專利名稱：提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌種選育方法，特別是涉及一種提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法。
背景技術(shù)：
安普霉素是由黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，為國(guó)家2000年批準(zhǔn)的二類新獸藥。該藥物對(duì)畜禽革蘭氏陰性菌和大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌活性，特別是對(duì)耐慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等抗生素的細(xì)菌仍有較強(qiáng)的抗菌作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性，是允許用于食品動(dòng)物但不需要制定殘留限量的藥物中的唯一一種抗生素。安普霉素可用于雞大腸桿菌、沙門氏桿菌和支原體引起的感染，作為藥物型飼料添加劑，能促進(jìn)增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。針對(duì)該藥物產(chǎn)生菌產(chǎn)抗性能的提高，目前主要采用物理和化學(xué)誘變劑誘變方法。 已發(fā)表的關(guān)于安普霉素菌種誘變文獻(xiàn)中，指出誘變劑進(jìn)行誘變可使安普霉素菌種產(chǎn)抗能力得到一定程度提高，或者推論安普霉素生物合成的途徑，但是未涉及運(yùn)用復(fù)合誘變劑來提高菌種產(chǎn)抗能力的方法，也未涉及保持誘變菌種產(chǎn)抗性能長(zhǎng)期穩(wěn)定的選育方法。鑒于誘變菌種極易產(chǎn)生回復(fù)性突變的特性，通過誘變途徑得到的產(chǎn)抗性能較高的菌種，產(chǎn)抗性能衰退快，正突變性能不易穩(wěn)定保持。同時(shí)，誘變后的菌種其遺傳性狀發(fā)生改變，原有的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)已經(jīng)不能使其最大發(fā)揮產(chǎn)抗能力，還應(yīng)通過營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的調(diào)整，優(yōu)化和篩選來使其產(chǎn)抗性能和潛力得到進(jìn)一步發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法，該方法能使安普菌種產(chǎn)抗性能得到大幅度的提升和長(zhǎng)久保持。本發(fā)明技術(shù)方案
提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法，包括以下步驟
(1)選取性能穩(wěn)定、一致的自然系列安普霉素菌種；
(2)收集原始出發(fā)菌種孢子，打碎過濾得到單孢子，分別取0.Iml的單孢子在2X1014 6 X 1014N + /cm2的范圍內(nèi)進(jìn)行不同劑量的N+離子注入；然后在15 20W紫外燈下照射30 90S，照射距離25 30cm，進(jìn)行IO3 IO8倍的稀釋，平皿涂布，33_36°C培養(yǎng)5_8天，得到首次復(fù)合誘變的單菌落；
(3)將各劑量下首次復(fù)合誘變的單菌落挑選50 200個(gè)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵；經(jīng)過一次初篩，1 3次復(fù)篩，選出產(chǎn)抗能力提高5%以上的正突變菌種；對(duì)選出的正突變菌種進(jìn)行2 3輪純化，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選后得到二次出發(fā)菌種；
(4)將二次出發(fā)菌種孢子打碎，過濾得到單孢子，然后進(jìn)行亞硝基胍誘變，誘變劑為 PH6. 0、濃度為1000-200(^g/ml亞硝基胍溶液，誘變后稀釋IO3-IO8倍，平皿涂布，在33_36°C下培養(yǎng)5-8天，得到二次復(fù)合誘變單菌落；
(5)將二次復(fù)合誘變單菌落80 150個(gè)再次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)過一次初篩，1 4次復(fù)篩，選出產(chǎn)抗能力提高5%以上的正突變菌種；對(duì)選出的正突變菌種進(jìn)行2 3輪純化，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選后得到三次出發(fā)菌種；
(6)對(duì)三次出發(fā)菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵配方的優(yōu)化和篩選，采用正交試驗(yàn)或者均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到優(yōu)化的培養(yǎng)基成分為以重量百分比計(jì)，豆餅粉3. 0-5. 0%，玉米淀粉2. 0-2. 5%，花生餅粉1. 0-2. 5%，葡萄糖2. 0-5. 0%，氯化銨0. 1-0. 5%，硫酸鎂0. 2-0. 8%，碳酸鈣0. 3-1. 0%，蛋白胨0. 5-2. 0%，豆油0. 5-1. 5%，淀粉酶為玉米淀粉量的0. 1%，用水定容，消前ρΗ7· 2 7. 6。所述選取性能穩(wěn)定、一致的自然系列安普霉素菌種是指對(duì)未經(jīng)誘變的自然系列菌種進(jìn)行2 3輪純化，從中挑選搖瓶產(chǎn)抗能力對(duì)單菌落進(jìn)行斜面?zhèn)鞔囼?yàn)，對(duì)3 4代斜面產(chǎn)抗能力穩(wěn)定的菌種進(jìn)行收集和保藏，作為原始出發(fā)菌種。所述離子注入時(shí)所用的離子注入機(jī)能量為30Kev，脈沖頻率為25Hz，真空度為
0.3Pa。所述遺傳穩(wěn)定性篩選時(shí)的具體方法對(duì)各菌種進(jìn)行3 4代斜面?zhèn)鞔?，斜面培養(yǎng)條件為33-36°C培養(yǎng)5-8天，對(duì)其中搖瓶產(chǎn)抗能力相對(duì)穩(wěn)定的菌種進(jìn)行保留。所述搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件是發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速為200r/min，在36°C 38°C培養(yǎng)4 6天。所述三次出發(fā)菌種經(jīng)發(fā)酵配方篩選后菌種的產(chǎn)抗能力提高8 %以上。所述培養(yǎng)基成分優(yōu)選為豆餅粉4. 0-5. 0%，玉米淀粉2. 0-2. 5%，花生餅粉
1.0-2. 5%，葡萄糖4. 0-5. 0%，氯化銨0. 1-0. 5%，硫酸鎂0. 2-0. 5%，碳酸鈣0. 3-1. 0%，蛋白胨 0. 5-1. 0%，豆油0. 5-1. 5%，淀粉酶為玉米淀粉量的0. 1%。本發(fā)明的積極有益效果
1.本發(fā)明通過使用N +注入、紫外線照射、亞硝基胍三種復(fù)合誘變方法提高安普菌種的產(chǎn)抗能力，有效提高了安普霉素的發(fā)酵水平，整體產(chǎn)抗能力水平較原始出發(fā)菌種提高 20% 30%，從而使該抗生素生產(chǎn)成本降低20 30%，經(jīng)濟(jì)效益明顯。2.本發(fā)明提供了一種新型的選育模式，通過多次搖瓶發(fā)酵，多次初篩、復(fù)篩，進(jìn)行 3 4代斜面?zhèn)鞔疾煸囼?yàn)，從中挑選產(chǎn)抗能力水平高且穩(wěn)定的菌種，可以使誘變菌種的優(yōu)良性狀得以長(zhǎng)久穩(wěn)定并保持下來，解決了誘變菌種回復(fù)突變快、生產(chǎn)意義低的難題。3.本發(fā)明采用改進(jìn)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，對(duì)其中影響菌種產(chǎn)抗能力較顯著的碳氮源物質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，使其更符合誘變菌種發(fā)生的變異特性，促使菌種產(chǎn)抗能力的提升。這種選育模式打破了過去“只重視菌種誘變、忽視營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)配合菌種”的傳統(tǒng)育種觀念，對(duì)微生物的育種模式進(jìn)行了進(jìn)一步地發(fā)掘和開發(fā)。4、本發(fā)明的選育模式可以借鑒到其它抗生素的篩選，如硫酸慶大霉素菌種等產(chǎn)孢放線菌或細(xì)菌的菌種誘變中，應(yīng)用范圍較廣。5、本發(fā)明得到的發(fā)酵液經(jīng)薄層層析法鑒定，斑點(diǎn)位置同于安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)位置，無妥布霉素組分，符合國(guó)家藥典規(guī)定。6、本發(fā)明得到的發(fā)酵液，經(jīng)提取得到硫酸安普霉素成品樣品，核算收率為75% 80%，對(duì)成品含量、干燥失重等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，符合國(guó)家藥典要求標(biāo)準(zhǔn)，說明本發(fā)明方法得到的高產(chǎn)抗菌種，能夠在工業(yè)化大生產(chǎn)中運(yùn)用。


圖1 本發(fā)明的安普霉素菌種選育方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)例1 提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法，工藝流程參見圖1。(1)性能穩(wěn)定、一致的自然系列菌種制備
對(duì)未經(jīng)誘變的自然系列菌種進(jìn)行2 3輪純化，從中挑選產(chǎn)抗能力穩(wěn)定的單菌落進(jìn)行斜面?zhèn)鞔囼?yàn)，對(duì)3 4代斜面產(chǎn)抗能力穩(wěn)定的菌種進(jìn)行收集和保藏，作為備用的原始出發(fā)菌種。(2)收集原始出發(fā)菌種孢子，打碎過濾得到單孢子，分別取三份0. Iml的單孢子進(jìn)行2X1014N + /cm2、3X1014N + /Cm2、4X1014N + /Cm2劑量的N +離子注入(注入設(shè)備俄羅斯 TITAN離子注入機(jī)，能量:30Kev ；脈沖頻率:25Hz ；真空度:3X10^ Pa)。再用20W紫外線燈照射，照射距離25cm，照射時(shí)間50S，然后進(jìn)行IO3 IO8倍的稀釋，平皿涂布分離，36°C培養(yǎng) 5-8天，得到首次復(fù)合誘變單菌落。(3)誘變前后，對(duì)安普霉素孢子進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，兩種誘變劑復(fù)合誘變后，其致死率為99. 94% 99. 99%。最佳的稀釋倍數(shù)分別為IO4 IO6UO3 IO6UO3 IO5倍。對(duì)得到的首次復(fù)合誘變單菌落的三個(gè)劑量共挑選150株，每劑量梯度里各挑50 株。最后，通過搖瓶發(fā)酵水平考察，搖瓶發(fā)酵6天，培養(yǎng)溫度38°C;經(jīng)過一次初篩、3次復(fù)篩， 挑選出產(chǎn)抗能力水平平均提高8%的正突變菌種3株。(4)對(duì)得到的正突變菌種挑選1個(gè)菌種，對(duì)其單孢子進(jìn)行2輪純化，進(jìn)行遺傳性能穩(wěn)定性篩選，通過連續(xù)3代斜面菌種的搖瓶產(chǎn)抗能力對(duì)比，得到2株遺傳性狀穩(wěn)定的復(fù)合誘變菌種，將該復(fù)合誘變菌種作為二次出發(fā)菌種。(5)上述的二次出發(fā)菌種選擇兩株，對(duì)其孢子混合打碎過濾，離心，棄去上清液，保留孢子。將PH6.0，濃度為lOOOPg/ml亞硝基胍溶液加入孢子離心管內(nèi)，震蕩均勻，37°C作用2小時(shí)，生理鹽水終止反應(yīng)；然后分別稀釋IO3 IO8倍，平皿涂布分離，36°C培養(yǎng)8天。亞硝基胍的配制將0. Ig亞硝基胍加入IOml甲酰胺內(nèi)，得到lOOOOPg/ml的亞硝基胍溶液。使用時(shí)，用pH6. 0的緩沖溶液進(jìn)行稀釋，稀釋為lOOOPg/ml或200(^g/ml。誘變前后，對(duì)安普霉素孢子進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，誘變劑復(fù)合誘變后，其致死率為 99. 97% 99. 99%ο(6)挑選單菌落120株進(jìn)行挑單和搖瓶發(fā)酵水平考察試驗(yàn)，搖瓶發(fā)酵6天，培養(yǎng)溫度38°C ；經(jīng)過一次初篩，3次復(fù)篩，得到產(chǎn)抗能力水平較二次出發(fā)菌種平均提高10%左右的正突變菌種2株。(7)對(duì)上述正突變菌種進(jìn)行3輪純化，挑選產(chǎn)抗能力水平較為穩(wěn)定的菌種5株，對(duì)其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選，通過1-4代連續(xù)4代斜面菌種的搖瓶產(chǎn)抗能力對(duì)比，從中挑選3株遺傳性狀穩(wěn)定的菌種，作為二次復(fù)合誘變菌種，對(duì)其孢子進(jìn)行收集，并使用砂土保藏。(8)對(duì)砂土保藏的二次復(fù)合誘變菌種進(jìn)行發(fā)酵配方篩選，使用正交試驗(yàn)?zāi)Ｊ剑罱K得到菌種水平進(jìn)一步提高的優(yōu)化發(fā)酵配方。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為豆餅粉5. 0%，玉米淀粉2. 5%，花生餅粉1. 0%，葡萄糖4. 0%，氯化銨0. 1%，硫酸鎂0. 2%，碳酸鈣0. 3%，蛋白胨0. 5%，豆油1. 5%，淀粉酶為淀粉量的 0. 1%，用水定容，消前PH7. 2 7. 6。搖瓶培養(yǎng)條件為38°C，6天。本例中調(diào)整前使用的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為
豆餅粉3. 5%，玉米淀粉1. 5%，花生餅粉1. 5%，葡萄糖5. 0%，氯化銨0. 4%，硫酸鎂0. 6%， 碳酸鈣0. 8%，蛋白胨1. 5%，豆油1. 2%，淀粉酶為玉米淀粉量的0. 1%，水定容。消前pH7. 2 7. 4，搖瓶培養(yǎng)條件為38°C，6天。通過發(fā)酵配方調(diào)整，使誘變菌種的產(chǎn)抗能力水平再次提高約11%。該培養(yǎng)基配方對(duì)同系列的其它誘變高產(chǎn)菌種進(jìn)行搖瓶考察試驗(yàn)，產(chǎn)抗能力水平提升水平一致，說明該配方可以用于該誘變的系列菌種。(9)將得到的發(fā)酵液按照薄層層析法進(jìn)行組分鑒定，其斑點(diǎn)位置同于安普霉素標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)位置，其發(fā)酵液內(nèi)不含妥布霉素組分，符合國(guó)家藥典規(guī)定。(10)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提純，提純步驟為調(diào)節(jié)發(fā)酵液至酸性、加732陽(yáng)樹脂、吸附、分離漂洗樹脂、解析、濃縮、成鹽、噴霧干燥等，得到硫酸安普霉素成品。發(fā)酵液進(jìn)行小試提取，提取收率為77. 5%，對(duì)硫酸安普霉成品按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005版第一部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)選取性能穩(wěn)定、一致的自然系列安普霉素菌種；(2)收集原始出發(fā)菌種孢子，打碎過濾得到單孢子，分別取0.Iml的單孢子在2X1014 6 X 1014N + /cm2的范圍內(nèi)進(jìn)行不同劑量的N+離子注入；然后在15 20W紫外燈下照射30 90S，照射距離25 30cm，進(jìn)行IO3 IO8倍的稀釋，平皿涂布，33_36°C培養(yǎng)5_8天，得到首次復(fù)合誘變的單菌落；(3)將各劑量下首次復(fù)合誘變的單菌落挑選50 200個(gè)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵；經(jīng)過一次初篩，1 3次復(fù)篩，選出產(chǎn)抗能力提高5%以上的正突變菌種；對(duì)選出的正突變菌種進(jìn)行2 3輪純化，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選后得到二次出發(fā)菌種；(4)將二次出發(fā)菌種孢子打碎，過濾得到單孢子，然后進(jìn)行亞硝基胍誘變，誘變劑為 PH6. 0、濃度為1000-200(^g/ml亞硝基胍溶液，誘變后稀釋IO3-IO8倍，平皿涂布，在33_36°C 下培養(yǎng)5-8天，得到二次復(fù)合誘變單菌落；(5)將二次復(fù)合誘變單菌落80 150個(gè)再次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)過一次初篩，1 4次復(fù)篩，選出產(chǎn)抗能力提高5%以上的正突變菌種；對(duì)選出的正突變菌種進(jìn)行2 3輪純化，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選后得到三次出發(fā)菌種；(6)對(duì)三次出發(fā)菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵配方的優(yōu)化和篩選，采用正交試驗(yàn)或者均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到優(yōu)化的培養(yǎng)基成分為以重量百分比計(jì)，豆餅粉3. 0-5. 0%，玉米淀粉2. 0-2. 5%，花生餅粉1. 0-2. 5%，葡萄糖2. 0-5. 0%，氯化銨0. 1-0. 5%，硫酸鎂0. 2-0. 8%，碳酸鈣0. 3-1. 0%，蛋白胨0. 5-2. 0%，豆油0. 5-1. 5%，淀粉酶為玉米淀粉量的0. 1%，用水定容，消前ρΗ7· 2 7. 6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征是，所述選取性能穩(wěn)定、一致的自然系列安普霉素菌種是指對(duì)未經(jīng)誘變的自然系列菌種進(jìn)行2 3輪純化，從中挑選搖瓶產(chǎn)抗能力對(duì)單菌落進(jìn)行斜面?zhèn)鞔囼?yàn)，對(duì)3 4代斜面產(chǎn)抗能力穩(wěn)定的菌種進(jìn)行收集和保藏，作為原始出發(fā)菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征是，所述離子注入時(shí)所用的離子注入機(jī)能量為30Kev，脈沖頻率為25Hz，真空度為0. 3Pa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征是，所述遺傳穩(wěn)定性篩選時(shí)的具體方法對(duì)各菌種進(jìn)行3 4代斜面?zhèn)鞔?，斜面培養(yǎng)條件為33-36°C培養(yǎng)5-8天，對(duì)其中搖瓶產(chǎn)抗能力相對(duì)穩(wěn)定的菌種進(jìn)行保留。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征是，所述搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件是發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速為200r/min，在36°C 38°C培養(yǎng)4 6天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征是，所述三次出發(fā)菌種經(jīng)發(fā)酵配方篩選后菌種的產(chǎn)抗能力提高8 %以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征是，所述培養(yǎng)基成分為豆餅粉4.0-5. 0%， 玉米淀粉2. 0-2. 5%，花生餅粉1. 0-2. 5%，葡萄糖4. 0-5. 0%，氯化銨0. 1-0. 5%，硫酸鎂 0. 2-0. 5%，碳酸鈣0. 3-1. 0%，蛋白胨0. 5-1. 0%，豆油0. 5-1. 5%，淀粉酶為玉米淀粉量的 0. 1%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高安普霉素菌種產(chǎn)抗能力的選育方法。先選取自然系列菌種，對(duì)單孢子進(jìn)行不同劑量的N＋離子注入并復(fù)合紫外線誘變，得到單菌落，經(jīng)搖瓶發(fā)酵和遺傳穩(wěn)定性篩選得到二次出發(fā)菌種，對(duì)二次出發(fā)菌種進(jìn)行亞硝基胍誘變，誘變后稀釋，平皿涂布，培養(yǎng)，得到二次復(fù)合誘變單菌落，再次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和遺傳穩(wěn)定性篩選得到三次出發(fā)菌種；對(duì)三次出發(fā)菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵配方的優(yōu)化和篩選，采用正交試驗(yàn)或者均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到優(yōu)化的培養(yǎng)基配方。本發(fā)明通過多次搖瓶發(fā)酵，多次初篩、復(fù)篩，從中挑選產(chǎn)抗能力水平較高且穩(wěn)定的菌種，可以使誘變菌種的優(yōu)良性狀得以長(zhǎng)久穩(wěn)定并保持下來，解決了誘變菌種回復(fù)突變快、生產(chǎn)意義低的難題，同時(shí)采用改進(jìn)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，促使菌種產(chǎn)抗能力的提升。
文檔編號(hào)C12N13/00GK102329787SQ20111014247
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者吳紅艷, 周志霞, 周超, 宗紅艷, 尤敏, 杜明勇, 種麗紅, 薛彩琴, 鄧慧敏, 陳文成, 高金鳳, 黃玉欣 申請(qǐng)人:濮陽(yáng)泓天威藥業(yè)有限公司