專利名稱：與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0377的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，特別是涉及一種與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記和引物在谷子育性基因定位或谷子遺傳育種中的用途。
背景技術(shù)：
我國是谷子(Setaria italica L. Beauv.)的原產(chǎn)國，是世界上谷子的集中種植國，谷子在我國的國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生產(chǎn)中占有重要的地位，對(duì)旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)有重要意義。因此，加速谷子的育種進(jìn)程尤為重要。由于谷子只是區(qū)域重要性作物，因此當(dāng)前有關(guān)谷 子的研究手段和方法相對(duì)較落后，如何應(yīng)用先進(jìn)科學(xué)的研究手段搞好谷子育種是一個(gè)嚴(yán)峻的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新 的思路和手段。開發(fā)具有我國特色的重要性狀基因的分子標(biāo)記并進(jìn)行輔助選擇育種研究，將對(duì)提高我國谷子育種水平起到促進(jìn)作用。谷子是最節(jié)水的谷類作物，用水量僅為玉米的1/2-2/3，是我國西部干旱地區(qū)和貧瘠山區(qū)解決糧食問題唯一現(xiàn)實(shí)的選擇。在耕地資源不斷減少、水資源日益短缺、平衡膳食熱逐漸升溫、畜牧業(yè)不斷發(fā)展的形勢(shì)下，大力推進(jìn)谷子產(chǎn)業(yè)既能增加糧食產(chǎn)出、促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展，又能推廣節(jié)水農(nóng)業(yè)、帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，一舉多得，社會(huì)效益顯著。谷子是典型的自花授粉作物，谷子的育性與否與谷子的育種關(guān)系密切，直接影響到谷子的育種工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供一種可用于PCR擴(kuò)增與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)，以及由該引物對(duì)擴(kuò)增獲得的分子標(biāo)記。本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標(biāo)記在谷子育性基因定位、檢測以及谷子輔助育種中的用途以及上述分子標(biāo)記的檢測方法。本發(fā)明的目的還包括提供一種包括上述分子標(biāo)記的載體，以及含有該載體的重組細(xì)胞；提供一種包括使用上述分子標(biāo)記的谷子育性基因的定位方法，和使用所述分子標(biāo)記的谷子輔助育種方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記含有SeqID No. I所示序列；優(yōu)選的所述分子標(biāo)記具有Seq ID No. I所示序列。需要指出的是,所述育性基因指谷子自交能夠結(jié)實(shí)的基因，即含有該基因的谷子樣本植株全穗籽粒均可育，可進(jìn)行自花授粉。本發(fā)明還公開了一種擴(kuò)增與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物對(duì)的引物I含有Seq ID No. 2所示序列，引物2含有Seq ID No. 3所示序列；優(yōu)選的所述引物I具有Seq ID No. 2所不序列，引物2具有Seq ID No. 3所不序列；Seq ID No. 2 :5，-TAGGCTTGTAGCACTTGCCT-3，；Seq ID No. 3 :5’ -TTCATGTCCTCGGGTATGAG-3’本發(fā)明還公開了一種與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記是由上述的引物對(duì)以育性的谷子基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。優(yōu)選的由上述引物對(duì)擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)為谷子基因組中Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SeqID No. I的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選的，為谷子基因組中Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只 要擴(kuò)增或者檢測育性的谷子基因組DNA中的該分子標(biāo)記，必然能夠檢測或擴(kuò)增到含有SeqID No. I所示的序列。Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當(dāng)長度，并不特別限定，例如，滿足分子標(biāo)記的長度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，000bp、小于 I, 500bp、小于 I, 200bp、小于 I, OOObp、或者小于 800bp。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No. I的5’端和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、酶切位點(diǎn)、引物序列等等。其中，術(shù)語“可操作地”在本發(fā)明中定義為一種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動(dòng)子被適當(dāng)?shù)刂糜赟eq IDNo. I的一個(gè)位置上，以致該控制序列指導(dǎo)Seq ID No. I編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明還公開了一種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標(biāo)記。所述重組載體可以是插入有本發(fā)明的分子標(biāo)記的表達(dá)載體或者克隆載體。獲得上述重組載體后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)不同的需要，將重組載體轉(zhuǎn)化到合適的細(xì)胞中，得到含有該重組載體的重組細(xì)胞。因此，本發(fā)明還公開了一種含有所述重組載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明還公開了本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟使用育性的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的608bp擴(kuò)增產(chǎn)物即含有所述分子標(biāo)記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以DNA化學(xué)合成的方法得到本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明還公開了所述分子標(biāo)記的檢測方法，包括步驟根據(jù)上述分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以被檢測谷子基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。優(yōu)選的，所述引物為上述分別含有Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的引物對(duì)。例如，可以以被檢測谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(Seq ID No. 2和SeqID No. 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢詫⒌玫降臄U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序或者凝膠電泳。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子育性基因定位或檢測中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子育性基因定位的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子輔助育種方法，所述方法包括檢測本發(fā)明的分子標(biāo)記或使用本發(fā)明中擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對(duì)的步驟。
本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記來篩選谷子是否含有控制育性的基因(例如，可以參考，DNA分子標(biāo)記在小麥抗病育種中的用途，隴東學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006年4月第16卷第I期，P65-69)。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對(duì)。所述檢測還可以通過測序方法進(jìn)行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明中，具體地，所述谷子可以為張谷I號(hào)、谷子A2不育系、張雜谷3號(hào)、或張雜谷3號(hào)自交產(chǎn)生的F2代。其中，張谷I號(hào)、張雜谷3號(hào)或張雜谷3號(hào)自交產(chǎn)生的部分F2代的表現(xiàn)型與父本張谷I號(hào)相同；谷子A2不育系、張雜谷3號(hào)自交產(chǎn)生的部分F2代與母本谷子A2不育系的表現(xiàn)型相同。由于采用以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于
本發(fā)明提供了與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記將基因組DNA序列與谷子育性基因聯(lián)系起來，有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與谷子育性基因的遺傳緊密連鎖距離為I. 75cM。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子育種實(shí)踐和資源及品種鑒定。


圖I :分子標(biāo)記引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)對(duì)F2代480個(gè)單株擴(kuò)增的部分結(jié)果。其中泳道1-12為F2代中12株表現(xiàn)型和基因型與父本相同的谷子單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13-24為F2代中12株表現(xiàn)型和基因型與母本相同的谷子單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道 M 為 marker，其為 IOObp DNA Ladder ;其分子量包括1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 以及 lOObp。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種引物對(duì)以及與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0377。利用本發(fā)明的引物對(duì)，以谷子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，可以得到與谷子育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記在本發(fā)明中命名為分子標(biāo)記SIsv0377。需要指出的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了通過上述PCR擴(kuò)增獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記外，還可以通過化學(xué)合成獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明的引物對(duì)分別含有序列表Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 :5，-TAGGCTTGTAGCACTTGCCT-3，；Seq ID No. 3 :5，-TTCATGTCCTCGGGTATGAG-3’本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在上述Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列中，可在其5 ’端或3’端分別增加I 10個(gè)堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)谷子基因組DNA上與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對(duì)原則來確定，由此得到的引物對(duì)與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3的擴(kuò)增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的5’端或3’端分別增加I 10個(gè)堿基并能擴(kuò)增得到基本相同DNA片段的引物對(duì)，均包括在本發(fā)明的引物對(duì)中。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物對(duì)優(yōu)選為Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列。
本發(fā)明將父本可育和母本部分不育的純合子雜交，獲得Fl代(張雜谷3號(hào)，可育)，再以Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共480個(gè)單株。優(yōu)選的采用SV分子標(biāo)記開發(fā)方法，首先對(duì)父本進(jìn)行 de novo 測序(60X contig N50 22K, scaffold N50 320K ；Total size 400Mb)，母本重測序(IOX);然后根據(jù)父母本測序數(shù)據(jù)，利用華大自主開發(fā)的SOAP軟件比較父母本之間的序列差異，分別在父本差異序列的5’端和3’端外側(cè)約50bp位置，隨機(jī)選取20bp左右的長度設(shè)計(jì)差異序列擴(kuò)增的引物，根據(jù)不同的差異序列設(shè)計(jì)了 1105對(duì)引物。以父母本及Fl的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從1105對(duì)引物中篩選出616對(duì)具有多態(tài)性和有效性的引物。采用開發(fā)出的616對(duì)引物，對(duì)F2群體的480個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Map Makerf. 0軟件進(jìn)行遺傳圖譜繪制，得到本發(fā)明所述的與育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，及其擴(kuò)增引物。采用篩選出的引物對(duì)擴(kuò)增得到的父本序列，即本發(fā)明中的分子標(biāo)記SIsv0377。對(duì)F2個(gè)體進(jìn)行性狀分析，并根據(jù)基因性狀數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)將谷子育性基因定位在遺傳圖譜上。下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例I :谷子F2代分離群體的構(gòu)建父本抗拿捕凈，株型高，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠，花粉黃白色，抽穗期為晚期。父本為張谷I號(hào)種子。母本不抗拿捕凈，株型矮，旗葉短而寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃，花粉棕色，抽穗期為早期。母本為谷子A2不育系種子。本發(fā)明中，上述母本的部分不育是指每一穗中大約5%的籽?？捎?，其余不育。F2群體構(gòu)建父本和母本雜交得到Fl代(Fl的表現(xiàn)型與父本的表現(xiàn)型相同)，F(xiàn)l自交得到F2。其中Fl是張雜谷3號(hào)種子。共得F2代單株480株。上述張谷I號(hào)種子、谷子A2不育系種子及張雜谷3號(hào)種子可參見中國專利申請(qǐng)《與谷子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0372》，
發(fā)明者張耕耘, 全志武, 張厚寶, 彭小華 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院