專利名稱：登革熱病毒ⅰ型/ⅱ型雙重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種登革熱病毒體外檢測試劑盒，尤其涉及登革熱病毒I型/11型雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，本發(fā)明屬于登革熱病毒血清型的體外檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
登革熱(Classical dengue fever, DF)是由登革熱病毒(dengue virus)的 4 個血清型引起的一種急性傳染病，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，臨床上以高熱、出血、 全身肌肉和關(guān)節(jié)痛等為主要癥狀，可伴有皮疹、淋巴腺腫和白細(xì)胞減少。登革熱病毒感染除引起登革熱外，嚴(yán)重的還可導(dǎo)致登革出血熱(denguehemorrhagic fever, DHF)或登革休克綜合癥(dengue shocksyndrome,DSS)等癥狀。DHF以高熱、出血、休克和高病死率為特征， 是較為嚴(yán)重的一種臨床類型。由于全球氣候變暖、國際旅游頻繁和對蚊蟲缺乏有效的控制， 登革熱在世界范圍內(nèi)發(fā)生過多次大流行，全球有100多個國家出現(xiàn)流行，據(jù)WHO統(tǒng)計，每年登革熱感染人數(shù)有5000萬，全世界有25億人正受到感染登革病毒的威脅，每年均出現(xiàn)幾百萬病例，是較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。登革病毒是黃病毒科(flaviviridae)黃病毒屬(flavivirus)登革亞組的重要成員，自然界中存在的登革病毒可分為4個血清型。登革熱的傳染源主要是處于病毒血癥期的顯性和隱性的感染者，在城市型疫源地區(qū)患者和隱性感染者是主要的傳染來源。在新疫區(qū)普遍易感。但以青壯年發(fā)病率最高。在地方性流行區(qū)，20歲以下的居民100%在血清中能檢出抗登革熱病毒的中和抗體，因而發(fā)病者多為兒童。登革熱的發(fā)現(xiàn)已有200多年的歷史，早期記載的報道是1779年埃及開羅、印度尼西亞雅加達(dá)及美國費(fèi)城，根據(jù)癥狀命名為關(guān)節(jié)熱和骨折熱。1869年由英國倫敦皇家內(nèi)科學(xué)會命名為登革熱。中國于1978年在廣東流行，并分離出IV型登革熱病毒。此后，1979年、 1980年、1985年小流行中分離出I型、II、III型病毒。目前各地區(qū)主要以散在暴發(fā)或散發(fā)為主，并且以輸入型病例引發(fā)的流行居多。實時焚光定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, 簡稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量 PCR技術(shù)于1996年由美國Applied biosystems公司推出，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA (cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR，即實時PCR法(Real-time RT-PCR)，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入(RT-PCR) 的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實時監(jiān)測DNA的放大過程，在擴(kuò)增的指數(shù)增長期就測量擴(kuò)增產(chǎn)物，因為擴(kuò)增指數(shù)增長期測量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關(guān)性，從而實現(xiàn)定量檢測。RealTime PCR的基本目標(biāo)是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測 CT值而實現(xiàn)對原始目標(biāo)基因的含量定量。實時熒光定量PCR法最大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn) PCR法進(jìn)入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏性和特異性高、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。此外，通過在該體系中加入兩條或者兩條以上引物及對應(yīng)的探針，便可實現(xiàn)對多種病原體的同時檢測?，F(xiàn)有的登革熱的體外診斷試劑盒大多存在特異性和靈敏性較低、檢測步驟繁瑣等缺陷，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的登革熱的體外診斷試劑盒所存在的檢測步驟繁瑣以及特異性和靈敏性較低等缺陷，提供一種能夠同時在一個反應(yīng)管中分別檢測出登革熱病毒I型和II型的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種登革熱病毒I型/11型雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，包括以下各組分=RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、登革熱病毒I型/11型雙重反應(yīng)液、去RNA酶水。其中，所述的登革熱病毒I型/11型雙重反應(yīng)液由以下2組組分組成組分(1)由一對檢測登革熱病毒I型的引物和一條用檢測登革熱病毒I型的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。組分O)由一對檢測登革熱病毒II型的引物和一條檢測登革熱病毒II型的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 6所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。其中，所述的熒光報告基團(tuán)包括FAM、HEX、ROX、CT3或CY5等熒光報告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)包括BHQ1、BHQ2或BHQ 3等熒光淬滅基團(tuán)；本發(fā)明對上述引物和探針的配比比例進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們之間不同的配比比例對于檢測結(jié)果的特異性和靈敏性具有顯著的差異，本發(fā)明通過高通量的篩選試驗發(fā)現(xiàn)，上述引物和探針在下述配比下，具有最優(yōu)的檢測效果檢測登革熱病毒I型的引物及探針的配比分別為SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2 SEQ ID No. 3 = 500nM 500nM 300nM ；檢測登革熱病毒II型的引物及探針的配比分別為SEQ ID No. 4 SEQ IDNo. 5 SEQ ID No. 6 = 500nM 500nM 400nM。表1登革熱病毒I型/11型引物探針
權(quán)利要求
1.一種登革熱病毒I型/11型的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，包括以下各組分=RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、登革熱病毒I型/11型雙重反應(yīng)液和去RNA酶水。
2.按照權(quán)利要求1所述的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，所述的登革熱病毒I 型/11型雙重反應(yīng)液由以下組分(1)和組分(2)組成組分(1)由一對檢測登革熱病毒I型的引物和一條檢測登革熱病毒I型的探針組成； 其中，所述引物對的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分O)由一對檢測登革熱病毒II型的引物和一條檢測登革熱病毒II型的探針組成；其中，所述引物對的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
3.按照權(quán)利要求2所述的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于所述的熒光報告基團(tuán)包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5熒光報告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)包括BHQl、BHQ2或 BHQ3熒光淬滅基團(tuán)。
4.按照權(quán)利要求2所述的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，組分(1)中各引物及探針的配比如下SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2 SEQ ID No. 3 = 500nM 500nM 300nM。
5.按照權(quán)利要求2所述的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，組分( 中各引物及探針的配比如下SEQ ID No. 4 SEQ ID No. 5 SEQ ID No. 6 = 500nM 500nM 400nM。
6.按照權(quán)利要求1-5任何一種所述的雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，還含有登革熱病毒I型/11型的陽性參考品。
全文摘要
本發(fā)明公開了登革熱病毒I型/II型雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，屬于登革熱病毒血清型的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明檢測試劑盒包括以下各組分RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、登革熱病毒I型/II型雙重反應(yīng)液、去RNA酶水。本發(fā)明還公開了該試劑盒檢測登革熱病毒I型/II型的使用方法。本發(fā)明試劑盒解決了現(xiàn)有登革熱病毒體外檢測試劑盒無法同時檢測登革熱病毒不同血清型的問題，能夠在同一反應(yīng)管中同時檢測出登革熱病毒I型和II型，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測結(jié)果快速客觀等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/70GK102277447SQ20111013970
公開日2011年12月14日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者劉中華, 張旭, 李秀林, 王國強(qiáng), 魏趙延 申請人:江蘇碩世生物科技有限公司