專利名稱：以稻谷加工副產(chǎn)物為原料生產(chǎn)飼用葡萄糖氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種飼用葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用稻谷加工副產(chǎn)物節(jié)碎米、米糠，通過(guò)固體發(fā)酵生產(chǎn)飼用葡萄糖氧化酶的方法。
背景技術(shù)：
目前，飼用葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)采用液體深層發(fā)酵法，該方法在具體應(yīng)用中存在許多不足，例如，發(fā)酵設(shè)備成本高，液體深層發(fā)酵需要專業(yè)的發(fā)酵設(shè)備，如發(fā)酵罐等，一個(gè)30噸的發(fā)酵罐造價(jià)達(dá)100萬(wàn)；發(fā)酵過(guò)程能耗高，需要不斷攪拌；對(duì)發(fā)酵工作人員技術(shù)素質(zhì)要求較高；三廢(廢水，廢渣，廢氣)對(duì)環(huán)境污染較重等(微生物學(xué)雜志2009，1 (29)p86-89 ；食品與發(fā)酵工業(yè)2003，29 (6) ρ 87-91)。飼用葡萄糖氧化酶的液體發(fā)酵法生產(chǎn)還有一個(gè)顯著缺點(diǎn)發(fā)酵過(guò)程所用原料主要是優(yōu)質(zhì)綿白糖，原料成本高(《飼料與畜牧;^〉2008 (7)p37-39)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，克服目前所采用生產(chǎn)技術(shù)的上述缺點(diǎn)，提供一種原料來(lái)源廣、設(shè)備成本低，工藝簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無(wú)污染的飼用葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種飼用葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)方法， 包括以下步驟
⑴將高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的點(diǎn)青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的10 cm微生物培養(yǎng)皿，25 30 °C培養(yǎng)36 48 h ；
所述馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過(guò)濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補(bǔ)蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；
⑵種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基經(jīng)115 121 °C滅菌2(T30 min后，將步驟(1)培養(yǎng)皿中活化的點(diǎn)青霉轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，接種量為一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種50(T1000 ml液體種子培養(yǎng)基；接種后于25 3(TC培養(yǎng)6(T72 h ；
所述液體種子培養(yǎng)基配方廣6wt%綿白糖，0. 05 0. 2wt% KH2PO4, 0. 05 0. 2wt%NaCl, 0. ΟΓΟ. 06wt%MgS04 ‘ 7H20, 0. Γθ. 4wt% NaNO3 :0. ΟΟΓΟ. 025wt% FeCl3, 0· 05 0· 2wt % CaCl2，余為水，pH自然，115°C滅菌20 min備用；
⑶固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將節(jié)碎米與米糠按10: Γ3的重量比混合，9(T10(TC蒸煮 25 40 min ；
⑷接種培養(yǎng)固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤涼后，接種步驟(2)得到的點(diǎn)青霉種子，接種量為 500^1000 ml種子培養(yǎng)液接種500 kg培養(yǎng)基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，直至點(diǎn)青霉孢子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入發(fā)酵床，25 30 °C，加濕通風(fēng)條件下培養(yǎng)48飛0 h； ( 固體發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于100 120 °C干燥2 4 h，粉碎至40 80目，即成。本發(fā)明采用廉價(jià)的稻谷加工副產(chǎn)物節(jié)碎米、米糠為底物，采用固體發(fā)酵技術(shù)，無(wú)需發(fā)酵罐等特殊設(shè)備，無(wú)后提取等復(fù)雜工藝，無(wú)“三廢”產(chǎn)生，對(duì)無(wú)環(huán)境無(wú)污染，工藝簡(jiǎn)單，易操作，降低了葡萄糖氧化酶的原料成本、設(shè)備成本和生產(chǎn)過(guò)程成本，原料來(lái)源廣，能實(shí)現(xiàn)稻谷加工副產(chǎn)物的高值化利用；既適合農(nóng)村小作坊發(fā)酵，也適合工業(yè)化大生產(chǎn)。產(chǎn)品葡萄糖氧化酶活力高，酶活性高達(dá)200 U;10(Tl20 °C高溫下干燥2 h，酶活損失小于5%。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1
⑴將高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的點(diǎn)青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的10 cm微生物培養(yǎng)皿，28 °C培養(yǎng)40 h ；
所述馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過(guò)濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補(bǔ)蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；
⑵種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基配方5wt %優(yōu)質(zhì)綿白糖，0.1 wt% KH2P04, 0.1 wt% NaCl，0. 02wt% MgS04 · 7H20, 0. 2 wt% NaN03 :0.0015wt % FeCl3，0. 1 wt% CaCl2，蒸餾水配制，PH自然)，經(jīng)115 °C滅菌20 min后，將培養(yǎng)皿中活化的點(diǎn)青霉轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，接種量為一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種500 ml液體種子培養(yǎng)基；接種后于培養(yǎng)至大量形成孢子；
⑶固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將節(jié)碎米與米糠按10: 1的比例混合，100°C蒸煮30 min ； ⑷接種培養(yǎng)固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤涼后，接種點(diǎn)青霉種子，接種量為500 ml種子培養(yǎng)液接種500 kg培養(yǎng)基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，當(dāng)溫度上升到45°C 時(shí)，倒出培養(yǎng)基，攪拌冷卻，再裝入原竹筐中，直至培養(yǎng)基表面出現(xiàn)淡綠色的霉點(diǎn)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵床，28 °C，加濕通風(fēng)條件下培養(yǎng)60 h ；
⑶固體發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于115 °C干燥2 h。粉碎至80目，即成。采用下述葡萄糖氧化酶活力測(cè)定方法對(duì)各實(shí)施例產(chǎn)品的酶活力進(jìn)行檢測(cè)
2.5 ml鄰聯(lián)茴香胺緩沖液(0. 1 g鄰聯(lián)茴香胺，溶于10 ml pH6. 0磷酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)前取0.1 ml鄰聯(lián)茴香胺溶液，加入到12 ml緩沖液中使用)，加入0.3 ml 18%葡萄糖溶液(稱取D-無(wú)水葡萄糖18g，溶于IOOml蒸餾水中)，加入0. 1 ml 0. 03%過(guò)氧化物酶溶液(稱取辣根過(guò)氧化物酶10 mg溶于30 ml蒸餾水)，25°C保溫3 min加入稀釋好的酶液讀出OD46tl在1 min的變化值。1個(gè)單位的葡萄糖氧化酶的活性(1 U)定義為在25°C，pH 6.0的測(cè)定條件下葡萄糖氧化酶催化葡萄糖每分鐘生成ι μ mol H2O2的酶量為一個(gè)單位。經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例產(chǎn)品的酶活力為203 U。實(shí)施例2
⑴將高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的點(diǎn)青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)的10 cm微生物培養(yǎng)皿，30 °C培養(yǎng)36 h ；
所述馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過(guò)濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補(bǔ)蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；
⑵種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基配方10 wt%優(yōu)質(zhì)綿白糖，0. 15wt% KH2P04, 0. 15wt% NaCl, 0. 03 wt% MgS04 · 7H20, 0. 3wt% NaN03 :0. 003wt% FeC13, 0. 15wt% CaCl2,余為水，pH自然，經(jīng)115 °C滅菌30 min后，將培養(yǎng)皿中活化的點(diǎn)青霉轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，接種量為一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種1000 ml液體種子培養(yǎng)基；接種后于30°C培養(yǎng)至大量形成孢子；
⑶固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制節(jié)碎米、米糠按10: 3的比例混合，100°C蒸煮40 min ；⑷接種培養(yǎng)固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤涼后，接種點(diǎn)青霉種子，接種量為600 ml種子培養(yǎng)液接種500 kg培養(yǎng)基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，當(dāng)溫度上升到45°C 左右時(shí)，倒出培養(yǎng)基，攪拌冷卻，再裝入原竹筐中，直至培養(yǎng)基表面出現(xiàn)淡綠色的霉點(diǎn)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵床，30 °C，加濕通風(fēng)條件下培養(yǎng)50 h；
( 固體發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于120 °C干燥3 h。粉碎至80目即成。經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例產(chǎn)品的酶活力為221 U。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，均仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種飼用葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的點(diǎn)青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基的10cm微生物培養(yǎng)皿，25 30 °C培養(yǎng)36 48 h ；所述馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過(guò)濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補(bǔ)蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；(2)種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基經(jīng)115 121 °C滅菌20 30 min后，將步驟(1)培養(yǎng)皿中活化的點(diǎn)青霉轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，接種量為一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種500 1000 ml 液體種子培養(yǎng)基；接種后于25 30°C培養(yǎng)60 72 h ；所述液體種子培養(yǎng)基配制1 6wt%綿白糖，0. 05 0. 2wt% KH2PO4, 0. 05 0. 2wt%NaCl, 0. 01 0. 06wt%MgS04 ·7Η20，0· 1 0. 4wt% NaNO3 :0. 001 0. 025wt% FeCl3, 0. 05 0. 2wt % CaCl2，余為水，pH 自然，115°C滅菌 20 min 備用；(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將節(jié)碎米與米糠按10:1 3的重量比混合，90 100°C 蒸煮25 40 min ；(4)接種培養(yǎng)固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤涼后，接種步驟(2)得到的點(diǎn)青霉種子，接種量為 500 1000 ml種子培養(yǎng)液接種500 kg培養(yǎng)基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，直至點(diǎn)青霉孢子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入發(fā)酵床，25 30 °C，加濕通風(fēng)條件下培養(yǎng)48 60 h；(5)固體發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于100 120°C干燥2 4 h，粉碎至40 80目， 即成。
全文摘要
以稻谷加工副產(chǎn)物為原料生產(chǎn)飼用葡萄糖氧化酶的方法，其包括以下步驟(1)將高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的點(diǎn)青霉接種裝有PDA培養(yǎng)基的10cm微生物培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)；(2)種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基經(jīng)115～121℃滅菌20～30min后，將步驟(1)培養(yǎng)皿中活化的點(diǎn)青霉轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基；(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將節(jié)碎米與米糠按10∶1～3的重量比混合，90～100℃蒸煮25～40min；(4)接種培養(yǎng)固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤涼后，接種點(diǎn)青霉種子進(jìn)行培養(yǎng)；(5)固體發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于100～120℃干燥2～4h，粉碎至40～80目。本發(fā)明原料來(lái)源廣，無(wú)“三廢”產(chǎn)生，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品葡萄糖氧化酶活力高達(dá)200U。
文檔編號(hào)C12R1/80GK102220295SQ20111013857
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者劉俊文, 周慧, 楊濤, 林親錄 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙理工大學(xué)