專利名稱：一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法。
背景技術(shù)：
雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)自1979年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，便因其對(duì)雞群引起的重大損失而受到研究者的關(guān)注。尤其CAV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，更是加速了對(duì)該病毒的研究。CAV的基因組是2. 3kb的單股環(huán)狀鏈DNA，由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分組成。編碼區(qū)的CAV基因組包含3個(gè)部分或完全重疊的開(kāi)放閱讀框(ORF)，分別命名為0RF1、0RF2和0RF3，大小分別為648bP、363bp和1350bp，其中，ORFl和0RF2完全重合，ORFl與0RF3部分 重疊，分別編碼VP2(24KD)、VP3(14KD)和VPl (52KD)的蛋白。而非編碼區(qū)內(nèi)則存在一個(gè)病毒復(fù)制的調(diào)控區(qū)和一個(gè)多聚腺苷化的信號(hào)區(qū)。有關(guān)研究表明VPl是CAV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，VP2為輔助蛋白，與病毒的裝配有關(guān)，而VP3是CAV的致病性蛋白，可誘導(dǎo)感染細(xì)胞的程序性死亡。現(xiàn)有的雞貧血病毒感染性分子克隆的構(gòu)建研究方法多采取將病毒基因組克隆到載體中，獲得大量質(zhì)粒后，再經(jīng)過(guò)酶切、體外環(huán)化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而獲得有感染性的病毒。在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題雞貧血病毒感染克隆的構(gòu)建的研究方法中，質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切后需要回收再進(jìn)行自我連接，而連接后的環(huán)狀基因組也只有經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇沉淀、純化后才可以轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且連接過(guò)程受到連接體系等因素的影響，每次的結(jié)果也很難達(dá)到一致，從而影響轉(zhuǎn)染效率，病毒拯救效率不一，而且不易于操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種易于操作、采用分子克隆技術(shù)成功獲得獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆的構(gòu)建方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法擴(kuò)增雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)全長(zhǎng)基因組DNA，將2個(gè)全長(zhǎng)基因組順向連接插入到pBluescript Π SK (+)質(zhì)粒載體中，獲得Psk2CAV質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆。本發(fā)明構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，具體包括以下步驟(I)獲取CAV全長(zhǎng)基因組DNA并擴(kuò)增從CAV Cux-I雞胚組織毒株中提取CAV Cux-I基因組DNA，以此為模板，用上游引物Pl和下游引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物用核酸凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物用Kpn I酶切后回收備用； (2)構(gòu)建重組質(zhì)粒PskCAV
將pBluescript TI SK (+)載體用KpnI酶切、回收純化后,再用堿性磷酸酶處理，回收純化后與步驟⑴所得的Kpn I酶切的基因組DNA片段建立10 μ L的連接體系，過(guò)夜連接；連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于Amp/LB/X-Gal/IPTG平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，用藍(lán)白斑篩選法挑選可能是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體的白斑；挑取單個(gè)白斑菌落，分別提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定后，從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒PskCAV。(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒Psk2CAV提取鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒PskCAV的DNA，摸索用KpnI酶切的最佳不完全酶切條件，將陽(yáng)性質(zhì)粒PskCAV的DNA用KpnI進(jìn)行不完全酶切，回收純化不完全酶切產(chǎn)物(回收片段為5200bp)，去磷酸化處理后，與步驟(I)中回收備用的基因組DNA片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，按步驟(2)所述方法篩選、鑒定陽(yáng)性的Psk2CAV重組質(zhì)粒；
(4)重組質(zhì)粒 Psk2CAV 轉(zhuǎn)染 MDCC-MSB1 細(xì)胞按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以2種DNA含量分別轉(zhuǎn)染，每種濃度設(shè)兩個(gè)重復(fù)，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)MDCC-MSB1細(xì)胞，當(dāng)孔底細(xì)胞生長(zhǎng)至約占孔底面積的70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，孔Al、A2每孔轉(zhuǎn)染3. 4 μ g/12 μ L，孔BI、B2每孔轉(zhuǎn)染4. 2 μ g/15 μ L,設(shè)空質(zhì)粒載體pBluescript TI SK(+)轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照,設(shè)超純水稀釋的脂質(zhì)體作為脂質(zhì)體毒性對(duì)照，3h后將所有培養(yǎng)液換成含10%新生牛血清的RPMI-1640，繼續(xù)在37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)，48h后細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，用常規(guī)法分別擴(kuò)大培養(yǎng)。所述步驟⑴中的上游引物P1，其序列為序列表中的SEQ ID NO. I 5， -GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3，；下游引物P1，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 2 5’ -AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3’。所述步驟(I)中PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L :取 5XPrimeSTAR Buffer 5 μ L,dNTP Mixture(2. 5mM)2. 0 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/μ L)0. 25 μ L,模板DNA(濃度為lng)2. 0μ L，上、下游引物各I μ L(上、下游引物濃度均為lOpmol/μ 1)，MgCl2 (25mM) O. 8 μ L，再用滅菌去離子水補(bǔ)足到25 μ L ;PCR反應(yīng)條件-MV 5min ；98°C 10s，70°C 3min 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是本發(fā)明以兩個(gè)基因組串聯(lián)的方式構(gòu)建感染性克隆，易于操作，不受其它因素影響；采用分子克隆技術(shù)將2個(gè)基因組順向連入一個(gè)載體的策略來(lái)構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆，成功獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆，為進(jìn)一步研究CAV生物學(xué)特性、致病機(jī)理及研制CAV基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的CAV基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的重組質(zhì)粒PskCAV的PCR鑒定電泳圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的重組質(zhì)粒PskCAV的Kpn I酶切鑒定電泳圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的重組質(zhì)粒Psk2CAV的NcoI酶切鑒定電泳圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的Psk2CAV轉(zhuǎn)染MDCC-MSBI細(xì)胞后的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果;
圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的胸腺和脾臟的病理變化圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的胸腺的組織病理變化圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的動(dòng)物試驗(yàn)中的PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法從CAVCux-I雞胚組織毒株中擴(kuò)增雞貧血病毒(chicken anemia virus, CA V)全長(zhǎng)基因組DNA,將2個(gè)全長(zhǎng)基因組順向連接插入到pBluescript Π SK (+)質(zhì)粒載體中，獲得Psk2CAV質(zhì)粒并 轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆。一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，具體包括以下步驟I、材料選擇(I)菌(毒)株、載體和細(xì)胞CAV Cux-I雞胚組織毒株由德國(guó)羅曼公司提供；pBluescript SK(+)載體購(gòu)自北京普京康生物科技有限公司；MDCC-MSB1細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5a菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。(2)主要試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase, dNTPS, 5 XPS Buffer 購(gòu)自寶生物工程有限公司；DNAMarker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Biospin組織基因組DNA提取試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博日科技有限公司；Kpn I酶、Nco I酶購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自羅氏公司；兔抗雞IgG突光抗體購(gòu)自Sigma公司。(3)試驗(yàn)動(dòng)物SPF雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。2、引物設(shè)計(jì)、合成及重組質(zhì)粒構(gòu)建方法(I)引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上的CAV Cux-I株序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增CAV全長(zhǎng)基因組，上游引物Pl為5’ -GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3，,下游引物Ρ2為5 -AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3 。其中，上游引物位置為1920 1940，下游引物位置為1925 1905，引入Kpn I酶切位點(diǎn)作為分子標(biāo)簽；引物由金思特科技(南京)有限公司合成。(2)重組質(zhì)粒Psk2CAV的構(gòu)建和鑒定a、CAV全長(zhǎng)基因組的獲取按照Biospin組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取CAV Cux-I基因組，以此為模板，用引物PU P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總體系為25 μ L :取5XPrimeSTAR Buffer 5 μ L，dNTPMixture(2. 5mM)2. O μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/μ L)0. 25 μ L,模板DNA(濃度為lng) 2.0 μ L，上、下游引物(上、下游引物Ρ1、Ρ2，濃度為IOpmol/μ I)各I μ L，MgCl2 (25mM) O. 8 μ L，再用滅菌去離子水補(bǔ)足到25 μ L ;PCR反應(yīng)條件94V 5min ；98°C 10s，70°C 3min 30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。擴(kuò)增后產(chǎn)物用核酸凝膠回收試劑盒回收?；厥蘸螽a(chǎn)物用Kpn I酶切，回收備用。b、重組質(zhì)粒PskCAV的構(gòu)建和鑒定將pBluescript Π SK (+)載體用KpnI進(jìn)行酶切、回收純化后,再用堿性磷酸酶處理、回收純化后與步驟a回收的Kpn I酶切的CAV全長(zhǎng)基因組建立10 μ L的連接體系，過(guò)夜連接(16°C，18h)。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于Amp/LB/X_Gal/IPTG平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，用藍(lán)白斑篩選法挑選可能是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體的 白斑。挑取單個(gè)的白斑菌落,分別提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR、酶切后，從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒PskCAV。PCR 鑒定 PskCAV 時(shí)，PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L :取 5 X PrimeSTAR Buffer 5 μ L, dNTPMixture (2. 5mM) 2. O μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ L) 0. 25 μ L，模板DNA (濃度 lng)2. 0μ L，上、下游引物(P1、P2，濃度 IOpmol/μ I)各 I μ L，MgCl2 (25mM) O. 8 μ L，再用滅菌去離子水補(bǔ)足到25 μ L ；PCR反應(yīng)條件-MV 5min ；98°C 10s, 70°C 3min 30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C10min。模板為質(zhì)粒PskCAV。C、重組質(zhì)粒Psk2CAV的構(gòu)建和鑒定提取鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒PskCAV的DNA，摸索找出最佳KpnI不完全酶切條件(37°C，酶用量O. 025 μ L，反應(yīng)時(shí)間IOmin)，將陽(yáng)性質(zhì)粒PskCAV的DNA用KpnI進(jìn)行不完全酶切，回收、純化不完全酶切的產(chǎn)物中5200bp的片段，去磷酸化處理后，與上述步驟(a)中的回收備用基因組DNA進(jìn)行連接(16°C，18h)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。用藍(lán)白斑篩選法挑取單個(gè)的白斑菌落培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定后，篩選出兩個(gè)基因組順向連入載體的陽(yáng)性重組質(zhì)粒Psk2CAV。(3)重組質(zhì)粒Psk2CAV轉(zhuǎn)染MDCC-MSBI細(xì)胞及鑒定a、重組質(zhì)粒Psk2CAV轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞按照羅氏公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以2種DNA含量分別轉(zhuǎn)染，每種濃度設(shè)兩個(gè)重復(fù)。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)MDCC-MSB1細(xì)胞，當(dāng)孔底細(xì)胞生長(zhǎng)至約占孔底面積的70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，孔A1、A2每孔轉(zhuǎn)染3. 4 μ g/12 μ L，孔B1、B2每孔轉(zhuǎn)染4. 2 μ g/15 μ L，設(shè)空質(zhì)粒載體pBluescript Π SK(+)轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照，設(shè)超純水稀釋的脂質(zhì)體作為脂質(zhì)體毒性對(duì)照，3h后將所有培養(yǎng)液換成含10%新生牛血清的RPMI-1640，繼續(xù)在37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)。48h后細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，用常規(guī)法分別擴(kuò)大培養(yǎng)。b、間接免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳4代后，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，檢測(cè)病毒復(fù)制情況。具體步驟如下取Iml細(xì)胞懸液于1.5ml EP管內(nèi)，1000r/min,離心IOmin,沉淀細(xì)胞,將沉淀的細(xì)胞用pH7. 4PBS洗兩遍。再用少量PBS將細(xì)胞均勻懸浮，然后涂于24孔板中央，待細(xì)胞干燥后，用冰冷的95%乙醇室溫固定lOmin。固定后，倒掉乙醇，用PBS洗二遍后，待細(xì)胞稍稍干燥后，加入I 400稀釋的抗CAV的多克隆抗體，37°C孵育lh，用PBS洗3遍，每次5min。稍稍干燥后，加入I 100稀釋的兔抗雞熒光抗體，37°C，30min，用PBS洗5遍，每次5min，晾干，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。(4)動(dòng)物試驗(yàn)將Psk2CAV質(zhì)粒用質(zhì)粒大提試劑盒大量提取，分別接種于10羽I日齡SPF雞的腿部肌肉，每羽雞接種100 μ g，作為Psk2CAV組；用CAV雞胚毒分別接種于10羽雞的腿部肌肉，每羽雞接種ΙΟΟμ g，作為陽(yáng)性對(duì)照；用生理鹽水分別接種于10羽雞的腿部肌肉，每羽雞接種ΙΟΟμ L，作為陰性對(duì)照。觀察各組的臨床表現(xiàn)，于接種后14d、21d分別剖檢，做病理切片及PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)的具體步驟為研磨肝臟，用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒提取CAV基因組。然后用P1、P2引物進(jìn)行初步PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件為94°C 5min ；98°C 10s,70°C 3min30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0本發(fā)明的試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果I、CAV全長(zhǎng)基因獲取以PI、P2為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增，可在雞胚組織中擴(kuò)增到約2300bp左右的片段，與預(yù)期片段大小相符(參見(jiàn)圖I)。圖I中1泳道為CAV Cux-I基因組，2泳道為陰性對(duì)照，3泳道為 DL 23000DNA Maker。2、重組質(zhì)粒PskCAV的鑒定 重組質(zhì)粒PskCAV的質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR后，可獲得2300bp左右的片段，和預(yù)期大小相符(參見(jiàn)圖2)。圖2中1泳道為重組質(zhì)粒PskCAV ；2泳道為DL 23000DNA Maker。將重組質(zhì)粒PskCAV的質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)Kpn I酶切后，可見(jiàn)大小分別為2300bp和2900bp兩條帶，與預(yù)期大小相符(參見(jiàn)圖3)。圖3中1泳道為DL 23000DNA Maker ；2泳道為重組質(zhì)粒PskCAV/KpnI03、重組質(zhì)粒Psk2CAV的構(gòu)建與鑒定通過(guò)調(diào)整Kpn I酶的濃度及作用時(shí)間，摸索到Kpn I最佳不完全酶切條件，然后進(jìn)行大量酶切、回收獲得約5200bp大小的片段，回收后進(jìn)行去磷酸化處理，與2300bp的基因組進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行Nco I酶切鑒定，得到兩條大小約為2300bP和5200bp的片段，酶切結(jié)果證實(shí)兩個(gè)基因組順向連入載體中(參見(jiàn)圖4)，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖4中I泳道為DL 15000DNA Maker，2泳道為重組質(zhì)粒Psk2CAV/NcoI。4、Psk2CAV轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)(間接免疫熒光檢測(cè))將轉(zhuǎn)染后的第4代細(xì)胞培養(yǎng)48h后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)圖5，說(shuō)明將CAV的雙基因以順向串聯(lián)的方式連入載體，可以直接轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞獲得有感染性的病毒。圖5中的I為轉(zhuǎn)染Psk2CAV質(zhì)粒的細(xì)胞，2為轉(zhuǎn)染pBluescript質(zhì)粒的細(xì)胞。5、動(dòng)物試驗(yàn)(I)病理學(xué)檢測(cè)分別于接種后14d、21d剖檢，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照組和注射Psk2CAV質(zhì)粒的試驗(yàn)組均有雞只表現(xiàn)腿肌、胸肌輕微出血，胸腺出現(xiàn)萎縮或出血(參見(jiàn)圖6)，圖6中1為陽(yáng)性對(duì)照；2為Psk2CAV組；3為陰性對(duì)照。同時(shí)每組各取3只雞的胸腺進(jìn)行組織病理學(xué)檢查(參見(jiàn)圖7)，圖7中1為陽(yáng)性對(duì)照；2為Psk2CAV組；3為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示陰性對(duì)照組胸腺無(wú)明顯變化，陽(yáng)性對(duì)照組胸腺小葉體積縮小，出血，淤血，髓質(zhì)部萎縮，淋巴細(xì)胞減少，注射感染性克隆Psk2CAV質(zhì)粒組變化與陽(yáng)性對(duì)照相似。(2) PCR 檢測(cè)每組各取6羽雞的肝臟研磨后，提取基因組DNA，用PCR檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照組和Psk2CAV組均擴(kuò)增出2300bp目的條帶，與預(yù)期條帶相符；陰性對(duì)照組未擴(kuò)增出條帶(參見(jiàn)圖 8)。圖 8 中:1、2、3、4、5 和 6 為陰性對(duì)照組;7、8、9、10、11 和 12 為 Psk2CAV 組；14、15、16、17、18 和 19 為陽(yáng)性對(duì)照組;13 為 DL 15000DNA Maker。
將豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)的雙拷貝基因組順向連入載體pBlueScript中，在體外證實(shí)其有感染性以后，將其直接接種豬體，可以產(chǎn)生與PCV2感染相似的病理變化。本發(fā)明考慮到CAV與PCV基因組結(jié)構(gòu)存在一定相似性，基因組都較小，以兩個(gè)基因組順向連接入載體構(gòu)建感染性克隆易于操作，受其它因素影響小，因此本發(fā)明也采取將2個(gè)基因組順向連入一個(gè)載體的策略來(lái)構(gòu)建CAV感染性分子克隆。為了證實(shí)2個(gè)基因是否順向連入載體，本研究利用CAV基因組內(nèi)存在單一的Nco I酶切位點(diǎn)，對(duì)重組質(zhì)粒Psk2CAV進(jìn)行Nco I酶切鑒定，由于Nco I位點(diǎn)位于基因組2129bp的位置，而引入的分子標(biāo)簽Kpn I位于1899bp位置，因此若Nco I酶切后得到兩條大小分別為3400bp、4200bp的片段，則證實(shí)兩個(gè)基因組反向連入載體中，若Nco I酶切后得到兩條大小約為2300bP和5200bp的片段，則證實(shí)兩個(gè)基因組順向連入載體中。本發(fā)明中，Nco I酶切鑒定結(jié)果證實(shí)兩個(gè)基因組順向連入載體(參見(jiàn)圖4)，為下一步CAV感染性分子克隆的構(gòu)建順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法擴(kuò)增雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)全長(zhǎng)基因組DNA,將2個(gè)全長(zhǎng)基因組順向連接插入到pBluescript TI SK (+)質(zhì)粒載體中，獲得Psk2CAV質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)獲取CAV全長(zhǎng)基因組DNA并擴(kuò)增 從CAV Cux-I雞胚組織毒株中提取CAV Cux-I基因組DNA，以此為模板，用上游引物Pl和下游引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物用核酸凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物用Kpn I酶切后回收備用； (2)構(gòu)建重組質(zhì)粒PskCAV 將pBluescript TI SK (+)載體用KpnI酶切、回收純化后,再用堿性磷酸酶處理、回收純化后與步驟(I)回收的Kpn I酶切的基因組DNA片段建立IOii L的連接體系，過(guò)夜連接；連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于Amp/LB/X-Gal/IPTG平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，用藍(lán)白斑篩選法挑選重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體；挑取單個(gè)菌落，分別提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR、酶切后，從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒PskCAV ； (3)構(gòu)建重組質(zhì)粒Psk2CAV 提取鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒PskCAV，摸索最佳Kpn I不完全酶切條件，將陽(yáng)性質(zhì)粒PskCAV進(jìn)行不完全酶切，回收純化不完全酶切產(chǎn)物，去磷酸化處理后，與步驟(I)回收備用的基因組DNA進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，按步驟(2)所述藍(lán)白斑篩選法篩選、鑒定陽(yáng)性的Psk2CAV重組質(zhì)粒； (4)重組質(zhì)粒Psk2CAV轉(zhuǎn)染MDCC-MSBI細(xì)胞 按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以2種DNA含量分別轉(zhuǎn)染，每種濃度設(shè)兩個(gè)重復(fù)，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)MDCC-MSB1細(xì)胞，當(dāng)孔底細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，孔Al、A2每孔轉(zhuǎn)染3. g/12ii L，孔B1、B2每孔轉(zhuǎn)染.4. 2 u g/15 u L,設(shè)空質(zhì)粒載體pBluescript TI SK(+)轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照,設(shè)超純水稀釋的脂質(zhì)體作為脂質(zhì)體毒性對(duì)照，3h后將所有培養(yǎng)液換成含10%新生牛血清的RPMI-1640，繼續(xù)在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，48h后細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，用常規(guī)法分別擴(kuò)大培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的上游引物 Pl 為5’ -GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3’ ；下游引物 Pl 為5’ -AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，其特征在于，所述步驟⑴中PCR反應(yīng)體系為25iiL:取5XPrimeSTAR Buffer 5 u L, dNTPMixture (2. 5mM) 2. 0 u L, PrimeSTAR MHS DNA Polymerase (2. 5U/ u L) 0. 25 u L,模板 DNA.2.Oii L，上、下游引物各Iii L，MgCl2 (25mM) 0.8 iiL，再用滅菌去離子水補(bǔ)足到25 y L ;PCR反應(yīng)條件94°C 5min ；98°C 10s,70°C 3min 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種構(gòu)建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法擴(kuò)增雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)全長(zhǎng)基因組DNA，將2個(gè)全長(zhǎng)基因組順向連接插入到pBluescript ∏ SK(+)質(zhì)粒載體中，獲得Psk2CAV質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆。本發(fā)明以兩個(gè)基因組串聯(lián)的方式構(gòu)建感染性克隆，易于操作，采用分子克隆技術(shù)，成功獲得CAV全長(zhǎng)基因感染性分子克隆，為進(jìn)一步研究CAV生物學(xué)特性、致病機(jī)理及研制CAV基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102807992SQ20111014907
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者李秀梅 申請(qǐng)人:天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心