲取相應(yīng)的細(xì)胞，更加大了MSC細(xì)胞獲取的難度。因此，我們配置了一種專門用于蛻膜及胎盤組織消化的酶CDH消化酶，該酶在較短的時(shí)間內(nèi)可以充分的將蛻膜及胎盤組織消化，對(duì)組織塊粉碎的要求較低，且消化液不粘稠，更容易沖洗離心獲取MSC細(xì)胞。常規(guī)蛻膜及胎盤組織消化后，會(huì)通過100目篩網(wǎng)過濾，獲取單細(xì)胞懸液，然后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁，這種方法MSC獲取較快，但獲取的MSC細(xì)胞一般較少，且由于中間處理過程太多，細(xì)胞狀態(tài)受到影響。也有文獻(xiàn)報(bào)道通過組織塊貼壁的方法獲取MSC，但這種方法對(duì)組織塊處理要求過高，大部分組織塊不能貼緊細(xì)胞瓶壁，且一般需要3周才能獲取MSC細(xì)胞。通過我們的觀察發(fā)現(xiàn)，組織通過消化酶消化后，MSC細(xì)胞一般成團(tuán)或者粘附在未完全消化組織上，將消化液通過100目篩網(wǎng)過濾后大部分消化出來(lái)的MSC細(xì)胞因成團(tuán)不能通過篩網(wǎng)，影響獲取效率。對(duì)此我們發(fā)明了如下的方法CDH消化酶消化后的組織液無(wú)需通過篩網(wǎng)，大部分單個(gè)細(xì)胞或者M(jìn)SC細(xì)胞團(tuán)均可貼壁，即使有未消化完全的小塊組織，在通過CDH消化酶后，也變得極易貼緊細(xì)胞瓶壁，能快速的獲取MSC細(xì)胞。該方法結(jié)合了蛻膜及胎盤組織消化獲取單細(xì)胞和組織貼壁方法的雙重優(yōu)點(diǎn)，有效提高了 MSC的得率和速度。具體的操作過程如下剪碎的組織與⑶H混合酶溶液按I : I的比例混合加入50ml離心管中，置于37°C搖床中，200rpm振蕩，消化3h左右。消化后的組織PBS洗滌三次后，重懸于含有12%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，鋪入T-25培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞與組織，加入新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，隔天換液。細(xì)胞長(zhǎng)至80%豐度時(shí)(約8天)，細(xì)胞消化前三代將細(xì)胞按I : I的比例接種于新的T-25培養(yǎng)瓶中。以后細(xì)胞消化均按I : 3傳代。第8天即可獲得第一代MSC，約2 X IO6個(gè)細(xì)胞，并可流式檢測(cè)MSC相應(yīng)表型。將得到的MSC以35000個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，pre_miRNA181a和pre-miRNA143分子分別以15nM濃度使用Lipofectamine 2000對(duì)MSC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR_181a和miR-143分子的拮抗劑(anti_miR-181a和anti-miR-143)用如上同樣的方法轉(zhuǎn)染即可沉默相應(yīng)miRNA分子的表達(dá)。pre-mi RNA分子以及anti-mi RNA inhibitor均為(AMBION)公司合成。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL6、VEGF, IDO、TGF-beta和C0X-2的mRNA表達(dá)水平。并利用ELISA試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL6和VEGF蛋白表達(dá)水平。MSC以105/well的密度接種于12孔板中，鋪板后分別加入IOul不同濃度孕酮(1(T7M、KT6M 和 I(T5M)，24h 和 48h Q-PCR 和 ELISA 檢測(cè) PGE2 及 IL-6 的表達(dá)水平。并取適量細(xì)胞與DC(MSC DC=I 10)共培養(yǎng)于RMPI 1640完全培養(yǎng)基中(含10%的小牛血清)，加CpG刺激24h，流式檢測(cè)DC表面⑶40、⑶86及MHC-II分子的表達(dá)情況。


圖I、蛻膜及胎盤來(lái)源的MSC細(xì)胞形態(tài)采用本方法獲取的蛻膜MSC(A)和胎盤MSC(B)培養(yǎng)3天后的細(xì)胞形態(tài)，組織塊處生發(fā)出的貼壁細(xì)胞，呈發(fā)散型梭狀。也有部分單個(gè)貼壁細(xì)胞并開始分裂增值。(C)采用本方法獲取的第一代蛻膜MSC(C)和胎盤MSC(D)培養(yǎng)8天后的形態(tài)，細(xì)胞豐度達(dá)到80%，成為形態(tài)相對(duì)均一的梭型成纖維樣細(xì)胞，漩渦狀生長(zhǎng)。 圖2、獲取的MSC細(xì)胞流式快速表型檢測(cè)將在T-25塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的第三代蛻膜MSC(A)和胎盤MSC(B)細(xì)胞消化獲得單細(xì)胞懸液，采用單克隆熒光抗體分別標(biāo)記上機(jī)檢測(cè)，用CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析MSC細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性表型⑶105、⑶73、⑶90、CD44、CD29、HLA-ABC 陽(yáng)性率不低于 95% ;陰性 CD34、CD14、CDllb、CD19、HLA-DR、CD31 陽(yáng)性率不高于2%。圖3、利用miRNA143和miRNA181a對(duì)MSC進(jìn)行修飾⑷使用preiiRNA分子以及anti-miRNAinhibitor分子分別對(duì)MSC細(xì)胞進(jìn)行修飾，miRNA143和miRNA181a分子在MSC中被分別高表達(dá)和低表達(dá)，并通過PCR擴(kuò)展，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，U6為內(nèi)參。(B)在MSC細(xì)胞中高表達(dá)miRNA181a，提取細(xì)胞RNA，并使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL6、VEGF_A和IDOl的mRNA表達(dá)水平。收集細(xì)胞上清，并用ELISA試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL6和VEGF蛋白表達(dá)水平。(C)在MSC細(xì)胞中分別高表達(dá)miRNA143和沉默miRNA143，提取細(xì)胞RNA，并使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TAK1、C0X-2和IDOl的mRNA表達(dá)水平。圖4、孕酮處理對(duì)MSC細(xì)胞影響(A)使用不同濃度孕酮處理MSC，并分別用WESTBL0T和ELISA檢測(cè)C0X-2和PGE2的蛋白表達(dá)水平。(B)使用不同濃度孕酮處理MSC，并使用實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA試劑盒法檢測(cè)IL6的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(C)MSC與DC共培養(yǎng)，加CpG刺激24h，流式檢測(cè)DC表面⑶40、⑶86及MHC-II分子的表達(dá)情況，并用CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和合理的組織處理技術(shù)提高獲得蛻膜及胎盤MSC得率和速度，并快速鑒定，并通過小分子對(duì)MSC細(xì)胞進(jìn)行合理的修飾改善MSC免疫調(diào)節(jié)功能。發(fā)明人公布了一種優(yōu)化的蛻膜及胎盤組織消化酶配方和消化細(xì)胞貼壁方式以及快速M(fèi)SC鑒定，并通過小分子對(duì)MSC細(xì)胞進(jìn)行合理的修飾改善MSC免疫調(diào)節(jié)功能的方法。下面就具體實(shí)施例來(lái)說明本發(fā)明的具體運(yùn)用。實(shí)例I蛻膜及胎盤MSC細(xì)胞快速獲取剪取剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦蛻膜及胎盤，置于無(wú)菌預(yù)冷的PBS中保存。蛻膜及胎盤經(jīng)過嚴(yán)格的病原體檢測(cè)(梅毒螺旋體、艾滋病病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、梅毒、支原體等微生物病原體檢測(cè))，確認(rèn)安全后使用。同時(shí)排除早產(chǎn)、胎膜早破、絨毛羊膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎、糖尿病等因素的蛻膜及胎盤樣本，確保獲取的MSC正常。超凈工作臺(tái)中，將蛻膜及胎盤取出放入玻璃培養(yǎng)皿中，用PBS洗凈，并將蛻膜及胎盤組織放于DMEM/F12培養(yǎng)基中用手術(shù)剪刀剪成2mm3左右的組織塊。配置CDH消化酶(II型膠原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明質(zhì)酸酶IOU/ml)，37°C溶解于DMEM/F12培養(yǎng)基，過濾0. 22 y m的濾器除菌備用。消化酶最好現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存時(shí)間勿超過I周。剪碎的組織與⑶H混合酶溶液按I : I的體積比例混合與50ml離心管中，置于37°C搖床中，200rpm振蕩，消化3h左右(待組織塊基本消化即可，少數(shù)較小的組織塊的殘留并不影響MSC獲取效率)。將消化后的組織液4°C，300g離心5min，棄上清，棄上清，將沉淀用PBS重懸于50ml新鮮培養(yǎng)基中，4°C，300g離心5min，棄清，PBS洗兩次，注意不要將細(xì)胞和組織沉淀?xiàng)?去。最后一遍離心后，棄上清，將沉淀重懸于含有12%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，鋪入T-25培養(yǎng)瓶。鋪入細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶前不能用100目篩網(wǎng)過濾，過濾會(huì)影響MSC細(xì)胞的獲得效率。(約2cm3的蛻膜及胎盤消化所得的沉淀鋪于I個(gè)T-25培養(yǎng)瓶中)
培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁的細(xì)胞與組織，加入新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，隔天換液。MSC細(xì)胞會(huì)在沿著貼壁的組織塊或者貼壁的細(xì)胞長(zhǎng)出。細(xì)胞長(zhǎng)至80%豐度時(shí)(約8天)，細(xì)胞消化液(0.25%胰酶+0.02% EDTA)，前三代將細(xì)胞按I : I的比例接種于新的T-25培養(yǎng)瓶中，以保證生長(zhǎng)速率。以后細(xì)胞消化均按I : 3傳代。每2cm3的蛻膜及胎盤，第8天獲得第一代MSC，約2 X IO6個(gè)細(xì)胞。實(shí)例2蛻膜及胎盤MSC細(xì)胞快速鑒定細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察通過本方法獲得的原代細(xì)胞和組織塊多在2天內(nèi)貼壁，培養(yǎng)4-6天即可觀察到從組織塊處生發(fā)出的貼壁細(xì)胞，呈發(fā)散型梭狀。同時(shí)也可觀察到部分單個(gè)貼壁細(xì)胞開始分裂增值。通過I次傳代(8天)后，細(xì)胞增值較快，成為形態(tài)相對(duì)均一的梭型成纖維樣細(xì)胞，漩渦狀生長(zhǎng)。連續(xù)傳代15次細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。按照文獻(xiàn)和其他專利的報(bào)道，獲取第一代MSC細(xì)胞需要2周，并且成功率不高。本方法獲得的細(xì)胞數(shù)和獲取時(shí)間以及成功率均明顯優(yōu)于按照其他文獻(xiàn)和專利。流式檢測(cè)分離、擴(kuò)增的MSC如何進(jìn)行鑒定，是目前的爭(zhēng)議問題。MSC能表達(dá)多種表面抗原但不特異，但通過檢查多個(gè)表面標(biāo)記可以區(qū)分MSC和其他細(xì)胞，相關(guān)文獻(xiàn)也有報(bào)道。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)是一種快速精確的檢測(cè)手段，可以很有效快速的確定獲取細(xì)胞的表型。避免了傳統(tǒng)的通過檢測(cè)MSC細(xì)胞分化能力鑒定耗時(shí)過長(zhǎng)的缺點(diǎn)。將在T-25塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的第三代MSC細(xì)胞用細(xì)胞消化液消化獲得單細(xì)胞懸液，并細(xì)胞計(jì)數(shù)。將MSC細(xì)胞重懸至I X IO7細(xì)胞數(shù)/毫升，單細(xì)胞懸液分裝入流式管中，每管100 ill。在每個(gè)流式管中加入相應(yīng)標(biāo)記的流式熒光抗體，混勻。4°C避光孵育30分鐘。每個(gè)流式管加入500 u I PBS洗去未標(biāo)記上的抗體，4°C，300g離心lOmin，棄上清，棄上清，重復(fù)三次。隨后將細(xì)胞沉淀重懸與IOOiU PBS中。流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)表型，并通過相應(yīng)軟件分析。MSC細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性表型⑶105、⑶73、⑶90、⑶44、⑶29、HLA-ABC陽(yáng)性率不低于95% ;陰性⑶34、⑶14、⑶lib、⑶19、HLA-DR、⑶31陽(yáng)性率不高于2%實(shí)例3 miRNA181a 和 miRNA143 對(duì) MSC 的修飾上述方法取得的MSC以35000個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，pre_miRNA181a和pre-miRNA143分子分別以15nM濃度使用Lipofectamine 2000對(duì)MSC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR-181a和miR-143分子的拮抗劑(anti_miR-181a和anti-miR-143)用如上同樣的方法轉(zhuǎn)染即可沉默相應(yīng)miRNA分子的表達(dá)。pre-miRNA分子以及anti-miRNA inhibitor均為(AMBION)公司合成。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，吸取細(xì)胞上清保存?zhèn)溆?。用Trizol Reagent試劑提取細(xì)胞總RNA。用 Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒反轉(zhuǎn) lug 總 RNA 成為 cDNA.利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子IL6、VEGF、ID0、TGF-beta和C0X-2的mRNA表達(dá)水平。并利用ELISA試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL6和VEGF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，在MSC細(xì)胞中高表達(dá)miRNA181a后MSC的IL6、VEGF-A和IDO的mRNA 和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而低表達(dá)miRNA181a并不影響MSC細(xì)胞中的IL6、VEGF_A和IDO的表達(dá)水平。在MSC細(xì)胞中高表達(dá)miRNA143后MSC的TAK1、C0X_2和IDOl的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而低表達(dá)miRNA143后MSC細(xì)胞中的TAKUC0X-2和IDO表達(dá)水平升高。實(shí)例4孕酮對(duì)MSC的修飾
MSC以105/well的密度接種于12孔板中，鋪板后分別加入IOul不同濃度孕酮(1(T7M、KT6M 和 I(T5M)，24h 和 48h Q-PCR 和 ELISA 檢測(cè) PGE2 及 IL-6 的表達(dá)水平。并取適量細(xì)胞與DC(MSC DC=I 10)共培養(yǎng)于RMPI 1640完全培養(yǎng)基中(含10%的小牛血清)，加CpG刺激24h，流式檢測(cè)DC表面CD40、⑶86及MHC-II分子的表達(dá)情況。
結(jié)果表明孕酮處理后MSC分泌PGE2和IL-6的能力明細(xì)上升，并且P4處理的MSC與DC共培后，DC表面MHC-II、⑶40和⑶86的表達(dá)均比MSC+DC共培養(yǎng)組均顯著降低，這表明提示P4能加強(qiáng)MSC對(duì)DC的抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種專門用于蛻膜及胎盤組織消化的酶=CDH消化酶，該酶在較短的時(shí)間內(nèi)可以充分的將蛻膜及胎盤組織消化，對(duì)組織塊粉碎的要求較低，且消化液不粘稠，更容易沖洗離心獲取MSC細(xì)胞。這種消化液的特征是含有II型膠原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明質(zhì)酸酶10U/ml，37度溶解于DMEM/F12培養(yǎng)基，過濾O. 22 μ m的濾器除菌備用。消化酶最好現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存時(shí)間勿超過I周。
2.一種快速有效獲得蛻膜及胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征為運(yùn)用要求書I所述的專用蛻膜及胎盤組織消化酶配方，快速有效利用新生胎兒的蛻膜及胎盤為資源獲取蛻膜及胎盤MSC以及快速M(fèi)SC鑒定的方法。
3.一種miRNA181a和miRNA143的MSC修飾方法，其特征為在權(quán)利要求2中所述的蛻膜及胎盤MSC上根據(jù)需要進(jìn)行miRNA的修飾，改變MSC相關(guān)調(diào)節(jié)因子的分泌，提供MSC的免疫調(diào)節(jié)能力。
4.一種孕酮對(duì)MSC修飾方法，其特征為在權(quán)利要求2中所述的蛻膜及胎盤MSC經(jīng)過孕酮的孵育后，MSC對(duì)DC免疫細(xì)胞的抑制功能得到進(jìn)一步加強(qiáng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種快速有效獲得蛻膜及胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)并通過小核糖核酸和孕酮激素等小分子處理對(duì)MSC進(jìn)行體外修飾的方法。特征是通過一種優(yōu)化蛻膜及胎盤組織消化酶配方和消化細(xì)胞貼壁的方式，快速有效利用新生胎兒的蛻膜及胎盤為資源獲取蛻膜及胎盤MSC，并采用miRNA143、miRNA181a以及孕酮對(duì)MSC進(jìn)行修飾，使MSC免疫調(diào)節(jié)能力得到進(jìn)一步加強(qiáng)。本方法優(yōu)化了現(xiàn)有的蛻膜及胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞獲取方法，并首次通過小核糖核酸和激素對(duì)MSC進(jìn)行修飾，從而有效提高了MSC的免疫調(diào)節(jié)功能。為蛻膜及胎盤MSC的科研和臨床運(yùn)用提供一種科學(xué)的快速有效的獲取和修飾方法。
文檔編號(hào)C12N15/88GK102634500SQ201110136700
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者侯亞義, 劉柳, 李鵬飛, 王亞平, 趙葉琳, 趙曉寅 申請(qǐng)人:侯亞義