專利名稱：一種增殖甲型流感病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物傳染病技術領域，具體涉及一種甲型HlNl流感病毒的分離鑒定及該病毒在MDCK細胞上的穩(wěn)定增殖的方法。
背景技術：
2009年3月墨西哥首次發(fā)現(xiàn)甲型HlNl流感病例，自此疫情開始在世界各地迅速蔓延，席卷全球。截止2009年8月6目，已有170多個國家報告病例177457例，造成1462人死亡；2009年8月14日我國報告確診2429例、2009年6月11日，世界衛(wèi)生組織(WHO)將該流感大流行警告級別提高至6級。我國衛(wèi)生部于2009年4月30日宣布將其納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并采用甲類傳染病的預防、控制措施，同時 將其納入《中華人民共和國國境衛(wèi)生檢疫法》規(guī)定的檢疫傳染病管理。2009年3月墨西哥此次疫情的病原為變異后的新型甲型HlNl流感病毒。各國流行的甲型HlNl流感病毒目前在氨基酸水平上是高度同源的，而在這次流感病毒的基因組內(nèi)存在四源重組，其中該病毒的PB2和PA基因源自禽流感HlNl病毒，PBl基因源自人季節(jié)性流感H3N2病毒，HA、NP和NS基因源自古典型豬流感HlNl病毒，NA及M基因源自歐亞系豬流感HlNl病毒(殷建華等，2009，第二軍醫(yī)大學學報，第30卷，第6期，637-640)。由于甲型HlNl流感病毒的5個主要基因片段與豬流感病毒同源性很高，豬是豬、禽、人流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”(顧春英等，2009，第二軍醫(yī)大學學報，第30卷，第6期，605-609)流感病毒新流行毒株“孵育器”。SI在人和動物流感的病原學、生態(tài)學及流行病學中占有舉足輕重的地位。因此，豬流感的影響不僅在于其顯而易見的獸醫(yī)傳染病學意義，更在于其深遠的公共衛(wèi)生學意義。豬流感(SI)是一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病，其臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭和死亡為特征。SI呈地方性流行，世界性分布，可發(fā)生于各年齡和各品種豬，發(fā)病率高達100%。SI在養(yǎng)豬場中普遍存在，難以根除。SI能引起病豬生產(chǎn)性能下降，肉料比降低，直接影響豬群健康狀態(tài)及質(zhì)量，對養(yǎng)豬業(yè)危害很大；更值得重視的是，豬流感病毒(SIV)感染豬后可導致胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、豬2型鏈球菌、豬呼吸道冠狀病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等的繼發(fā)或混合感染，使疫情變得復雜、病情加重，造成飼料、人工的巨大浪費及藥物的無謂消耗，死亡率增高，由此引起的經(jīng)濟損失更無法估量(李海燕等，2002，中國預防獸醫(yī)學報，第24卷，第I期，12-17)。SIV與其它病原體共感染或繼發(fā)感染所造成的損害，已成為制約豬場經(jīng)濟效益的主要原因之一。雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)進行流感病毒分離是流感病原檢測的金標準。雞胚是流感病毒最為常用的一種培養(yǎng)基質(zhì)，常用它來分離流感病毒和制備疫苗。但用雞胚尿囊液分離或傳代流感病毒易引起抗原變異；大規(guī)模生產(chǎn)時還存在雞胚數(shù)量不足和潛在外源病毒污染的問題。一哺乳動物細胞為基質(zhì)制備疫苗具有無外源因子污染、易于規(guī)?；a(chǎn)、能較好的維持病毒抗原穩(wěn)定性等優(yōu)點。鑒于此，本發(fā)明著手于利用細胞分離培養(yǎng)新型甲型HlNl流感病毒的，及新型甲型HlNl流感病毒在MDCK細胞上穩(wěn)定增殖。通過最佳感染劑量、最適TPCK胰酶濃度、最適培養(yǎng)液PH值等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定最佳的新型甲型HlNl流感病毒增殖培養(yǎng)方法，為建立甲型流感疫苗生產(chǎn)新體系奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服 現(xiàn)有技術缺陷，從發(fā)生呼吸道疾病的某豬場中分離到一株HlNl亞型新的流感病毒。本發(fā)明的第二個目的是在MDCK細胞上大量增殖HlNl亞型新的流感病毒，為后續(xù)開發(fā)奠定基礎。本發(fā)明從中國某地發(fā)生呼吸道疾病的某豬場中分離到一株HlNl亞型新的流感病毒，經(jīng)鑒定該病毒為A/swine/Nanchang/F9/2010 (HlNl)，簡稱甲型Hl亞型流感病毒。對該病毒本身包含的8個基因片段(Genbank登錄號為JF275925-JF275932)的全序列測定和遺傳進化分析表明，本發(fā)明分離的該甲型Hl亞型流感病毒的8個基因片段與2009年4月報道的甲型HlNl流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的基因同源性高達99%。為了滿足專利上的充分公開，申請人將上述分離得到的甲型Hl亞型流感病毒A-influ JML-F9，于2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC N0:V201105。將上述甲型Hl亞型流感病毒在MDCK細胞上進行增殖培養(yǎng)，確定了其增殖培養(yǎng)的相關條件和方法，結果表明，本發(fā)明甲型Hl亞型流感病毒增殖的血凝效價平均達到71og2，最聞達到91og2。申請人:提供了一種甲型流感病毒的增殖方法，其步驟如下所述I)將疑似豬流感感染的氣管拭子樣品接種含有2 μ g/mL的TPCK-胰酶的細胞維持液分離病毒；2)對步驟I)判定的血凝陽性樣品用Hl亞型豬流感的通用引物M684和甲型Hl流感的通用引物H1-292進行RT-PCR擴增，進行流感病毒亞型鑒定，其步驟如下反轉錄用的引物Unil2的核苷酸序列(單鏈)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’ ；流感病毒cDNA的合成步驟如下在20 μ L反轉錄體系中進行，依次加入以下組分
AMV Reverse Transcriptase XL (50U/pL ) I .Ομ RNase inhibitor(40U/pL )0.5pL
5xRNA PCR Buffer4.0μ
Uni 12 prime(10pmol)r1.5pL
dNTPs (I Ommol)2\xL
RNA 模板Ι μ 將上述組分混勻后置PCR儀上于42°C下60min，95°C 5min進行反轉錄，反應產(chǎn)物直接用于PCR或4°C保存?zhèn)溆?；M-684和H1-292弓丨物核苷酸序列M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC ； M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA,擴增得到的片段大小為 684bp ；
H 1-292U CATTAATGATAAAGG ；H1-292L :TCCAGCATTTCTTTC，擴增得到的片段大小為 292bp ；PCR反應體系在25 μ L反應體系中進行，依次加入以下組分
Trans-Taq 聚合酶(2 U)0·5μ
IOxBuifer2.5pL
dNTP (2mmol)2μ
正向引物Ιμ
反向引物
cDNA3 μι
ddH2016μ PCR反應參數(shù)M684 95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；Hl-292 95°C 5min ；94°C 30s, 42. 5°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18-T載體，選取陽性病料克隆M684和H1-292測序，判定是否為甲型Hl流感；3)對甲型Hl流感病毒進行全基因組測序，其步驟如下以步驟2)所述的cDNA為模板，擴增甲型Hl流感病毒8個基因，即PB2，PBl，PA，HA, NP, NA，M和NS，擴增上述8個基因的特異引物的核苷酸序列如下擴增PB2基因P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；擴增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，，P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3’ ；擴增PA基因 P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，，P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3’ ；擴增HA基因P15，AGCAAAAGCAGGGG 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3，；擴增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ；擴增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25， AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3，；
擴增M基因P15 ’ AGCAAAAGCAGGTAG 3 ’，P25， AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ；擴增NS基因P15，GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ；按步驟2)的方法提取甲型Hl流感病毒RNA，合成甲型Hl流感病毒cDNA ；甲型Hl流感病毒cDNA的PCR擴增
在PCR反應管中加入反轉錄產(chǎn)物2.0 μ L，LA Taq DNA聚合酶(5U/μ L) O. 5 μ L，10XLA Taq DNA Buffer5 μ L, dNTPsMixture (各 2mM) 2· O μ L，各基因的正向引物和反向引物各2. O μ L，用ddH20調(diào)終體積至50 μ L，混勻后于PCR儀上進行擴增；PCR擴增程序預變性95 V 5min,變性94 V 30sec,退火52 °C 30sec,延伸72°C 4min，運行35個循環(huán)后于72°C延伸lOmin。對PCR產(chǎn)物進行回收，連接pMD18_T載體，轉化后進行菌液PCR鑒定，將判定為陽性的樣品進行測序；4)將甲型Hl亞型流感病毒10—1 10_3稀釋接種12孔板的MDCK細胞，棄去細胞生長液，換上細胞維持液；5)將甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋接種12孔板的MDCK細胞，在細胞維持液分別加入終濃度為O 4 μ g/mL的TPCK胰酶；6)將甲型Hl亞型流感病毒10_3稀釋，加入TPCK胰酶使終濃度為2μ g/mL，接種于12孔板的MDCK細胞，然后分別加入pH值為7. O 8. O的細胞維持液，觀察細胞病變；7)將甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋，加入TPCK胰酶使終濃度為2 μ g/mL ;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為160cm2的SOOmL的細胞瓶進行病毒增殖；8)將甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋，加入TPCK胰酶使終濃度為2 μ g/mL;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為2350cm2的IOL的轉瓶進行病毒增殖；其中步驟I)和4)所述的細胞維持液配方如下取商購的DMEM粉劑(購自武漢佰歐樂基生物科技有限公司)一小包，再取HEPES，F(xiàn)REEACID 4. Hg, NaHC037. 4g，溶于ddH20中，待完全溶解后用ddH20定容至1L，再用2M的NaOH調(diào)溶液的pH至7. 4，無菌過濾后儲存于4°C條件下備用；其中步驟4)所述的細胞生長液配方如下在細胞維持液中加入按V/V計10%的滅活新生牛血清；其中步驟5)所述的細胞維持液的配方如下將TPCK胰酶粉劑配制成100 μ g/mL的母液，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾備用；其中終濃度為O μ g/mL TPCK濃度的維持液=IOOmL維持液中不加入TPCK胰酶母液；終濃度為O. 5 μ g/mL TPCK濃度的維持液100mL維持液中加入50 μ L的TPCK胰酶母液；終濃度為I μ g/mL TPCK濃度的維持液IOOmL維持液中加入100 μ L的TPCK胰酶母液；終濃度為2 μ g/mL TPCK濃度的維持液IOOmL維持液中加入200 μ L的TPCK胰酶母液；終濃度為4 μ g/mL TPCK濃度的維持液IOOmL維持液中加入400 μ L的TPCK胰酶母液；其中步驟5)所述的細胞維持液的配比如下pH值為7. O的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 0，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾備用；pH值為7. 2的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 2，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾備用；pH值為7. 4的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 4，用孔徑為 O. 22 μ m的濾膜過濾備用；pH值為7. 6的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 6，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾備用；pH值為7. 8的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 8，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾備用；pH值為8. O的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至8. 0，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾備用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點用細胞系代替雞胚組織培養(yǎng)制造流感病毒，可解決雞胚自身及所受外源病毒污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴格控制，保證生產(chǎn)出來的病毒的純凈性。本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，不會受制于原料供應，而且生產(chǎn)周期短，每個生產(chǎn)周期僅需4天，相比雞胚培養(yǎng)法的13天以上大大縮短。應用轉瓶進行病毒增殖，具有生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定，易操作、產(chǎn)量大占用地小、無需反復照胚，易于快速擴大生產(chǎn)規(guī)模。質(zhì)量易于實現(xiàn)均衡穩(wěn)定。應用本方法生產(chǎn)的的病毒液，環(huán)境污染少且易于處理。而現(xiàn)有的雞胚生產(chǎn)法會產(chǎn)生的大量廢胚等廢物，且處理難度大，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。本發(fā)明的實施案例中，申請人提供了這種新型甲型HlNl流感病毒的分離培養(yǎng)方法，及全基因組測序過程。并描述了該毒株在MDCK細胞上各種條件的優(yōu)化過程。更詳細的技術方案如《具體實施方式
》所述。


SEQIDNO 1是擴增的HA基因片段，序列長度為1780bp。SEQIDNO 2是擴增的M基因片段，序列長度為1028bp。SEQIDNO 3是擴增的NA基因片段，序列長度為1459bp。SEQIDNO 4是擴增的NP基因片段，序列長度為1566bp。SEQIDNO 5是擴增的NS基因片段，序列長度為890bp。SEQIDNO 6是擴增的PA基因片段，序列長度為2234bp。SEQIDNO 7是擴增的PBl基因片段，序列長度為2342bp。SEQIDNO 8是擴增的PB2基因片段，序列長度為2341bp。圖I:是甲型Hl亞型流感病毒接種MDCK細胞后，使細胞聚集，部分脫落，并出現(xiàn)拉網(wǎng)的現(xiàn)象(見圖Ib :出現(xiàn)病變細胞，且不整齊)和一個未接種前述病毒的MDCK細胞對照(見圖la，細胞正常)。圖2 :是本發(fā)明通過中國動物衛(wèi)生與流行病學中心公布的M684(H1亞型豬流感的通用引物)和Hl-292(新型甲型Hl流感的通用引物)為引物，進行流感病毒亞型鑒定的結
果O圖3 :是本發(fā)明通過RT-PCR擴增甲型Hl亞型流感病毒的8個基因片段，O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道 2-9 分別為 PB22341bp，PB12342bp，PA 2234bp, HA 1780bp, NP1566bp, NA 1459bp, M 1028bp, NS 890bp。圖4 :甲型Hl亞型流感病毒HA、NA基因遺傳進化樹。圖4a HA基因；圖4b NA基因。
具體實施方式
實施例I :新型甲型HlNl流感病毒的分離鑒定樣品的采集采集中國江西省某豬場疑似豬流感感染的病豬的氣管棉拭子，將采樣后的棉拭子置于含100U/mL的青、鏈霉素滅菌生理鹽水中。采集樣本立即置2 8°C保存，并在24h內(nèi)送檢，長期保存放_70°C。病毒分離與鑒定80%成片細胞的準備，用40倍鏡觀察細胞生長狀態(tài)，選擇處于對數(shù)生長期的MDCK細胞，輕輕倒出細胞生長液，用滅菌生理鹽水分別清洗細胞2次，以清除細胞表面的新生牛血清。加入含有2 μ g/mL的TPCK-胰酶的細胞維持液。細胞培養(yǎng)孔的接種，標本在送檢后的24h內(nèi)用MDCK細胞進行病毒分離。用無菌帶濾膜的槍頭吸取200 μ I的臨床樣品置于細胞培養(yǎng)孔中，放置于37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察細胞病變情況。(細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或破裂，嚴重時細胞部分或全部脫落。)在24h內(nèi)出現(xiàn)的CPE很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。取100 μ I陽性分離物傳2代，繼續(xù)觀察。細胞培養(yǎng)物的收獲，當75%以上的細胞發(fā)生病變時進行收獲，沒有細胞病變的于第7天收獲并進行盲傳，收獲之前將細胞凍融2次。用I %的雞紅細胞進行初步的鑒定。血凝陽性培養(yǎng)液進行RT-PCR鑒定，RNA的提取參照Invitrogen公司Trizol試劑說明書進行，以流感反轉通用引物U12合成cDNA后，可以通過中國動物衛(wèi)生與流行病學中心公布的Μ684(Η1亞型豬流感的通用引物)和Hl-292(甲型Hl流感的通用引物)為引物，進行流感病毒亞型鑒定。血凝試驗(HA)在96孔V型反應板上，每孔加入25 μ I O. OlM pH7. 2PBS，吸取25 μ I待檢病毒液于第I孔內(nèi)，充分混均后吸25 μ I于第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，棄去25 μ I ;第12孔作為O. OlM pH7. 2PBS對照孔。然后每孔加入I %雞紅細胞懸液25 μ 1，在微量振蕩器上搖勻，室溫靜置30min后觀察結果。在O. OlM pH7. 2PBS對照孔不發(fā)生紅細胞凝集的條件下，即可進行對試驗組的結果判讀。待檢病毒的血凝價為紅細胞發(fā)生100%凝集的最高病毒稀釋倍數(shù)。
++++ :凝集的紅細胞呈薄膜狀均勻覆蓋孔底，強烈凝集時則皺縮成團；+++ :凝集的紅細胞比較均勻覆蓋孔底，有非常少紅細胞沉降；++:凝集的紅細胞覆蓋孔底,但中央有少量紅細胞沉降成小圓點；+ :紅細胞沉于孔底中央，但周圍仍有散在的紅細胞凝集；-:紅細胞全部沉于孔底中央，周圍無散在的紅細胞凝集。病毒RNA的提取I)在I. 5mL的印pendorf管中加入反復凍融的病毒培養(yǎng)物500ul，再加入TRIzolLS 500ul，充分混勻，室溫放置lOmin。2)加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管(溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象)，室溫放置IOmin (由于氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時離心管可能爆開，小心)。3)離心4°C、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管(切忌吸動白色中間相)。4)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置lOmin。5)離心4°C、13000r/min、15min,用槍小心吸去所有上清。6) ImL 75%乙醇洗一遍,離心4°C、8000r/min、lOmin,用槍小心吸去所有上清,在超凈臺中干燥5min。7)加入適量25ul DEPC處理水。立即做RT。病毒cDNA的合成
在20 μ L反轉錄體系中進行，依次加入以下組分
AMV Reverse Transcriptase XL (50U/pL ) I _0pL RNase inhibitor(40U/pL )0.5μ￡
5xRNA PCR Buffer4.0μ
Uni 12 prime(10pmol)rΙ·5μΙ>
dNTPs (I Ommol)2\\L
RNA 模板IlpL混勻后置PCR儀42°C 60min,95°C 5min進行反轉錄，反應產(chǎn)物直接用于PCR或4°C保存?zhèn)溆?。M-684和H1-292弓丨物序列上游引物M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC下游引物M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA 預期片段大小為 684bp上游引物H1-292U CATTAATGATAAAGG下游引物H1-292L TCCAGCATTTCTTTC預期片段大小為292bpPCR反應體系在25 μ L反應體系中進行，依次加入以下組分Trans-Taq 聚合酶(2 U) 0.5 μ L IOXBuffer2.5 μ L
dNTP (2mmol)2uL
上游引物IuL
下游引物IwL
cDNA3 μ L
ddH2016 U LPCR 反應參數(shù)95 °C 5min ；94°C 30s，55°C 30s (Hl-292 退火溫度42. 5 °C 30s)，72°C lmin，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18_T載體，選取陽性病 料克隆M684和(或)H1-292送上海生工生物工程有限公司測序，以進一步鑒定。PCR產(chǎn)物回收采用上海生工生物工程技術有限公司的UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照UNIQ-IO柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒的說明書的步驟進行，具體操作如下I)用O. 8%的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，在長波紫外燈下，用在酒精燈火焰上燒過的手術刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入I. 5mL滅菌
離心管中。2)按每 IOOmg 瓊脂糖膠加入 400 μ L Binding Buffer,置 50_60°C水浴中 lOmin,使瓊脂糖凝膠徹底融化(加熱溶膠時，每2min混勻一次)。3)將UNIQ-IO柱放入收集管中，將融化的膠溶液轉移到UNIQ-IO柱中，室溫靜置2min,室溫 8000rpm 離心 lmin。4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一個收集管中，力口A 500 μ L WashSolution,室溫 8000rpm 離心 lmin。5)重復步驟4，取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一個收集管中，室溫12000rpm離心15sec。6)將UNIQ-IO柱放入一個滅菌的I. 5mL離心管中，根據(jù)PCR產(chǎn)物量的相對多少，在柱子底部的膜中央加10-20 μ L Elution Buffer或ddH20，室溫或37°C放置2min室溫12000rpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于_20°C備用。PCR產(chǎn)物的克隆用TaKaRa公司的PCR產(chǎn)物克隆試劑盒進行，取4μ L PCR回收產(chǎn)物(經(jīng)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定過有目的片段存在)，1μ L載體DNA(PMDlS-T)JyL Ligation SlutionI，16 °C反應過夜。連接pMD18-T 載體連接產(chǎn)物的轉化取感受態(tài)細胞DH5a 100μ I加入到I. 5mL EP管中，將連接后的以pMD18_T為載體的重組質(zhì)粒10 μ I加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90sec，冰浴3min_5min。加Λ 400 μ I LB,于37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)45min使其復蘇。復蘇后的重組大腸桿菌懸液于40C 5000rpm離心lOmin，棄去400 μ I上清，用剩余的100 μ I重懸沉淀涂布于含有25 μ g/mL Amp的LB瓊脂平板。37°C增殖lh，再將平板翻過來，倒置37°C培養(yǎng)14h_16h至菌落出現(xiàn)。分別挑取5個單菌落用H1-292的引物進行PCR鑒定，鑒定的陽性結果可以送上海生工生物工程有限公司進行測序。結果分析江西省的拭子樣品接種MDCK細胞后第一代就觀察到明顯的細胞病變，細胞間隙增寬，拉成網(wǎng)狀，并有部分細胞脫落。(如圖1，圖Ia為正常的MDCK細胞，圖Ib為接毒后的MDCK細胞。)進行血凝檢測HA效價達到23，進行第二次傳代HA效價達到26。對第二次傳代的樣品進行RT-PCR鑒定，M684(如圖2a)和Hl_292(如圖2b)均擴增出陽性目的條帶。對PCR產(chǎn)物進行回收，連接pMD18-T載體，轉化后進行菌液PCR鑒定，陽性樣品送上海生工生物工程有限公司進行測序。結果顯示甲型Hl亞型流感病毒同A/California/04/2009 (HlNl)有99%的同源性。說明中國豬群中已經(jīng)存在新型北美流行株豬流感病毒。實施例2 :新型甲型HlNl流感病毒的全基因組測序
對甲型Hl流感病毒進行全基因組測序，其步驟如下以步驟2)所述的cDNA為模板，擴增甲型Hl流感病毒8個基因序列全長，即HA，M，NA，NP, NS, PA，PBl和PB2，和擴增得到如序列表SEQ ID NO :1_8所示的核苷酸序列(其序列如(Genbank登錄號為JF275925-JF275932相對應))，擴增上述8個基因的特異引物的核苷酸序列如下所示擴增HA基因P15，AGCAAAAGCAGGGG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’ ；擴增M基因P15，AGCAAAAGCAGGTAG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ；擴增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25’ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’ ；擴增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ；擴增NS基因P15，GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3，；擴增PA基因P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，，P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3，；擴增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，，P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3，；擴增PB2基因
P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；甲型Hl流感病毒RNA的提取，其病毒的cDNA的合成，同實施案例I所述。甲型Hl流感病毒cDNA的PCR擴增在PCR反應管中加入反轉錄產(chǎn)物2. Oii L，LA Taq DNA聚合酶(5U/ii L) 0. 5 ii L，10XLA Taq DNA Buffer5 u L, dNTPs Mixture (各 2mM) 2. 0 y L，各基因的上下游引物各2. OuL,最后用ddH20將終體積調(diào)至50 u L，混勻后于PCR儀上進行擴增。PCR擴增程序為預變性95°C 5min，變性94°C 30sec，退火52°C 30sec，延伸72°C 4min，運行35個循環(huán)后于72°C延伸lOmin。同時設未加模板的陰性對照。反應結束后，PCR產(chǎn)物各取5 y L，在0. 8%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，剩余置4°C保存?zhèn)溆?。對PCR產(chǎn)物進行回收，連接PMD18-T載體，轉化后進行菌液PCR鑒定，陽性樣品送 上海生工生物工程有限公司進行測序。同實施案例I。將測得的HA和NA基因序列經(jīng)過DNAStar軟件包中的SeqMan校對正確后，經(jīng)Blast比較，從Genbank選取具有代表性毒株以及核苷酸同源性高的毒株序列，應用ClustalX繪制HA和NA的系統(tǒng)進化樹和進行遺傳分析。因為HA和NA蛋白是穿過雙層脂膜突出在病毒表面，形成流感病毒的主要抗原，在誘導宿主動物的抗體反應中具有非常重要的作用。HA、NA 二者在免疫壓力下保持高度的變異性，而NP、M等內(nèi)部蛋白則具有較強的保守性。結果分析本實施例成功擴增了甲型Hl亞型流感病毒的8個基因片段，8個片段的0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳圖(如圖3，泳道2-9分別為PB22341bp, PB12341bp, PA 2233bp, HA1778bp, NP 1556bp, NA 1413bp, M 1027bp, NS 890bp)所示。從系統(tǒng)進化樹可知，從豬病料中分離的甲型Hl亞型流感病毒的HA(如圖4a)和NA (如圖4b)基因同A/California/04/2009 (HlNl)處于同一進化分支；HA基因與中國報道的A/swine/Guangxi/13/2006 (H1N2)進化關系較近，NA基因同A/swine/Zhejiang/1/2007 (HlNl)進化關系較近，與 A/swine/Tianjin/01/04 (HlNl)、A/swine/Henan/01/06 (HlNl)處于不同進化分支。實施案例3不同感染劑量對甲型Hl亞型流感病毒在MDCK細胞中增殖的影響I)在12孔板中進行不同感染劑量的甲型Hl亞型流感病毒在MDCK細胞中的增殖試驗，取長滿MDCK細胞的12孔板(每孔直徑2. 2cm，表面積為3. 8cm2)，細胞密度約為2 X IO5個/cm2，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗3次，以除去殘留的培養(yǎng)基。甲型Hl亞型流感病毒粒子濃度約為 I X 107PFU/mLo 按病毒感染復數(shù)(Multiplication of Infection, MOI)MOI =(0. 3,0. 03,0. 003)分別接種MDCK細胞，相當于HA效價為81og2病毒原液稀釋到10-1，10_2，10_3每孔250 u L，每個劑量接3個孔，在CO2培養(yǎng)箱中37°C條件下吸附I. 5h，棄去病毒液，加入維持液(含2 ii g/mL的TPCK胰酶，不含血清的DMEM培養(yǎng)基，加入青霉素終濃度IO2IU/ml、鏈霉素終濃度IO2il g/mL) ImL,同時留I孔不接毒只換維持液做空白對照。觀察接毒后細胞病變情況，在接毒后每12h收取12孔板中每個孔的細胞培養(yǎng)上清60 u L，放在4°C冰箱保存。直至接毒孔的細胞全部脫落為止。按照(同實施例I中血凝試驗)檢測各時間段細胞培養(yǎng)上消的血凝價。結果分析
接種不同MOI病毒對病毒HA效價的影響，當接種病毒的MOI為0. 3，0. 03，0. 003時，相當于HA效價為81og2病毒原液稀釋到10—1，10_2，10_3，在MDCK細胞中均可大量增殖病毒，HA效價最高值可達29。當MOI = 0. 3時，病毒HA效價最高只能達到27，而在MOI =0. 03 (HA效價為81og2病毒原液稀釋到10_2)和MOI = 0. 003 (HA效價為81og2病毒原液稀釋到10_3)時，HA效價最高值均可達29。而且MOI = 0. 003 (HA效價為81og2病毒原液稀釋到10_3)時細胞上清保持HA效價為29的時間較長，因此選擇MOI = 0. 003 (HA效價為81og2病毒原液稀釋到10_3)作為之后試驗的病毒感染劑量，相當于病毒原液稀釋成10_3進行接種。表I接種不同MOI病毒后病毒HA滴度(Iog2)
權利要求
1.一種增殖甲型流感病毒的方法，其步驟包括 1)將疑似豬流感感染的氣管拭子樣品接種含有2ii g/mL的TPCK-胰酶的細胞維持液分離病毒并進行判定； 2)對步驟I)判定的血凝陽性樣品用Hl亞型豬流感的通用引物M684和甲型Hl流感的通用引物H1-292進行RT-PCR擴增，進行流感病毒亞型鑒定，其步驟如下 反轉錄用的引物Unil2 :其核苷酸序列(單鏈)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’ ； 流感病毒cDNA合成 在20ii L反轉錄體系中進行，依次加入以下組分 AMV Reverse Transcriptase XL (50U/|iL ) I .O^iLRNase inhibitor(40U/|iL )0.5|iL5xRNA PCR Buffer4.0|aLUni12 prime(10pmol)r1.5[iLdNTPs (I Ommol)2juLRNA 模板IlpL 將上述組分混勻后置PCR儀中，42°C 60min,95°C 5min進行反轉錄，反應產(chǎn)物直接用于PCR反應；其中PCR反應的引物序列如下M-684 和 H1-292M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC ； M-684L :AAGACGATCAAGAATCCACAA，擴增得到的片段長度為 684bp ；H1-292U CATTAATGATAAAGG ； H1-292L :TCCAGCATTTCTTTC，擴增得到的片段長度為292bp ； PCR反應體系 在25 y L反應體系中進行，依次加入以下組分Trans-Taq 聚合酶(2 U) 0.5^iLIOxBuffer2.5(iLdNTP (2mmol)2|xL上游引物IHL下游引物IpLcDNA3 ^iLddH2016^L PCR反應參數(shù) M684 95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；Hl-292 95°C 5min ；94°C 30s, 42. 5°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ； 將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18-T載體，選取陽性病料克隆M684和H1-292測序，判定是否為甲型Hl流感病毒； 3)對甲型Hl流感病毒進行全基因組測序，其步驟如下 以步驟2)所述的cDNA為模板，擴增甲型Hl流感病毒8個基因HA，M，NA, NP, NS, PA，PBl和PB2，得到如序列表SEQ ID NO :1_8所示的核苷酸序列，其中擴增上述8個基因的特異引物的核苷酸序列如下所示 擴增HA基因 P15，AGCAAAAGCAGGGG 3'P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ； 擴增M基因P15，AGCAAAAGCAGGTAG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ； 擴增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25’ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’ ； 擴增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ； 擴增NS基因P15， GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ； 擴增PA基因P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，， P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3，； 擴增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，， P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3，； 擴增PB2基因P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；按步驟2)的方法提取甲型Hl流感病毒RNA，合成甲型Hl流感病毒cDNA ； 甲型Hl流感病毒cDNA的PCR擴增 在PCR反應管中加入反轉錄產(chǎn)物2. Oii L，LA TaqDNA聚合酶(5U/u L) 0. 5 u L, 10 X LATaq DNA Buffer5 u L, dNTPs Mixture (各2mM) 2. 0 y L，上述8個基因的正向引物和反向引物各2. 0 ii L，用ddH20調(diào)終體積至50 u L，混勻后于PCR儀上進行擴增； PCR 擴增程序預變性 95 0C 5min，變性 94°C 30sec，退火 52 °C 30sec，延伸 72 °C 4min，運行35個循環(huán)后于72°C延伸lOmin。對PCR產(chǎn)物進行回收，連接pMD18_T載體，轉化后進行菌液PCR鑒定，將判定為陽性的樣品進行測序； 4)將HA效價為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10—1 10_3稀釋，接種12孔板的MDCK細胞，棄去細胞生長液，換上細胞維持液； 5)將HA效價為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋，接種12孔板的MDCK細胞，在細胞維持液分別加入終濃度為O 4 ii g/mL的TPCK胰酶；6)將HA效價為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋，加入TPCK胰酶使終濃度為2 U g/mL,接種于12孔板的MDCK細胞，然后分別加入pH為7. O 8. O的細胞維持液，觀察細胞病變； 7)將HA效價為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋，加入TPCK胰酶使終濃度為2 u g/mL ;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為160cm2的800mL的細胞瓶進行甲型Hl亞型病毒增殖；8)將HA效價為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋，加入TPCK胰酶使終濃度為2 u g/mL ;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為2350cm2的IOL的轉瓶進行甲型Hl亞型病毒增殖； 其中步驟I)和4)所述的細胞維持液配方如下 先取 DMEM 粉劑一小包，再取 HEPES，F(xiàn)REE ACID 4. 77g，NaHC037. 4g，溶于 ddH20 中，待完全溶解后再用ddH20定容至1L，最后用2M的NaOH調(diào)溶液的pH至7. 4，無菌過濾后儲存于4°C條件下備用； 其中步驟4)所述的細胞生長液配方如下 在細胞維持液中按V/V計加入10%的滅活新生牛血清。
2.適用于權利要求I所述方法的專用菌株，其特征在于，所述的專用菌株是甲型Hl亞型流感病毒A-influJML-F9，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCCNO V201105o
全文摘要
本發(fā)明屬于動物傳染病技術領域，具體涉及一種甲型H1流感病毒的分離鑒定及該病毒在MDCK細胞上穩(wěn)定增殖的方法。本發(fā)明通過分離鑒定得到一株甲型H1流感病毒A-Influ/JML-F9，其保藏編號為CCTCC NOV201105。通過優(yōu)選方法、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件將該甲型H1流感病毒在MDCK細胞上的穩(wěn)定增殖，大規(guī)模增殖該病毒的平均血凝效價達到7log2，其最高血凝效價達到9log2。
文檔編號C12R1/93GK102796708SQ20111013724
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權日2011年5月25日
發(fā)明者金梅林, 楊影, 陳煥春, 徐高原, 李國紅, 郭學波, 張安定, 周紅波, 陳章表 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學, 武漢科前動物生物制品有限責任公司