專利名稱：以乙腦病毒減毒株為基因骨架的乙腦/登革嵌合病毒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以乙腦病毒減毒株為基因骨架的乙腦/登革嵌合病毒及其應用。
背景技術：
登革病毒(Dengue virus, DENV)屬黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，該屬還包括流行性乙型腦炎病毒(簡稱乙腦病毒)，也稱日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)、西尼羅病毒(West Nile virus, WNV)、蝶傳腦炎病毒(Tick-borne Encephalitis virus, TBEV)和黃熱病毒(Yellow Fever virus, YFV)等，其中大多數(shù)病毒為重要的人畜共患病病原體，主要通過蚊、蜱等媒介傳播。 登革病毒分為4個血清型，每個血清型病毒感染均可導致登革熱(dengue fever,DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(dengue shocksyndrome, DSS)。全球有約30億人受到登革病毒感染的威脅，每年大約有近I億人感染登革熱。其中登革出血熱病例達50萬，死亡約2萬余人，對人類健康和公共衛(wèi)生安全構成重要威脅。登革熱與登革出血熱的流行區(qū)起初主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，尤以東南亞最為嚴重。但是隨著全球氣候變暖和國際交往的日益頻繁，近年來登革熱發(fā)病范圍已在全球逐漸擴大，爆發(fā)頻率也不斷增加。登革病毒是有包膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組含有一個單一開放讀碼框，依次編碼3種結構蛋白衣殼蛋白(capsid protein,C)、膜蛋白及其前體(membrane proteinand its precursor,M/prM)及包膜蛋白(envelope protein,E),和 7 種非結構蛋白(NS1、吧2&、吧213、吧3、吧4&、吧413和吧5)。登革病毒的抗原蛋白主要是包膜蛋白E、膜蛋白M和非結構蛋白NS1。其中，E蛋白具有多種B細胞和T細胞表位，能誘導產生血凝抑制抗體和中和抗體。PrM蛋白見于未成熟的病毒顆粒，可能在病毒顆粒成熟過程中作為分子伴侶來協(xié)助包膜E蛋白的正確折疊，在此過程中進一步經宿主細胞的蛋白酶切割后成為M蛋白。非結構蛋白NSl是一種可溶性補體蛋白，可誘導產生中和抗體。疫苗接種是預防病毒性疾病的最有效途徑，但目前仍無安全有效的登革疫苗用于臨床。登革疫苗研制主要面臨以下挑戰(zhàn)。第一，登革病毒感染導致登革出血熱以及登革休克綜合征等病癥的具體致病機制尚不清楚，抗體依賴的感染增強作用(antibody-dependentenhancement,ADE)被認為在登革發(fā)病機制中起重要作用。該觀點認為，當已被登革感染的機體再次感染不同血清型的登革病毒時，其體內的非中和或亞濃度中和抗體可與該異型病毒形成抗原抗體復合物，進而增強病毒對靶細胞的感染，最終導致病情加重?；谏鲜隼碚?，登革疫苗要求能同時誘導針對登革病毒4個血清型的均衡的免疫應答，且應答水平需足夠高。另一方面，無論是小鼠還是非人靈長類動物，其感染登革病毒后僅能出現(xiàn)與人感染后相似的免疫應答，但其發(fā)病特征與人感染后的病癥相去甚遠。因此，缺乏合適的動物模型使得登革疫苗的研制較為緩慢。然而，隨著病毒學、分子生物學及相關學科技術的發(fā)展，登革疫苗的研究已經取得了很大進展。登革疫苗的研制始于20世紀二十年代，當時嘗試采用登革熱患者的滅活血清作為疫苗。由于此類疫苗免疫原性差，且需多次免疫，安全性亦未完全明確，因此難以應用于臨床。近些年來，一些新型的登革疫苗，如重組亞單位疫苗、DNA疫苗和復制子疫苗進展迅速。登革病毒prM-E和NSl蛋白是重組亞單位疫苗和DNA疫苗的重要靶標。大量的研究顯示，重組亞單位疫苗和DNA疫苗均能誘導小鼠和猴體產生有效的免疫應答，并能提供部分或完全的免疫保護。美國夏威夷生物科技公司利用果蠅表達系統(tǒng)開發(fā)了一種重組亞單位疫苗，在小鼠和猴模型中均可誘導高水平的免疫應答和完全的免疫保護。與上述疫苗類型相比，減毒活疫苗因其具有完整的病毒感染過程，進而能全面誘發(fā)機體產生體液和細胞免疫應答而更具優(yōu)勢。起初通過傳代法制備減毒活疫苗，但該方法效率低，減毒效果差，獲得的減毒株也易發(fā)生回復突變；特別是針對登革病毒4種血清型的免疫效力并不均衡，因此該項嘗試業(yè)已終止。上世紀八十年代以來，隨著反向遺傳學技術的興起，基因突變和嵌合減毒技術逐漸取代了傳統(tǒng)減毒方法。目前在登革病毒結構和非結構蛋白中已發(fā)現(xiàn)多個可能的毒力相關位點，對其進行定點誘變后獲得了諸 多減毒疫苗候選株。其中較為成功的是美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)NIAID傳染病實驗室構建的登革4型病毒3'-非編碼區(qū)(UTR)缺失30個核苷酸的突變株，其在小鼠模型和猴體中均產生減毒，并可誘導產生中和抗體及免疫保護。黃病毒屬成員具有相似的基因結構和功能相近的病毒蛋白，因此可以通過反向遺傳學技術將不同黃病毒進行相互嵌合，最終可獲得具有感染性的嵌合黃病毒顆粒。由于嵌合基因間存在功能的不協(xié)調，進而會影響病毒增殖的各個環(huán)節(jié)而使其毒力減弱，因此基因嵌合也是構建減毒株的有效途徑。當嵌合區(qū)段為PrM-E而骨架為減毒株時，即可獲得針對外源病毒的減毒疫苗候選株。乙型腦炎病毒減毒株SA14-14-2是由野毒株SA14通過在細胞和動物中不斷傳代和多輪空斑純化最終獲得。與野毒株SA14相比，SA14-14-2的毒力明顯減弱，對成鼠和猴等動物的致病性幾乎完全喪失。使用該減毒株研制的乙腦減毒活疫苗在我國使用人群超過3億，未見因疫苗接種而引發(fā)疾病的報告，安全性可靠。同時，SA14-14-2遺傳特征穩(wěn)定，基因組序列明確，與登革病毒基因組具有十分類似的結構特征，非常適合作為基因骨架用于嵌合疫苗的構建。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明所提供的DNA分子，是將乙腦病毒的基因組RNA對應的cDNA中的蛋白質A的編碼基因替換為蛋白質B的編碼基因得到的重組DNA ；所述蛋白質A為由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；所述蛋白質B為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。所述蛋白質A的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因I)序列表中序列3所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)所不的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質A的DNA分子；3)與I)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白質A的DNA分子。所述蛋白質B的編碼基因為如下I)-3)中任一所述的基因
I)序列表中序列4所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)所不的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質B的DNA分子；3)與I)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白質B的DNA分子。所述乙腦病毒為乙腦病毒SA14-14-2減毒株；所述重組病毒的基因組RNA對應的cDNA序列如序列表中序列6所示。所述重組DNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。含有所述DNA分子的表達盒、重組載體、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒也屬于 本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體為是在pANCR-Ll載體的多克隆位點間插入所述DNA分子得到的重組載體；所述pANCR-Ll載體的構建方法，包括以下步驟I)以克隆質粒pSP64為模板，擴增得到第2757位-2982位的phage sp6區(qū)的DNA片段；2)以克隆質粒pACYC177為模板，擴增得到第I位-2335位的DNA片段；3)將步驟2)得到的DNA片段和步驟I)中得到的DNA片段順次連接后，即得到pANCR-Ll 載體。所述重組病毒為將所述重組載體導入離體的哺乳動物細胞中得到的病毒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組病毒。本發(fā)明所提供的重組病毒，其基因組RNA對應的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗。本發(fā)明所提供的疫苗，其活性成分為所述重組病毒。所述重組病毒在制備疫苗中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述疫苗為預防登革病毒感染的疫苗。本發(fā)明提供的乙腦/登革2型嵌合病毒具有如下多方面優(yōu)點(I)所述乙腦/登革2型嵌合病毒是充分減毒的，因此安全性很高；(2)所述乙腦/登革2型嵌合病毒減毒特征穩(wěn)定，回復為野生型病毒的可能性極低；(3)所述乙腦/登革2型嵌合病毒只在細胞質中復制(即RNA病毒基因組的復制、病毒的組裝、成熟釋放等過程均在細胞質中進行)，其攜帶的病毒基因組無整合到宿主細胞基因組中的危險；(4)所述乙腦/登革2型嵌合病毒能誘導產生針對所述乙腦/登革2型嵌合病毒包膜蛋白所來源的黃病毒的良好的免疫應答；
(5)所述乙腦/登革2型嵌合病毒能夠在動物模型中保護動物免受致死劑量的所述外源黃病毒的攻擊。本發(fā)明所提供的乙腦/登革2型嵌合病毒作為登革疫苗用于預防登革病毒感染也具有良好的應用前景。


圖I為乙腦/登革2型嵌合病毒全長cDNA克隆的構建示意圖。圖2為從乙腦/登革2型嵌合病毒RNA中擴增乙腦和登革2型病毒特異序列的RT-PCR 結果。圖3為檢測乙腦/登革2型嵌合病毒表達乙腦和登革病毒特異蛋白的IFA結果。。
圖4為乙腦/登革2型嵌合病毒RNA的分段RT-PCR擴增結果。圖5為乙腦/登革2型嵌合病毒的空斑形態(tài)和直徑大小。圖6為乙腦/登革2型嵌合病毒在不同溫度下的生長特征。圖7為乙腦/登革2型嵌合病毒(CJD2)在不同細胞系中的增殖特征。圖8為乙腦/登革2型嵌合病毒(CJD2)免疫血清對乳鼠的保護試驗結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例I、構建以乙腦病毒減毒株為基因骨架的乙腦/登革嵌合病毒該實施例以乙腦病毒SA14-14-2減毒株為基因骨架構建乙腦/登革嵌合病毒，其中乙型腦炎病毒減毒株SA14-14-2的基因組RNA對應的cDNA序列如序列表中序列6所示，自5'端第I位-95位為5' UTR ;第96-476位為衣殼蛋白C的編碼基因(C);第477-2468位為缺失了 E蛋白羧基末端3個氨基酸殘基的prM-E蛋白的編碼基因(prM-E A3);第2469-2477位為E蛋白羧基末端的3個氨基酸殘基的編碼基因(E3);第2478位-10394位為非結構蛋白NS的編碼基因(NS);第10395-10977位為3' UTR(圖I)。一、乙腦SA14-14-2減毒株基因組5'和3'半分子的構建與鑒定乙腦SA14-14-2減毒株病毒基因組5'和3'半分子的構建與鑒定分為如下幾個步驟I、乙腦SA14-14-2減毒株基因組cDNA的制備按照RNeasy試劑盒(Qiagen公司產品)說明提取乙腦SA14-14-2減毒株(購自成都生物制品研究所)的基因組RNA(即JEV-RNA)。提取步驟如下將210 U I 病毒懸液與 700 U I RLT (RNeasy Lysis Buffer)和 7 U I P -疏基乙醇(3 -mercaptoethanol)的混合液震蕩混勻，加490 U I無水乙醇后劇烈混勻，得到裂解液，將裂解液加入吸附柱，12000rpm離心15s ;700 U I Rffl (RNeasy wash buffer)洗柱一次，12000rpm離心15s ；500 u I RPE (RPE是RNeasy試劑盒中的洗滌液)洗柱2次，IOOOOrpm30s ;空柱 IOOOOrpm 離心 Imin0 加 50 U I 無 RNase 的水，靜置 2min, 12000rpm 離心 Imin0加 2 ill RNase inhibitor?；靹蚝笾?_80°C 待用。以測序引物R13為反轉錄引物進行cDNA的合成。引物R13 :AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA。反轉錄反應的組分與反應條件如下
__體積(M)
JEV-RNA15R13 (IOnM)1.25
dNTP (2.5 mM each)10
水(RNasefree)6.25將上述反應組分混合均勻，置65°C 5min,冰浴2min。補加如下組分
權利要求
1.一種DNA分子，是將乙腦病毒的基因組RNA對應的cDNA中的蛋白質A的編碼基因替換為蛋白質B的編碼基因得到的重組DNA ； 所述蛋白質A為由序列表中序列I所不的氣基酸序列組成的蛋白質； 所述蛋白質B為由序列表中序列2所不的氣基酸序列組成的蛋白質。
2.根據(jù)權利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述蛋白質A的編碼基因為如下I)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質A的DNA分子； 3)與I)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白質A的DNA分子。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的DNA分子，其特征在于所述蛋白質B的編碼基因為如下I)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列4所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質B的DNA分子； 3)與I)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白質B的DNA分子。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于 所述乙腦病毒的基因組RNA對應的cDNA序列如序列表中序列6所示。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的DNA分子，其特征在于 所述重組DNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
6.含有權利要求1-5中任一所述DNA分子的表達盒、重組載體、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒。
7.一種重組病毒，其基因組RNA對應的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
8.一種疫苗，其活性成分為權利要求7所述的重組病毒。
9.權利要求7所述的重組病毒在制備疫苗中的應用。
10.根據(jù)權利要求8所述的疫苗或權利要求9所述的應用，其特征在于所述疫苗為預防登革病毒感染的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了以乙腦病毒減毒株為基因骨架的乙腦/登革嵌合病毒及其應用。本發(fā)明提供了一個DNA分子，是將乙腦病毒的基因組RNA對應的cDNA中的蛋白質A的編碼基因替換為蛋白質B的編碼基因得到的重組DNA；所述蛋白質A為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；所述蛋白質B為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。本發(fā)明所提供的以乙腦病毒減毒株為基因骨架的乙腦/登革嵌合病毒為含有所述DNA分子的重組病毒。本發(fā)明所提供的乙腦/登革2型嵌合病毒作為登革疫苗用于預防登革病毒感染也具有良好的應用前景。
文檔編號C12N1/15GK102796749SQ20111014022
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權日2011年5月27日
發(fā)明者秦成峰, 李玉華, 李曉峰, 于學東, 楊會強, 秦鄂德 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所, 成都生物制品研究所