專(zhuān)利名稱(chēng)：用于多種細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及可用于多種細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條及其引物。
背景技術(shù)：
病原菌引起的感染性、傳染性疾病是威脅人類(lèi)健康和造成社會(huì)恐慌的重要因素， 快速準(zhǔn)確地檢測(cè)病原菌是有效預(yù)防和治療感染性疾病的關(guān)鍵。常規(guī)的生理生化、血清學(xué)鑒定方法操作繁瑣，周期長(zhǎng)，而且某些病原菌培養(yǎng)困難。PCR、ELISA等方法雖然縮短了檢測(cè)周期，但假陽(yáng)性率高[1’2]，。基因芯片技術(shù)的興起，使快速、微量、準(zhǔn)確、高通量地檢測(cè)病原菌成為可能[3]?；蛐酒瑱z測(cè)病原菌選取的靶基因一般為16s rRNA、16S-23S rRNA、23s rRNA的基因等⑷，標(biāo)記基因的方法有Cy3或Cy5等熒光染料、生物素、地高辛等[4’5]。目前，市場(chǎng)上應(yīng)用的病原菌檢測(cè)芯片多采用熒光標(biāo)記，如天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司出品的系列病原菌檢測(cè)芯片， 北京博奧生物有限公司出品的晶芯 食源性致病菌檢測(cè)試劑盒等。但是，采用熒光標(biāo)記的基因芯片需要激光共聚焦微陣列掃描儀、基因芯片點(diǎn)樣儀等貴重儀器[6]，成本高，價(jià)格貴。本研究選取10種常見(jiàn)細(xì)菌為研究材料，采用16s rRNA基因?yàn)闄z測(cè)靶基因， 選擇多態(tài)區(qū)設(shè)計(jì)探針，硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質(zhì)，利用生物素標(biāo)記16s rRNA基因擴(kuò)增片段，PCR擴(kuò)增片段與膜條雜交后，SA-AP (streptavidin labled by alkaline phosphatase，堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素)檢測(cè)生物素標(biāo)記、NBT (nitroblue tetrazolium,硝基四氮唑藍(lán))/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3_Indolyl Phosphate, 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)顯色的方法，建立起了一種快速、準(zhǔn)確、成本較低的細(xì)菌檢測(cè)方法，具有良好的臨床應(yīng)用前景。本研究對(duì)感染性疾病的預(yù)防、診斷、治療具有重大的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于多種細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條產(chǎn)品及其檢測(cè)時(shí)所用的引物。建立起了一種快速、準(zhǔn)確、成本較低的細(xì)菌檢測(cè)方法，具有良好的臨床應(yīng)用前景。一種用于多種細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條，包括用于擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因片段的一對(duì)引物250F :CCTACGGGAGGCAGCAGT ；1020R :CGGGACTTAACCCAACAT ；以及固定有如下所示序列探針中的一種或幾種的硝酸纖維素薄膜條，所述探針序列如下大腸埃希菌檢測(cè)探針TCC ACG GAA GTT TTC AGA GAT GAG AAT GTG CCT TCG GGA ACC GTG AGA CA腸道沙門(mén)菌檢測(cè)探針TCC ACA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT GTG AGA CA粘質(zhì)沙雷菌檢測(cè)探針
TCC AGA GAA CTT TCC AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA
陰溝腸桿菌檢測(cè)探針
TCC AGA GAA CTT AGC AGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA
奇異變形桿菌檢測(cè)探針
TCC AGC GAA TCC TTT AGAGATAGAGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACA
銅綠假單胞菌檢測(cè)探針
TGC TGA GAA CTT TCC AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACA
鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)探針
TAC TAG AAA CTT TCC AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACA
枯草芽孢桿菌檢測(cè)探針
TCC TCT GAA AAC CCT AGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACA
溶血性葡萄球菌檢測(cè)探針
TCC TTT GAC CCT TCT AGAGATAGAAGTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGA
金黃色葡萄球菌檢測(cè)探針
TCC TTT GAC AAC TCT AGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGA。
所述的引物1020R的5’端被生物素標(biāo)記)
所述的硝酸纖維素薄膜條還固定有
無(wú)序的核酸探針
ATC TGA TGC TGC ATA CGTACTGCATCCGTAACTGCAATGGTACTGTAGCC
細(xì)菌通用探針
TGT CGT CAG CTC GTG YYGTGARRTGTYGGSTTAAGTSCCRYAACGAGCGC。
所述的細(xì)菌大腸埃希菌，腸道沙門(mén)菌，粘質(zhì)沙雷菌，陰溝腸桿菌，奇異變形桿菌，銅
綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，枯草芽孢桿菌，溶血性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌中的一種或幾種。目前，市場(chǎng)上有檢測(cè)細(xì)菌的基因芯片，但多為熒光標(biāo)記[7]；也有用于HPV分型的非熒光標(biāo)記的基因芯片[8_9]，但還沒(méi)有檢測(cè)臨床標(biāo)本中病原細(xì)菌的非熒光標(biāo)記的基因芯片。一些同行嘗試過(guò)用生物素或者地高辛標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)病原菌[5]_，但并沒(méi)有用到臨床實(shí)踐。由于熒光標(biāo)記的基因芯片價(jià)格高，而非熒光標(biāo)記的基因芯片又沒(méi)有產(chǎn)品，所以目前各醫(yī)院的檢驗(yàn)科還是傳統(tǒng)的鏡檢和生化的方法鑒定樣本中的病原細(xì)菌的種類(lèi)。本研究選用硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質(zhì)，采用生物素標(biāo)記細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)出新的通用引物，以及探針，建立起了一種快速、準(zhǔn)確、成本較低的細(xì)菌檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)一種或多種細(xì)菌，具有良好的臨床應(yīng)用前景。


圖1為用于鑒定細(xì)菌的16S rRNA基因片段擴(kuò)增M =Marker ；1 :ddH20 ；2 大腸埃希菌；3 腸道沙門(mén)菌；4 粘質(zhì)沙雷菌；5 陰溝腸桿菌；6 奇異變形桿菌；7 銅綠假單胞菌；8 鮑曼不動(dòng)桿菌；9 枯草芽孢桿菌；10 溶血性葡萄球菌；11:金黃色葡萄球菌；圖2為用于核酸分子雜交的16S rRNA基因片段擴(kuò)增
(A)通用引物250F、bio-1020R可以擴(kuò)增10種細(xì)菌的16S rRNA片段。M =Marker ； 1 大腸埃希菌；2 腸道沙門(mén)菌；3 粘質(zhì)沙雷菌；4 陰溝腸桿菌；5 奇異變形桿菌；6 銅綠假單胞菌；7 鮑曼不動(dòng)桿菌；8 枯草芽孢桿菌；9 溶血性葡萄球菌；10 金黃色葡萄球菌；(B)Biotin 成功標(biāo)記反向引物 Bio_1020R ；圖3為10種細(xì)菌檢測(cè)膜條的探針排列順序Scrambling 無(wú)序的核酸探針；Universal 細(xì)菌通用探針；E. coli 大腸埃希菌的探針；S. enterica 腸道沙門(mén)菌的探針；S. marcescens 粘質(zhì)沙雷菌的探針；E. cloacae 陰溝腸桿菌的探針；P. mirabilis 奇異變形桿菌的探針；P. aeruginosa 銅綠假單胞菌的探針；A. baumannii 鮑曼不動(dòng)桿菌的探針；B. subtilis 枯草芽孢桿菌的探針；S. hominis 溶血性葡萄球菌的探針；S. aureus 金黃色葡萄球菌的探針；圖4為本發(fā)明膜條檢測(cè)10種細(xì)菌A 大腸埃希菌；B 腸道沙門(mén)菌；C 粘質(zhì)沙雷菌；D 陰溝腸桿菌；E 奇異變形桿菌； F 銅綠假單胞菌；G 鮑曼不動(dòng)桿菌；H 枯草芽孢桿菌；I 溶血性葡萄球菌J 金黃色葡萄球菌；K 同時(shí)檢測(cè)5種細(xì)菌——大腸埃希菌，腸道沙門(mén)菌，粘質(zhì)沙雷菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，金黃色葡萄球菌。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。1材料與方法1. 1 細(xì)菌10種細(xì)菌大腸埃希菌，腸道沙門(mén)菌，粘質(zhì)沙雷菌，陰溝腸桿菌，奇異變形桿菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，枯草芽孢桿菌，溶血性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌屬于常用菌株，購(gòu)買(mǎi)于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的非專(zhuān)利培養(yǎng)物的保藏庫(kù)。1.2細(xì)菌基因組DNA提取1. 2. ICTAB法提取細(xì)菌基因組DNA接種菌株于LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取1.5ml新鮮培養(yǎng)物， 12000rpm離心aiiin。去上清液，加入567 μ 1的TE緩沖液，震蕩重新懸浮細(xì)菌。然后，加入30μ1 10% SDS和15 μ 1 20mg/ml蛋白酶Κ(革蘭陽(yáng)性菌需先加入20 μ 1 10mg/ml溶菌酶，37°C反應(yīng)15min后再加入蛋白酶K)，混勻，于37°C溫育lh，其間多次顛倒混勻。如果溶液變澄清，表示細(xì)菌裂解完全。隨后，加入100 μ 1 5mol/L NaCl和80 μ 1 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨)/NaCl 溶液(5g CTAB 溶于 100ml 0. 5M NaCl溶液中，需要加熱到65°C使之溶解，然后室溫保存)，混勻，65°C溫育lOmin，可見(jiàn)白色沉淀。然后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，混勻至乳濁狀。12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)上清液至一潔凈試管，加入與上清液等體積的異丙醇，輕輕混勻，直至產(chǎn)生絮狀DNA沉淀。12000rpm離心5min，去上清液，沉淀用Iml的70%乙醇洗滌。離心，棄乙醇， 在潔凈工作臺(tái)中干燥沉淀。最后，將沉淀溶于50 μ 1 TE緩沖液，加入Ιμ RNase A(10mg/ ml)，4°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 2丙酮直接煮沸法取新鮮細(xì)菌懸液，加入等體積丙酮，置于沸水浴中煮沸l(wèi)Omin。然后12000rmp離心aiiin，其上清液即為細(xì)菌DNA溶液，可以作為PCR擴(kuò)增的模板。1. 3PCR 擴(kuò)增 16S rRNA 基因片段引物合成和生物素標(biāo)記交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。建立50 μ 1 PCR 反應(yīng)體系=DNA 模板 1 μ 1，ddH20 38. 5 μ 1, IOXPCR 緩沖液 5 μ 1，25mM MgCl2 2 μ 1，IOmM dNTP 1口1，2(^] 引物1 1μ1，20μΜ 引物 2 1 μ l,5U/y 1 TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ 1。采用 PTC-100 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。如采用 27F、149 擴(kuò)增 16S rRNA基因片段，反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸90s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min ；4°C保存?zhèn)溆?。如采?50F、Bio-1020R擴(kuò)增16S rRNA基因片段， 反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，;35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存?zhèn)溆?。?擴(kuò)增16s rRNA基因片段的引物Table 1 Primers amplifying 16s rRNA gene fragments引物名稱(chēng)a 序列(5’-3') bPCR產(chǎn)物大小(bp) PCR產(chǎn)物的用途
權(quán)利要求
1.一種用于多種細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條，其特征在于，包括用于擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因片段的一對(duì)引物250F :CCTACGGGAGGCAGCAGT ； 1020R :CGGGACTTAACCCAACAT ；以及固定有如下所示序列探針中的一種或幾種的硝酸纖維素薄膜條，所述探針序列如下大腸埃希菌檢測(cè)探針TCC ACG GAA GTT TTC AGA GAT GAG AAT GTG CCT TCG GGA ACC GTG AGA CA 腸道沙門(mén)菌檢測(cè)探針TCC ACA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT GTG AGA CA 粘質(zhì)沙雷菌檢測(cè)探針TCC AGA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT CTG AGA CA 陰溝腸桿菌檢測(cè)探針TCC AGA GAA CTT AGC AGA GAT GGT TTG GTG CCT TCG GGA ACT CTG AGA CA 奇異變形桿菌檢測(cè)探針TCC AGC GAA TCC TTT AGA GAT AGA GGA GTG CCT TCG GGA ACG CTG AGA CA 銅綠假單胞菌檢測(cè)探針TGC TGA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT CAG ACA CA 鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)探針TAC TAG AAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ATC TAG ATA CA 枯草芽孢桿菌檢測(cè)探針TCC TCT GAA AAC CCT AGA GAT AGG GCT TCT CCT TCG GGA GCA GAG TGA CA溶血性葡萄球菌檢測(cè)探針TCC TTT GAC CCT TCT AGA GAT AGA AGT TTC CCC TTC GGG GGA CAA AGT GA金黃色葡萄球菌檢測(cè)探針TCC TTT GAC AAC TCT AGA GAT AGA GCC TTC CCC TTC GGG GGA CAA AGT GA0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜條，其特征在于，所述的引物1020R的5’端被生物素標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜條，其特征在于，所述的硝酸纖維素薄膜條還固定有無(wú)序的核酸探針ATC TGA TGC TGC ATA CGT ACT GCA TCC GTA ACT GCA ATG GTA CTG TAG CC 細(xì)菌通用探針TGT CGT CAG CTC GTG YYG TGA RRT GTY GGS TTA AGT SCC RYA ACG AGC GC0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜條，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1所述的膜條，其特征在于， 所述的細(xì)菌包括大腸埃希菌，腸道沙門(mén)菌，粘質(zhì)沙雷菌，陰溝腸桿菌，奇異變形桿菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，枯草芽孢桿菌，溶血性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌中的一種或幾種。
5.一種用于多種細(xì)菌基因檢測(cè)的擴(kuò)增用引物，其特征在于， 250F :CCTACGGGAGGCAGCAGT ；1020R :CGGGACTTAACCCAACAT。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于多種細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條及其引物。選取10種常見(jiàn)細(xì)菌為檢測(cè)對(duì)象，以16S rRNA基因?yàn)闄z測(cè)靶基因，設(shè)計(jì)10種常見(jiàn)細(xì)菌的檢測(cè)探針及其配套引物。用硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質(zhì)，制成10種常見(jiàn)細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條。PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16SrRNA基因片段，生物素標(biāo)記。PCR擴(kuò)增片段與膜條雜交后，采用堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素檢測(cè)生物素標(biāo)記，然后NBT/BCIP顯色。結(jié)果表明該膜條能單獨(dú)檢測(cè)10種細(xì)菌中的任何一種或幾種。本發(fā)明成功研制了10種常見(jiàn)細(xì)菌的基因檢測(cè)膜條，建立了用膜條檢測(cè)細(xì)菌的方法，該方法具備高通量、快速、準(zhǔn)確、成本較低的特點(diǎn)，并具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102229992SQ201110140040
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者朱飛舟, 陳漢春 申請(qǐng)人:中南大學(xué)