專利名稱：一種角質(zhì)酶的突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶突變體及其制備方法，尤其涉及角質(zhì)酶的突變體及其制備方法，本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)本發(fā)明是利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方法改善耐熱角質(zhì)酶的底物特異性的技術(shù)。
背景技術(shù)：
角質(zhì)酶是能夠水解角質(zhì)大分子的水解酶。作為一種多功能酶，在紡織工業(yè)、食品工業(yè)以及化工工業(yè)等諸多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。尤其在紡織工業(yè)中，角質(zhì)酶可用于棉纖維生物精練，以去除棉纖維表面蠟質(zhì)和角質(zhì)，并有助于果膠、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的進(jìn)一步去除，從而達(dá)到精練目的。近年來(lái)研究表明，角質(zhì)酶還可用于合成纖維聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET) 的改性，增加織物吸水性，改善手感，提高織物品質(zhì)。上述兩工藝目前均采用傳統(tǒng)堿處理工藝，存在水耗、能耗大，排放廢水堿性強(qiáng)、色度深、COD值高以及對(duì)纖維損傷大等弊病。酶精練工藝作為一種節(jié)能降耗、環(huán)境友好的紡織品清潔生產(chǎn)技術(shù)，已成為國(guó)內(nèi)外染整行業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。國(guó)外對(duì)角質(zhì)酶進(jìn)行了大量的研究，主要集中于Fusarium solani等真菌來(lái)源角質(zhì)酶。但真菌角質(zhì)酶熱穩(wěn)定性差，不適合在紡織工業(yè)中的應(yīng)用。而本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產(chǎn)耐熱角質(zhì)酶可有效水解角質(zhì)、PET等聚酯，但水解效率較低(陳堅(jiān)，吳敬，陳晟.一種耐熱角質(zhì)酶及其編碼基因和表達(dá).申請(qǐng)?zhí)?00710026074. 2)。因此通過(guò)結(jié)構(gòu)模擬確定突變位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)提高耐熱角質(zhì)酶對(duì)角質(zhì)和PET的催化效率極為重要，具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種角質(zhì)酶的突變體，包括一個(gè)或兩個(gè)相應(yīng)于嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質(zhì)酶活性中心位點(diǎn)附近的氨基酸殘基的取代， 與親代角質(zhì)酶相比具有更強(qiáng)的角質(zhì)或PET水解能力。所述嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產(chǎn)角質(zhì)酶的基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中 Thermobifida fusca編碼的蛋白Tfu_0883極其類似，基因全長(zhǎng)906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有兩個(gè)核苷酸的差異，編碼氨基酸相同(陳堅(jiān)，吳敬，陳晟.一種耐熱角質(zhì)酶及其編碼基因和表達(dá).申請(qǐng)?zhí)?00710026074. 2)。所述角質(zhì)酶突變體是218位氨基酸異亮氨酸Ile突變?yōu)楸彼酇la，命名為 I218A。所述角質(zhì)酶突變體是是第132位氨基酸谷氨酰胺Gln和第101位氨基酸蘇氨酸 Thr同時(shí)突變?yōu)楸彼酇la，命名為Q132A/T101A。所述角質(zhì)酶突變體是是第195位氨基酸色氨酸Trp和第249位氨基酸苯丙氨酸 Phe同時(shí)突變?yōu)楸彼酇la，命名為W195A/F249A。本發(fā)明的所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述突變體的制備方法。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是在嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶模擬結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上確定突變位點(diǎn)；設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶角質(zhì)酶基因的載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建突變質(zhì)粒I218A-pet20b(+)、W195/F249-pet20b (+)、Q132A/ T101A-pet20b(+)；將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE!3)細(xì)胞，挑選驗(yàn)證后的陽(yáng)性單克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，25°C恒溫培養(yǎng)至80h，對(duì)上清液進(jìn)行硫酸銨沉淀、離子交換柱純化角質(zhì)酶突變體 I218A、Q132A/T101A 和 W195A/F249A。所述攜帶角質(zhì)酶的載體為pUC系列，PET系列，活PGEX中的任一一種。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一組具有纖維高催化效率的角質(zhì)酶突變體及其制備方法，I218A、Q132A/T101A和W195A/FM9A對(duì)棉纖維的催化效率均有所提高，其中突變體I218A對(duì)角質(zhì)的催化效率比原角質(zhì)酶提高50% ；Q132A/T101A對(duì)合成纖維對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角質(zhì)酶提高3倍。這三種突變體在紡織工業(yè)中有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體純化SDS-PAGE電泳圖。泳道1 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道2 :I218A發(fā)酵液；泳道3 J218A純化制品；泳道4 :W195A/F249A 發(fā)酵液；泳道5 :W195A/F249A 純化制品；泳道6 :Q132A/T101A 發(fā)酵液；泳道7 :Q132A/T101A 純化制品。圖2嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體角質(zhì)水解活力分析。Δ 嗜嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶；□ J218A ；■ :W195A/F249A ； ▲ :Q132A/T101A圖3嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體PET水解活力分析。Δ 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶；□ J218A ；· :W195A/F249A ;▲ Q132A/T101A
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體突變位點(diǎn)確定的方法。角質(zhì)等聚酯是由大量脂肪酸構(gòu)成的疏水性大分子物質(zhì)，角質(zhì)酶活性中心周圍氨基酸的大小對(duì)聚酯大分子和活性中心的結(jié)合造成影響，此外氨基酸的疏水性影響底物結(jié)合位點(diǎn)和底物的結(jié)合，因此，以角質(zhì)酶模擬結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，從以上兩方面出發(fā)，確定突變位點(diǎn)進(jìn)而對(duì)角質(zhì)酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。通過(guò)對(duì)嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶模擬結(jié)構(gòu)的分析，設(shè)計(jì)三組突變系列(1)位于絲氨酸活性中心正上方的氨基酸異亮氨酸1218所占空間較大，對(duì)活性中心和大分子底物的結(jié)合形成較大的位阻，因此將其突變?yōu)槲蛔栎^小的丙氨酸，以提高底物和活性中心的親和力；( 位于絲氨酸活性中心兩側(cè)的芳香族氨基酸色氨酸W195和苯丙氨酸F249由于苯環(huán)的存在，也占用大量空間，因此也將其突變?yōu)楸彼釡p少位阻效應(yīng)；(3)位于活性中心附近的親水性氨基酸谷氨酰胺Q132和蘇氨酸TlOl對(duì)疏水性底物的結(jié)合力較差，將其突變?yōu)槭杷园被岜彼嵋栽黾訉?duì)疏水性底物的結(jié)合力， 提高催化效率。實(shí)施例2 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體的制備方法。利用快速PCR 定點(diǎn)突變方法構(gòu)建 I218A-pet20b (+)、W195/F249_pet20b (+)、 Q132A/T101A-pet20b (+)突變質(zhì)粒。I218A_pet20b(+)、W195_pet20b(+)、Q132A_pet20b (+)突變質(zhì)粒的構(gòu)建以 ⑶T-pet20b(+)質(zhì)粒為模板(陳堅(jiān)，吳敬，陳晟.一種耐熱角質(zhì)酶及其編碼基因和表達(dá).申請(qǐng)?zhí)?00710026074. 2)，分別用I218A、W195A和Q132A的突變引物通過(guò)一次PCR得到大小為4500bp左右產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I處理后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。W195/F249-pet20b (+)、Q132A/T101A_pet20b (+)突變質(zhì)粒的構(gòu)建分別以驗(yàn)證正確的W195-pet20b(+)、Q132A-pet20b(+)質(zhì)粒為模板，用F249A和TlOlA為突變引物，PCR擴(kuò)增得到大小為4500bp左右產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物Dpn I處理后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞， 挑選轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明除了所需突變位點(diǎn)外，沒(méi)有出現(xiàn)隨機(jī)突變，因此突變質(zhì)粒 I218A-pet20b (+)、W195/F249-pet20b (+)、Q132A/T101A-pet20b (+)構(gòu)建成功。突變引物如下所示(方框?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)):1、I218A突變引物對(duì)P 1218A1 5 ’ -GCCGACCTCGACACG ]GCC|丨 GCGCCGTCGCCACG-3 ’P 1218A2 5 ’ -CGTGGCGACCGGCGC '|GGC|( CGTGTCGAGGTC-3 ’2、W195A突變引物對(duì)P W195A1 :5’ -ATCCCGCTCACCCCG ^GCG|( CACCTCAACA AGAA C-3’PW195A2 5 ’ -GTTCTTGTTGAGGTG jCGC|丨 CGGGGTGAGCGGGATGG-3 ’3、F249A突變引物對(duì) P F249A1 5 ’ -gACGGCGCAACCCAC '|GCC|i GCCCCGAACATCC-3 ’P F249A2 5' -GGATGTTCGGGGC 1GGC|' GTGGGTTGCGCCGTC-3’4、Q132A突變引物對(duì)P Q132A1 5' -CATCACCACCCTCGAC '|GCG|i CCGGACAGCCGGGC Ag_3’P Q132A2 :5’ -CTGCCCGGCTGTCCGG ]CGC|' GTCGAGGGTGGTGATG-3‘5、TlOlA突變引物對(duì)P TlOlAl :5’ -GATCTCCCCCGGCTAC |GCC|i GGCACTGAGGCTTC-3‘P T101A2 :5’ -GAAGCCTCAGTGCC '|GGC| GTAGCCGGGGAGATC-3’上述PCR體系均為
組分體積(μι) 2 xPrimeSTAR GC Buffer (含 Mg2+) 25
dNTPMixture (2.5 mM)4
Pl1
P21
質(zhì)粒1
TM,
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5
0.5
U/μΙ)
ddH2017.5上述PCR條件均為94°C預(yù)變性％iin，然后進(jìn)行以下循環(huán)98°C變性10s，60°C退火5s，72°C延伸^iin ； 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保溫。實(shí)施例3 嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體的表達(dá)純化方法。將突變質(zhì)粒I218A-pet20b(+)、W195/F249_pet20b (+)、Q132A/T101A_pet20b (+) 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將驗(yàn)證后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在TB培養(yǎng)基(甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 Mg/L，K2HPO4 12. 54g/L, KH2PO4 2. 31g/L)中 37°C 液體培養(yǎng)過(guò)夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)池后用％ig/L IPTG(異丙基硫代β D 半乳糖苷)誘導(dǎo)，降溫至25°C恒溫培養(yǎng)80h。發(fā)酵液于4°C，10000rpm離心20min除菌體。上清液通過(guò)活性炭柱收集。在通過(guò)活性炭柱的清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過(guò)夜，4°C，IOOOOrpm離心20min，取沉淀物用適量緩沖液A(20mM Tris-HCl,pH 8)溶解，加入20%硫酸銨，0. 22 μ m膜過(guò)濾后制成上樣樣品。Wienyl HP疏水柱用加入20%硫酸銨的緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入疏水柱，使之完全吸附后，分別用含20%硫酸銨的緩沖液A、20% -0%硫酸銨梯度的緩沖液Α、緩沖液A 和去離子水洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為^Onm，洗脫液分部收集。酶活力部分用緩沖液 A平衡的DEAE Sepharose陰離子交換柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，洗脫流速lmL/min，收集酶活力組分，用10000道爾頓膜離心濃縮，得純化角質(zhì)酶突變體。純化后角質(zhì)酶突變體達(dá)到電泳純， 表觀分子量30KDa。純化結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例4 嗜熱放線菌CThermobifida fusca)角質(zhì)酶突變體對(duì)角質(zhì)或PET水解的效率。角質(zhì)酶對(duì)角質(zhì)的水解效果測(cè)定使用如下方法反應(yīng)體系包括(w/v)蘋果角質(zhì)、 25mM磷酸鉀緩沖液(pH 8. 0)、Img酶液，60°C保溫，不同時(shí)間取樣，用0. 02M NaOH溶液滴定生成的脂肪酸。角質(zhì)酶對(duì)PET的水解效果測(cè)定使用如下方法反應(yīng)體系為10ml，包括0. 3g PET、 25mM磷酸鹽緩沖液(pH 8. 0)、0. Img酶液，150rpm 60°C保溫72h以上，保溫過(guò)程中取樣進(jìn)行RP-HPLC分析。水解活性通過(guò)水解產(chǎn)物的總和進(jìn)行計(jì)算。水解產(chǎn)物對(duì)苯二甲酸(TPA)、單(對(duì)苯二甲酸-2-羥基乙酯)(MHET)、二(對(duì)苯二甲酸-2-羥基乙酯)(BHET)、1，2-乙烯基-單對(duì)苯二甲酸-單(對(duì)苯二甲酸-2-羥基乙酯)(EMT)通過(guò)LC-MS進(jìn)行定量分析。如圖2所示，I218A、W195A/F249A和Q132A/T101A突變體水解角質(zhì)的能力較未改造嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶有明顯的提高。其中W195A/FM9A在水解過(guò)程的前期水解角質(zhì)速度較快，并很快達(dá)到平衡；I218A和Q132A/T101A角質(zhì)水解效率比原酶分別提高50%和20%。如圖3所示，Q132A/T101A突變體水解PET的能力較未改造嗜熱放線菌 (Thermobifida fusca)角質(zhì)酶有明顯的提高，水解效率達(dá)原酶的3倍。
權(quán)利要求
1. 一種角質(zhì)酶的突變體，其特征是將嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質(zhì)酶第 132位氨基酸谷氨酰胺Gln和第101位氨基酸蘇氨酸Thr同時(shí)突變?yōu)楸彼酇la，命名為 Q132A/T101A，所述嗜熱放線菌的角質(zhì)酶的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Tfu_0883基因編碼的氨基酸序列相同。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質(zhì)酶的突變體及其制備方法，突變體包括一個(gè)或兩個(gè)相應(yīng)于嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質(zhì)酶活性中心位點(diǎn)附近的氨基酸殘基的取代，I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A對(duì)棉纖維的催化效率均有所提高，其中突變體I218A對(duì)角質(zhì)的催化效率比原角質(zhì)酶提高50％；Q132A/T101A對(duì)合成纖維對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角質(zhì)酶提高3倍，這三種突變體在紡織纖維前處理中有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/16GK102260655SQ20111013946
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者吳敬, 陳堅(jiān), 陳晟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)