專利名稱：檢測水體中是否存在殺蟲劑及殺蟲劑含量范圍的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測水體中是否存在殺蟲劑及殺蟲劑含量范圍的試劑盒。
背景技術(shù)：
施用農(nóng)藥防治農(nóng)作物的病、蟲、草、鼠害是保障我國“兩高一優(yōu)”農(nóng)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要措施之一。但是，農(nóng)藥的使用是一把雙刃劍，由于農(nóng)藥的大量濫用，施用區(qū)的水質(zhì)受污染，生態(tài)平衡被破壞，同時，不合理使用化學(xué)農(nóng)藥，引起害蟲抗性的迅速發(fā)展增強(qiáng)，迫使農(nóng)藥的用量和次數(shù)相應(yīng)增加，對農(nóng)藥的使用和依賴程度呈現(xiàn)出惡性循環(huán)狀態(tài)，造成農(nóng)藥施用和殘留超標(biāo)現(xiàn)象日漸加重。農(nóng)藥使用中只有10-20%左右的劑量到達(dá)目標(biāo)害蟲，其余大部分的農(nóng)藥或附著于作物與土壤表面，或飄散在大氣中，通過降雨等經(jīng)地表徑流進(jìn)入地表水和地下水，污染水體、土壤和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)。在農(nóng)藥之中，有機(jī)磷農(nóng)藥對身體極為有害。低劑量的有機(jī)磷農(nóng)藥可使人產(chǎn)生慢性中毒，對人體致癌、致畸、致突變的危害是不容質(zhì)疑的。急性中毒可引起肌肉痙攣、瞳孔收縮、呼吸困難，甚至引發(fā)死亡。目前，大多數(shù)污水中農(nóng)藥殘留的檢測需要運用大型儀器，費時費力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測水體中是否存在殺蟲劑及殺蟲劑含量范圍的試劑
品.ο本發(fā)明提供了一種確定待測水體中殺蟲劑的試劑盒，包括如下組分XB1蛋白、固蘭B鹽和β-乙酸萘酯；所述XBl蛋白為如下(a)或(b)或(c)(a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；所述確定待測水體中殺蟲劑為確定待測水體中是否含有殺蟲劑和/或確定待測水體中的殺蟲劑含量范圍。所述試劑盒具體可由酶管、底物管、顯色劑管和pH7. 050mM磷酸緩沖液組成；所述酶管中裝有所述XBl蛋白；所述底物管中裝有所述乙酸萘酯；所述顯色劑管中裝有所述固蘭B鹽。所述pH7. 050mM磷酸緩沖液具體可為將磷酸氫二鈉Na2HPO4 · 12H20和磷酸二氫鈉 NaH2PO4 · 2H20溶于水得到的緩沖液。所述試劑盒可用于確定待測水體中的殺蟲劑；所述確定待測水體中的殺蟲劑為確定待測水體中是否含有殺蟲劑和/或確定待測水體中的殺蟲劑含量范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助確定待測水體中的殺蟲劑的方法，包括如下步驟(1)將取自待測水體的樣本和蒸餾水樣本分別用甲苯進(jìn)行抽提，收集抽提液；
(2)將抽提液中的甲苯揮發(fā)后，剩余物質(zhì)溶于乙醇水溶液；(3)在步驟⑵的溶液中加入XBl蛋白共孵育；所述XBl蛋白為如下(a)或(b)或 (c) (a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；(4)在步驟(3)的溶液中加入β -乙酸萘酯共孵育；(5)將步驟(4)的溶液中加入固蘭B鹽，通過比較待測水體樣本和蒸餾水樣本的顏色確定待測水體中的殺蟲劑；所述確定待測水體中的殺蟲劑為確定待測水體中是否含有殺蟲劑和/或確定待測水體中的殺蟲劑含量范圍(如果待測水體樣本的顏色比蒸餾水樣本顏色明顯減弱，即可判定有殺蟲劑的存在)。所述乙醇水溶液中乙醇的含量具體可為50% (體積百分含量)。所述步驟(3)中共孵育時間具體可為5分鐘。所述步驟(4)中共孵育的時間具體可為3分鐘。所述XBl蛋白的制備方法具體可包括如下步驟(1)將序列表的序列2自5’末端第115至1725位核苷酸所示的DNA分子插入載體pET28a的多克隆位點，得到重組表達(dá)載體；(2)將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌；(3)將所述重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到XBl蛋白。所述誘導(dǎo)表達(dá)的方法具體可為在0D_ = 0. 6的重組農(nóng)桿菌菌液中加入終濃度為 ImM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)16-18h。所述方法還可包括將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌進(jìn)行超聲破碎并離心取上清液的步驟。所述超聲破碎的參數(shù)優(yōu)選為超聲頻率14HZ、間隔10秒進(jìn)行一次超聲處理、每次超聲處理的時間為5秒、超聲處理20次。所述離心的參數(shù)優(yōu)選為4°C、12000g、15分鐘。所述用甲苯進(jìn)行抽提具體可為將甲苯與所述樣本震蕩混勻，靜置分層后取甲苯相。以上任一所述殺蟲劑具體可為有機(jī)磷殺蟲劑(有機(jī)磷類殺蟲劑)、氨基甲酸酯殺蟲劑(氨基甲酸酯類殺蟲劑)或擬除蟲菊酯殺蟲劑(擬除蟲菊酯類殺蟲劑)。所述氨基甲酸酯殺蟲劑具體可為殘殺威或巴沙。所述有機(jī)磷殺蟲劑具體可為馬拉硫磷、敵敵畏或敵百蟲)。所述擬除蟲菊酯殺蟲劑具體可為胺菊酯、溴氰菊酯或氯菊酯。本發(fā)明可以快速檢測水體中的殺蟲劑殘留，以確定水體是否被污染，平均檢測限可以達(dá)到小于lyg/ml。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)來自斜紋夜蛾的XBl蛋白(或XBl融合蛋白)具有羧酸酯酶活性，可與天然底物β -乙酸萘酯反應(yīng)生成β -萘酚，經(jīng)固藍(lán)B鹽顯色而成紅色；而當(dāng)羧酸酯酶被有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類或擬除蟲菊酯類殺蟲劑抑制后，則失去或部分失去上述酶學(xué)反應(yīng)能力而紅色減弱，其減弱的程度和殺蟲劑種類和濃度成正比，可實現(xiàn)對水中殺蟲劑的快速檢測。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)前用甲苯初步提取，可以提高檢測的靈敏度，并消除污水中重金屬及其它無機(jī)鹽離子等對酶的影響；(2)對多數(shù)殺蟲劑檢測濃度可低于ι μ g/ml ； (3)成本低，可實現(xiàn)快速檢測。


圖1為實施例3的步驟三的顯色結(jié)果；1、2 陰性對照樣本；3、4 :0. 5 μ g/ml殘殺威水溶液。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。殘殺威、馬拉硫磷、敵敵畏、敵百蟲、巴沙、胺菊酯、溴氰菊酯和氯菊酯均購自北京市農(nóng)藥檢定所，均為標(biāo)樣(純度在95%以上)。pGEM-T easy vector =Promega公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號A1380。斜紋夜蛾(Spodoptera litura)公眾可以從中國科學(xué)院動物研究所獲得；參考文獻(xiàn):Feng Cui, Zhe Lin a, Hongsheng Wang, Silu Liu, Haijing Chang, Gerald Reeck, Chuanling Qiao, Michel Raymond, Le Kang, Two single mutations commonly cause qualitative change of nonspecific carboxylesterases in insects.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2011,41 :1_8。實施例1、xbl融合基因的表達(dá)一、xbl基因的克隆1、提取斜紋夜蛾的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以步驟1提取的cDNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(約1611bp)。Fl (上游引物)5，-ATGGTGCAAGTGAGAGTGAATGA-3，；Rl (下游引物)5，-TCACAATACATATTTTTCATACAATTT-3，。PCR 反應(yīng)體系(50 μ 1) 10Xbuffer 5 μ 1，dNTP (IOmM) 1 μ 1，F(xiàn)l (IOuM) 1· 25 μ 1， Rl (IOuM) 1. 25 μ 1，Taq(Expand High Fidelity)。· 75 μ 1，水 39. 75 μ 1，cDNA 模板 1μ 1。PCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性^iiin ；然后進(jìn)行30個循環(huán)94 °C 15s，55 °C 30s， 68 °C 2min ；最后 68°C 延伸 7min，4°C 保存。3、用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，產(chǎn)品號DP208)回收純化步驟2的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，在T4DNA連接酶的作用下與pGEM-T easy vector進(jìn)行連接(室溫放置lh，然后 4°C過夜)，得到連接產(chǎn)物。4、將2 μ 1步驟3的連接產(chǎn)物加入50ul大腸桿菌DH5 α (天根公司產(chǎn)品)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20mim，42°C熱激45s，冰浴aiiin ；加入500 μ 1液體LB培養(yǎng)基(不含抗生素)， 37°C下200rpm復(fù)蘇Ih ；3600rpm離心菌液90s，在超凈工作臺中吸除400 μ 1上清液，用剩余的上清液懸浮沉淀的菌體，用涂布器將懸浮液均勻的涂在篩選平板上(固體LB培養(yǎng)基中含有50 μ g/ml氨芐青霉素，然后將40 μ 1 20mg/ml X-gal和40 μ 120mg/ml IPTG涂到固體平板上)，37°C恒溫箱中培養(yǎng)IMi左右；挑取白斑放到3ml液體LB培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml 氨芐青霉素)中，37°C下220rpm搖菌過夜。
5、將步驟4的菌液用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定(PCR產(chǎn)物約161 Ibp的為陽性)，PCR鑒定陽性的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(Mcl和B10I雙酶切；獲得約3015bp 和約1611bp的酶切產(chǎn)物的為陽性)，酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送至華大公司測序。測序結(jié)果表明，在pGEM-T easy vector中插入了序列表的序列2所示的DNA(序列表的序列2自5’末端第115至1722位核苷酸所示的xbl基因，編碼序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸殘基所示的XBl蛋白)，即得到了重組質(zhì)粒pT-xbl。二、重組表達(dá)載體和重組菌的構(gòu)建1、用限制性內(nèi)切酶Mel和BioI雙酶切重組質(zhì)粒pT-xbl，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，產(chǎn)品號DP208)純化回收小片段(約1611bp)。2、用限制性內(nèi)切酶Mel和BioI雙酶切載體pET28a (Novagen)，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒(Tiangen，產(chǎn)品號DP208)純化回收載體骨架(約5369bp)。3、將步驟1的小片段和步驟2的載體骨架連接(37°C水浴他)，得到連接產(chǎn)物。4、將2 μ 1步驟3的連接產(chǎn)物加入50ul大腸桿菌BL21 (DE3)(天根公司產(chǎn)品)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20mim，42°C熱激45s，冰浴aiiin ；加入500 μ 1液體LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C下170rpm復(fù)蘇Ih ；3600rpm離心菌液90s，在超凈工作臺中吸除400 μ 1上清液， 用剩余的上清液懸浮沉淀的菌體，用涂布器將懸浮液均勻的涂在LK平板上(含有50μ g/ml 卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基)，37°C恒溫箱中培養(yǎng)IMi左右。5、挑取平板上的單菌落，接種到LK液體培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml卡那霉素的液體 LB培養(yǎng)基)中37°C振蕩培養(yǎng)12t^200-250rpm)。6、將步驟5的菌液用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定(PCR產(chǎn)物約1611bp 的為陽性)，PCR鑒定陽性的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(Mcl和B10I雙酶切；獲得約 3015bp和約1611bp的酶切產(chǎn)物的為陽性)。結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒ρΕΤΧΒ1(在載體 pET28a中插入了序列表的序列2自5’末端第115至1725位核苷酸所示的xbl基因，xbl 基因與載體pET28a中的核苷酸融合形成xbl融合基因；xbl融合基因如序列表的序列2所示，編碼序列表的序列1所示的XBl融合蛋白)和重組菌(含有重組質(zhì)粒pETXBl的大腸桿菌 BL21(DE3))。三、xbl基因的誘導(dǎo)表達(dá)1、挑取步驟二制備的重組菌的單菌落，加入LB培養(yǎng)基(含50yg/ml卡那霉素)中，37°C下200rpm震蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6，然后加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng) 16h(16-18h 均可)。2、將步驟1的菌液4000rpm/min離心IOmin (離心半徑9cm)，取沉淀，加入十分之一菌液體積的0.05M磷酸緩沖液(pH7.0)重懸細(xì)胞，在冰浴上進(jìn)行超聲破碎(超聲頻率 14HZ ；間隔10秒進(jìn)行一次超聲處理，每次超聲處理的時間為5秒，超聲處理20次)，離心 (40C，12000g) 15分鐘，收集上清液。3、取若干支1. 5ml離心管，每支離心管加入10 μ 1步驟2的上清液，在冰凍干燥機(jī)上凍干過夜，即為酶管(含有XBl融合蛋白)。四、對照管的制備1、將載體pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到對照菌。2、將對照菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，方法同步驟三的1。
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3、取步驟2的菌液進(jìn)行超聲破碎，方法同步驟三的2。4、取若干支1. 5ml離心管，每支離心管加入10 μ 1步驟2的上清液，在冰凍干燥機(jī)上凍干過夜，即為對照管。實施例2、試劑盒的組裝試劑盒(100次)由22支酶管、22支底物管、22支顯色劑管、1瓶緩沖液00ml)和 250只0. 2ml離心管組成。緩沖液由為50mM磷酸緩沖液(pH7. 0)；是將磷酸氫二鈉Na2HPO4 · 12H20(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；產(chǎn)品編號10020318)和磷酸二氫鈉NaH2PO4 ·2Η20(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司； 產(chǎn)品編號20040718)溶于水得到的。顯色劑管內(nèi)含5mg固蘭B鹽(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號 70117082)的 1. 5ml 離心管。底物管內(nèi)含Imgii-乙酸萘酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號 30127624)的 1. 5ml 離心管。酶管實施例1的步驟三制備的酶管。試劑盒的儲存條件酶管在4°C干燥條件下儲存，其它組分均在室溫(15_25°C )、 避光、干燥條件下儲存。實施例3、試劑盒的使用一、試劑盒中各組分的預(yù)處理將實施例2制備的試劑盒中的組分分別進(jìn)行如下處理在每支酶管中加入Iml預(yù)冷的試劑盒提供的緩沖液，得到酶溶液(酶溶液中的XBl 融合蛋白濃度約20yg/ml)。在每支顯色劑管中加入Iml蒸餾水，得到顯色劑溶液(固藍(lán)B鹽的質(zhì)量百分含量為 0. 5% )。在每支底物管中加入0. 4ml無水乙醇和0. 6ml試劑盒提供的緩沖液，得到底物溶液(β -乙酸萘酯的質(zhì)量百分含量為0. )。酶溶液、底物管溶液和顯色劑溶液均應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配；從節(jié)省成本考慮，每次最好至少 5個待測樣品一起做。二、試劑盒的應(yīng)用(檢測殘殺威)1、樣本的制備將殘殺威用無水乙醇配成ΙΟΟΟμ g/ml的母液，再取適量母液溶于蒸餾水，使其終濃度為0. 5 μ g/ml，作為待測樣本(0. 5 μ g/ml殘殺威水溶液)。將蒸餾水作為陰性對照樣本。2、試劑盒的應(yīng)用(1)將20ml待測樣本和陰性對照樣本分別加到25ml容量瓶中(每個樣本設(shè)置兩
瓶重復(fù))。(2)每個容量瓶中各加入100 μ 1甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號1002^94)，震蕩3分鐘，靜置分層，加入蒸餾水至管口(不定量，只是為了方便吸取上相液)，上相液即為IX樣品。(3)取10 μ 1 IX樣品于一支0. 5ml離心管蓋子上晾干。
(4)向晾干的離心管蓋子上加入10μ 1溶液甲(將無水乙醇和試劑盒提供的緩沖液等體積混合；無水乙醇為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號10009297)，吹打混勻。(5)向離心管管底加入20 μ 1酶溶液，稍許離心使溶液混勻并集中到管底，室溫靜置5分鐘。(6)向離心管蓋子上加入20 μ 1底物溶液，稍許離心使溶液混勻并集中到管底，室溫靜置3分鐘。(7)向離心管蓋子上加入20 μ 1顯色劑溶液，輕甩使之與管底溶液混合，觀察顯色情況。陰性對照樣本的顯色結(jié)果見圖1的1和2。待測樣本的顯色結(jié)果見圖1的3禾口 4。 陰性對照樣本和待測樣本均顯示紅色，但待測樣本顯色比陰性對照樣本明顯減弱。將實施例1制備的對照管代替酶管進(jìn)行步驟二的處理，得到對照溶液，將對照溶液代替酶溶液進(jìn)行步驟1至7的操作，待測樣本和陰性對照樣本的顏色一致，沒有顯著差已升。三、試劑盒的應(yīng)用(檢測殘其它殺蟲劑)1、樣本的制備將馬拉硫磷、敵敵畏、敵百蟲、巴沙、胺菊酯、溴氰菊酯和氯菊酯分別用無水乙醇配成1000 μ g/ml的母液，再取適量母液溶于蒸餾水，使其終濃度為0. 5 μ g/ml，作為各個待測樣本。將蒸餾水作為陰性對照樣本。2、試劑盒的應(yīng)用分別將各個待測樣本和陰性對照樣本進(jìn)行檢測，方法同步驟三的2。陰性對照樣本和待測樣本均顯示紅色，但待測樣本顯色比陰性對照樣本明顯減弱。將實施例1制備的對照管代替酶管進(jìn)行步驟二的處理，得到對照溶液，將對照溶液代替酶溶液進(jìn)行步驟1至7的操作，各個待測樣本和陰性對照樣本的顏色一致，沒有顯著差異。四、試劑盒的推薦使用方法應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測待測污水時，可采用如下操作步驟1、測試組取待測污水20ml (如有固體雜質(zhì)請先過濾)加到25ml容量瓶中；陰性對照組取20ml蒸餾水加到25ml容量瓶中；每個樣本建議設(shè)置兩個重復(fù)。2、測試組和陰性對照組的容量瓶中各加入100 μ 1甲苯，震蕩3分鐘，靜置分層，加入蒸餾水至管口(不定量，只是為了方便吸取上相液)，上相液即為IX樣品，IX樣品根據(jù)需要可用甲苯稀釋至10倍體積(10Χ樣品)、100倍體積(100Χ樣品)等。3、取10 μ 1樣品于一支0. 5ml離心管蓋子上晾干。4、向晾干的離心管蓋子上加入10 μ 1含溶液甲(將無水乙醇和試劑盒提供的緩沖液等體積混合)，吹打混勻。5、向離心管管底加入20μ 1酶溶液，稍許離心使溶液混勻并集中到管底，室溫靜置5分鐘。6、向離心管蓋子上加入20 μ 1底物溶液，稍許離心使溶液混勻并集中到管底，室溫靜置3分鐘。7、向離心管蓋子上加入20 μ 1顯色劑溶液，輕甩使之與管底溶液混合，觀察顯色情況。如果測試組比陰性對照組顏色明顯減弱，即可判定有殺蟲劑的存在。對于待測污水的1Χ、10Χ、100Χ……樣品，顯色比陰性對照組明顯減弱的，分別判定為< lyg/ml， < 10μ g/ml, < 100 μ g/ml......。
權(quán)利要求
1.確定待測水體中殺蟲劑的試劑盒，包括如下組分XB1蛋白、固蘭B鹽和β-乙酸萘酯；所述XBl蛋白為如下(a)或(b)或(c)(a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；所述確定待測水體中殺蟲劑為確定待測水體中是否含有殺蟲劑和/或確定待測水體中的殺蟲劑含量范圍。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由酶管、底物管、顯色劑管和 pH7. 050mM磷酸緩沖液組成；所述酶管中裝有所述XBl蛋白；所述底物管中裝有所述β-乙酸萘酯；所述顯色劑管中裝有所述固蘭B鹽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述pH7.050mM磷酸緩沖液是將磷酸氫二鈉Na2HPO4 · 12H20和磷酸二氫鈉NaH2PO4 · 2H20溶于水得到的。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑盒，其特征在于所述XBl蛋白的制備方法包括如下步驟(1)將序列表的序列2自5’末端第115至1725位核苷酸所示的DNA分子插入載體 pET28a的多克隆位點，得到重組表達(dá)載體；(2)將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌；(3)將所述重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到XBl蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述誘導(dǎo)表達(dá)的方法為在0D_= 0. 6的重組農(nóng)桿菌菌液中加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)16-1他。
6.如權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于所述方法還包括將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌進(jìn)行超聲破碎并離心取上清液的步驟；所述超聲破碎為參數(shù)優(yōu)選為超聲頻率14HZ、 間隔10秒進(jìn)行一次超聲處理、每次超聲處理的時間為5秒、超聲處理20次；所述離心的參數(shù)優(yōu)選為:4°C、12000g、15分鐘。
7.權(quán)利要求1至6中任一所述試劑盒在確定待測水體中殺蟲劑中的應(yīng)用；所述確定待測水體中殺蟲劑為確定待測水體中是否含有殺蟲劑和/或確定待測水體中的殺蟲劑含量范圍。
8.一種輔助確定待測水體中殺蟲劑的方法，包括如下步驟(1)將取自待測水體的樣本和蒸餾水樣本分別用甲苯進(jìn)行抽提，收集抽提液；(2)將抽提液中的甲苯揮發(fā)后，剩余物質(zhì)溶于乙醇水溶液；(3)在步驟⑵的溶液中加入XBl蛋白共孵育；所述XBl蛋白為如下(a)或(b)或(c) (a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；(4)在步驟(3)的溶液中加入β-乙酸萘酯共孵育；(5)將步驟(4)的溶液中加入固蘭B鹽，通過比較待測水體樣本和蒸餾水樣本的顏色輔助確定待測水體中殺蟲劑；所述確定待測水體中殺蟲劑為確定待測水體中是否含有殺蟲劑和/或確定待測水體中的殺蟲劑含量范圍。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述乙醇水溶液中乙醇的含量為50%(體積百分含量)。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中孵育時間為5分鐘； 所述步驟中共孵育的時間為3分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測水體中是否存在殺蟲劑及殺蟲劑含量范圍的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括如下組分XB1蛋白、固蘭B鹽、β-乙酸萘酯和pH7.050mM磷酸緩沖液；所述XB1蛋白為如下(a)或(b)(a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)來自斜紋夜蛾的XB1蛋白具有羧酸酯酶活性，可與天然底物β-乙酸萘酯反應(yīng)生成β-萘酚，經(jīng)固藍(lán)B鹽顯色而成紅色；而當(dāng)羧酸酯酶被有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類或擬除蟲菊酯類殺蟲劑抑制后，則失去或部分失去上述酶學(xué)反應(yīng)能力而紅色減弱，其減弱的程度和殺蟲劑種類和濃度成正比，可實現(xiàn)對水中殺蟲劑的快速檢測。
文檔編號C12N15/55GK102305790SQ20111013690
公開日2012年1月4日 申請日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者喬傳令, 蘭文升, 崔峰, 江紅 申請人:中國科學(xué)院動物研究所, 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心