專(zhuān)利名稱(chēng)：一種動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的方法，具體地，涉及用細(xì)胞工廠放大培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下(設(shè)定pH值、溫度、溶氧等)，在細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生 產(chǎn)生物制品的技術(shù)。其廣泛應(yīng)用于抗體、病毒疫苗等生物制品的研究開(kāi)發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)，是生物制品生產(chǎn)中的核心技術(shù)。實(shí)際生產(chǎn)工藝中，在大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)目的生物制品之前，首先要通過(guò)擴(kuò)增種子細(xì)胞獲得滿(mǎn)足生產(chǎn)需求的細(xì)胞數(shù)量。現(xiàn)常用的擴(kuò)增方法多為復(fù)蘇細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶(如方瓶、搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、攪拌瓶)逐級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的細(xì)胞后，接種至生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。因細(xì)胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積小，且單個(gè)培養(yǎng)瓶即為一個(gè)培養(yǎng)單位，這種方法具有占用空間大、操作繁瑣、單位體積細(xì)胞密度低、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不一致等缺點(diǎn)，對(duì)生物制品的生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率、質(zhì)量均具有一定影響。因此，需要一種可有效降低生物制品生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率和質(zhì)量的動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的方法。細(xì)胞工廠為一種新型細(xì)胞靜止培養(yǎng)裝置，又名cell factories或cell stack,通常由組織級(jí)聚苯乙烯制成，特別適合于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、也可用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，通常具有I層、2層、4層、10層及40層等規(guī)格。與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方式相比，細(xì)胞工廠具有低污染風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省空間，可全面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。但是應(yīng)用細(xì)胞工廠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞消化難度較大，具有消化后細(xì)胞活力低，細(xì)胞回收率低等問(wèn)題，限制了其在動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法占用空間大、操作繁瑣、細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)效率低、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不一致等缺點(diǎn)，提供一種新的動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，該方法用細(xì)胞工廠代替?zhèn)鹘y(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)前的細(xì)胞擴(kuò)增，其操作簡(jiǎn)單，可增加單位空間的生產(chǎn)規(guī)模，提高細(xì)胞活力與細(xì)胞回收率，從而提高細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)效率，并減少污染風(fēng)險(xiǎn)。將其應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)上游工藝中，可降低生物制品生產(chǎn)成本和勞動(dòng)力成本，提高生產(chǎn)效率與生物制品質(zhì)量。解決問(wèn)題的手段為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供以下方案。I. 一種動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的方法，其包括以下步驟I)在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞；2)對(duì)步驟I)中在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化，其包括以下步驟2-1)洗滌去除細(xì)胞工廠中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH7. 4-8. O的洗滌液洗滌所培養(yǎng)的細(xì)胞；2-2)消化去除步驟2-1)所述洗滌液，向細(xì)胞工廠中加入pH7. 4-8. O的消化液，輕輕前后晃動(dòng)細(xì)胞工廠確保消化液均勻流至每層，在36°C _38°C進(jìn)行細(xì)胞消化，其中，所使用消化液用量為20mL/層-80mL/層，當(dāng)大于60%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10體積％ -35體積％消化液繼續(xù)消化。2-3)收獲當(dāng)大于85%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，向細(xì)胞工廠內(nèi)加入含血清的或含消化液抑制劑的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并重懸細(xì)胞，重復(fù)加入1-3次所述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液并收集所得細(xì)胞懸液；3)將步驟2)中所獲得的細(xì)胞懸液接種至生物反應(yīng)器中，進(jìn)行生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)。2.根據(jù)上述方案I所述的方法，其中，步驟I)為將細(xì)胞工廠預(yù)熱至少I(mǎi)小時(shí)，使細(xì)胞工廠各層溫度均達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)溫度，添加細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞懸液至細(xì)胞工廠，細(xì)胞接 種密度為5 X IO3-I X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為36°C -38°C，細(xì)胞培養(yǎng)液pH7. 0-7. 8，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量為125mL/層 325mL/層。3.根據(jù)上述方案2所述的方法，其中，步驟I)中，細(xì)胞接種密度為IXIO4-IXiO5個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37°C，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量為125mL/層 300mL/層。4.根據(jù)上述方案I 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟2-1)中，所述的洗滌為向細(xì)胞工廠中加入洗滌液，洗滌液均勻流至每層后輕輕前后晃動(dòng)至少lmin，共洗滌1-5次，其中，所使用洗滌液用量為40mL/層-150mL/層。5.根據(jù)上述方案I 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟2-2)中，消化溫度為370C，所使用消化液用量為20mL/層-70mL/層，當(dāng)大于60%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10體積％ -30體積％消化液繼續(xù)消化。6.根據(jù)上述方案I 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，細(xì)胞培養(yǎng)液、洗滌液、消化液在使用前預(yù)熱至37 °C。7.根據(jù)上述方案I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟3)中的所述生物反應(yīng)器中添加有未貼附細(xì)胞的空微載體和新鮮培養(yǎng)液，接種后所述生物反應(yīng)器中微載體的終濃度為2-20g/L，所述細(xì)胞的接種密度為I X IO5至I X IO6個(gè)細(xì)胞/mL。8.根據(jù)上述方案I 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的洗滌液為無(wú)鈣離子且無(wú)鎂離子的平衡鹽溶液；所述的消化液為含O. 1-0. 5% (w/v)胰蛋白酶的無(wú)鈣離子且無(wú)鎂離子的平衡鹽溶液。9.根據(jù)上述方案I 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的洗滌液中還包含
O.01-0. 03% (w/v)的 EDTA ;所述的消化液中還包含 O. 01-0. 03% (w/v)的 EDTA。10.根據(jù)上述方案I 9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟I)和2)重復(fù)進(jìn)行，直至獲得步驟3)所需的細(xì)胞數(shù)量。發(fā)明效果本發(fā)明所述的方法中，采用細(xì)胞工廠代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)工藝中的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，應(yīng)用其實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)前的動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)，主要可實(shí)現(xiàn)以下的有益技術(shù)效果(I)節(jié)約生產(chǎn)空間，簡(jiǎn)化操作步驟，顯著節(jié)約了生產(chǎn)成本與勞動(dòng)力成本。(2)細(xì)胞活力大，細(xì)胞回收率高，細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)效率高。
(3)減少了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不均一，潛在污染威脅大等缺點(diǎn)，增加了生產(chǎn)工藝可控性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案如下I)在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)細(xì)胞；2)對(duì)步驟I)中在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化；3)將步驟2)中所獲得細(xì)胞懸液接種至生物反應(yīng)器中，進(jìn)行生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)。本發(fā)明方法中，優(yōu)選地，步驟I)為將細(xì)胞工廠預(yù)熱至少I(mǎi)小時(shí)，使細(xì)胞工廠各層溫度均達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)溫度，添加細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液至細(xì)胞工廠，細(xì)胞接種密度為5 X IO3-I X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為36°C -38°C，細(xì)胞培養(yǎng)pH7. 0-7. 8，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量為125mL/層 325mL/層。其中，細(xì)胞接種密度優(yōu)選為I X IO4-I X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度優(yōu)選為 37°C，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量?jī)?yōu)選為125mL/層 300mL/層。本發(fā)明中，可在上述步驟I)進(jìn)行至細(xì)胞生長(zhǎng)為單層，細(xì)胞匯合度不小于80%時(shí)進(jìn)行步驟2)。其中，步驟2)包括以下步驟2-1) 2-3)。2-1)洗滌去除細(xì)胞工廠中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH7. 4-8. O的洗滌液洗滌所培養(yǎng)的細(xì)胞。優(yōu)選地，步驟2-1)中所述的洗滌為向細(xì)胞工廠中加入洗滌液，洗滌液均勻流至每層后輕輕前后晃動(dòng)至少lmin，共洗滌1-5次，其中，所使用洗滌液用量為40mL/層_150mL/層。更具體地，上述步驟2-1)可以是倒出細(xì)胞培養(yǎng)液，向細(xì)胞工廠中加入40mL/層-150mL/層，優(yōu)選40mL/層_120mL/層洗滌液(加入方式如后所述)，洗滌液均勻的流至每層后輕輕前后晃動(dòng)至少lmin，以洗滌每層培養(yǎng)室培養(yǎng)表面并移除所有殘余細(xì)胞培養(yǎng)基及血清，倒出洗滌液。共洗滌1-5次，優(yōu)選2-3次，倒出洗滌液。通過(guò)采用上述優(yōu)選范圍，可徹底洗滌除去殘余細(xì)胞培養(yǎng)基及血清，同時(shí)不會(huì)洗滌過(guò)度使易于消化的細(xì)胞提前脫落。優(yōu)選地，上述洗滌液為無(wú)鈣離子且無(wú)鎂離子的平衡鹽溶液；所述的消化液為含
O.1-0.5% (w/v)胰蛋白酶的無(wú)鈣離子且無(wú)鎂離子的平衡鹽溶液。優(yōu)選地，所述的洗滌液中還包含O. 01-0. 03% (w/v)的EDTA ;所述的消化液中還包含O. 01-0. 03% (w/v)的EDTA,從而可以消化難被消化的細(xì)胞。本發(fā)明中所述EDTA 指乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)或其鹽如乙二胺四乙酸一鈉、乙二胺四乙酸二鈉。其主要作用在于排除Ca2+、Mg2+等維持完整性的離子，使細(xì)胞之間裂解，以分散細(xì)胞。本發(fā)明中所述平衡鹽溶液(Balanced Salt Solution BSS)又稱(chēng)生理鹽水或鹽溶液，其本身具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿度平衡的作用，同時(shí)能供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分；用以洗滌組織、細(xì)胞以及配置各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液，例如可為Ringer液、PBS 液、Tyrode 液、Earle 液、Hanks 液、Dulbecco 液、D-Hanks 液和 Eagle 液等平衡鹽溶液。由于鈣、鎂離子是細(xì)胞膜的重要組成成分，它們有促使細(xì)胞凝聚作用。因而配置離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時(shí)，宜采用鈣、鎂離子含量低的Dulbecco液和無(wú)鈣、鎂的D-Hanks液，或更為簡(jiǎn)單的PBS液。2-2)消化去除步驟2-1)所述洗滌液，向細(xì)胞工廠中加入pH7. 4-8. O的消化液，輕輕前后晃動(dòng)細(xì)胞工廠確保消化液均勻流至每層，在36°C _38°C進(jìn)行細(xì)胞消化，其中，所使用消化液用量為20mL/層-80mL/層；當(dāng)大于60%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10體積％ -35體積％消化液繼續(xù)消化。步驟2-2)中，消化溫度優(yōu)選為37 °C，所使用消化液用量?jī)?yōu)選為20mL/層_70mL/層，當(dāng)大于60%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10體積％ -30體積％消化液繼續(xù)消化。本發(fā)明中，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)液、洗滌液、消化液在使用前加熱至37°C。2-3)收獲當(dāng)大于85%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，向細(xì)胞工廠內(nèi)加入含血清的或含消化液抑制劑的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞，重復(fù)加入1-3次 所述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基并收集所得細(xì)胞懸液。本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟I)和2)重復(fù)進(jìn)行，直至獲得步驟3)所需的細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明的步驟3)中，將細(xì)胞工廠中獲得的細(xì)胞懸液按適宜細(xì)胞接種密度接種至生產(chǎn)規(guī)模的生物反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的溫度、培養(yǎng)液PH值、溶氧濃度等參數(shù)，使細(xì)胞生長(zhǎng)于最適宜環(huán)境中。步驟3)中的細(xì)胞培養(yǎng)方式可為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)與灌注培養(yǎng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的步驟3)中的所述生物反應(yīng)器中添加有未貼附細(xì)胞的空微載體和新鮮培養(yǎng)基，接種后所述生物反應(yīng)器中微載體的終濃度為2-20g/L，所述細(xì)胞的接種密度為I X IO5至I X IO6個(gè)細(xì)胞/mL。本發(fā)明中所說(shuō)的細(xì)胞工廠又名cell factories或cell stack,指由組織級(jí)聚苯乙烯制備而成的，特別適合于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、也可用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的，可應(yīng)用于如疫苗、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞靜止培養(yǎng)裝置，通常具有I層、2層、4層、10層及40層等五種規(guī)格。現(xiàn)常用的細(xì)胞工廠有如由賽默飛世爾科技提供的Nunc細(xì)胞工廠(Nunc Cell Factory)、NuncEasyFill 細(xì)胞工廠(Nunc EasyFi 11 Cell Factory) > Nunc活性通氣細(xì)胞工廠(Nunc Cell Factories for Active Gassing)和如由康寧(Corning)公司提供的聚苯乙烯細(xì)胞工廠-經(jīng)組織培養(yǎng)物處理表面(Polystyrene CellSTACK -TissueCulture Treated)、CellBIND 聚苯乙烯細(xì)胞工廠(CellBIND PolystyreneCell STACK )、聚苯乙烯細(xì)胞工廠-超低附著率表面(Polystyrene CellSTACKR-Ultra-Low Attachment)等。本發(fā)明中的細(xì)胞工廠,沒(méi)有特別限定，使用本領(lǐng)域中通常使用的細(xì)胞工廠。通常，細(xì)胞工廠加液方法有如下兩種(I)通過(guò)加樣蓋與管道加液在超凈工作臺(tái)下打開(kāi)細(xì)胞工廠包裝，取下加樣孔上的通氣蓋換上加樣蓋，將培養(yǎng)室側(cè)倒，加樣孔靠近底部，連接加樣蓋到經(jīng)過(guò)消毒的含有懸浮細(xì)胞的容器中；將裝有細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞懸液的容器提升至高于培養(yǎng)室的位置，松開(kāi)夾子使溶液流入培養(yǎng)室內(nèi)。如果室內(nèi)壓力增加，可以暫時(shí)松開(kāi)帶有濾膜的蓋子減小壓力或者降低加液速度；加液完成后將細(xì)胞工廠培養(yǎng)室轉(zhuǎn)90°，使加樣孔與透氣孔朝上，取下加樣蓋子，換上原裝的帶有濾膜的透氣蓋；輕輕放低細(xì)胞工廠培養(yǎng)室至水平培養(yǎng)位置并前后晃動(dòng)使細(xì)胞培養(yǎng)液完全覆蓋每個(gè)培養(yǎng)室表面，保證細(xì)胞能夠平鋪到每個(gè)表面上去。
(2)直接注入加液將細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞懸液裝于無(wú)菌瓶中，在超凈工作臺(tái)下打開(kāi)細(xì)胞工廠包裝，通過(guò)細(xì)胞工廠加樣口直接將溶液注入細(xì)胞工廠中；將細(xì)胞工廠朝有小口一側(cè)放置，平衡液面；將細(xì)胞工廠側(cè)向旋轉(zhuǎn)90度，使進(jìn)液口一面朝上，靜置使培養(yǎng)基平均分配至每一層腔室；雙手小心握住進(jìn)液口一側(cè)，將細(xì)胞工廠緩緩放倒至水平位。請(qǐng)勿抓握第一層邊緣，以免造成損壞。本發(fā)明的步驟I)中可采用上述兩種方法中的任一種?？赏ㄟ^(guò)空氣過(guò)濾器或通氣過(guò)濾器等附件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)氣體的需要。如在接口處連接空氣過(guò)濾器，內(nèi)部氣體可由此排出，使細(xì)胞工廠內(nèi)壓力不至于過(guò)高,外部空氣也可進(jìn)入?；蛉鐚⒒旌蠚怏w管道連接至通氣過(guò)濾器，利用外部壓力裝置通入細(xì)胞工廠中。本發(fā)明中，所述加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基中包含血清或胰蛋白酶抑制劑。所述含血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基是指含有動(dòng)物血清的新鮮液體培養(yǎng)基，所述動(dòng)物血清的終濃度可以為I 體積％至小于10體積％。所述動(dòng)物血清可以是牛血清(如胎牛血清)、馬血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一種或幾種。這里所述消化液抑制劑是指針對(duì)消化液中消化活性成分的抑制劑，所述抑制劑不應(yīng)影響被培養(yǎng)細(xì)胞的活性。例如，消化液中所含的消化活性成分可以為胰蛋白酶，相應(yīng)的消化液抑制劑可以為胰蛋白酶抑制劑(如大豆胰蛋白酶抑制齊U、南瓜胰蛋白酶抑制劑等)。所述消化液抑制劑的用量以能夠終止消化反應(yīng)為準(zhǔn)，一般根據(jù)消化液中具體的消化活性成分和消化液抑制劑的說(shuō)明書(shū)確定，例如，美國(guó)Sigma-Aldrich的Type I-S大豆胰蛋白酶抑制劑(Cat. No. T6522)，其活性為lmg所述大豆胰蛋白酶抑制劑可抑制l-3mg活性為每毫克蛋白約10000苯甲酰精氨酸乙酯單位(benzoyl arginineethyl ester(BAEE)unit)的膜蛋白酶。本發(fā)明中，根據(jù)需要可進(jìn)行細(xì)胞工廠之間的放大培養(yǎng)，例如可以由10層細(xì)胞工廠一次性或逐級(jí)放大至40層細(xì)胞工廠進(jìn)行培養(yǎng)。用于下一級(jí)生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量或用于下一級(jí)細(xì)胞工廠培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量也可由在多個(gè)細(xì)胞工廠中平行進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)獲得。另外，本發(fā)明的方法中，還可以包括在細(xì)胞工廠中放大培養(yǎng)細(xì)胞前，復(fù)蘇培養(yǎng)種子細(xì)胞，制備接種細(xì)胞工廠的細(xì)胞懸液的步驟。所述復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞的步驟可以按照本領(lǐng)域公知的操作來(lái)進(jìn)行，沒(méi)有特別限定，例如可以是在例如方瓶(T-flask)、轉(zhuǎn)瓶(Roller)或攪拌瓶的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞，挑選細(xì)胞形態(tài)較好的細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液用于接種細(xì)胞工廠。能夠用于本發(fā)明的生產(chǎn)生物制品的方法的宿主細(xì)胞可以為生物制品生產(chǎn)最常用的細(xì)胞，優(yōu)選為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或兼性貼壁細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞，如非洲綠猴腎細(xì)胞的傳代細(xì)胞系VeiO細(xì)胞、幼仔地鼠腎的傳代細(xì)胞系BHK21細(xì)胞、猴腎細(xì)胞的傳代細(xì)胞系Marcl45細(xì)胞或MA104細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的傳代細(xì)胞系CHO細(xì)胞、豬腎細(xì)胞的傳代細(xì)胞系PK15細(xì)胞、豬腎細(xì)胞的傳代細(xì)胞系IBRS-2細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞的傳代細(xì)胞系ST細(xì)胞或Mardin Darby犬腎細(xì)胞的傳代細(xì)胞系MDCK細(xì)胞等；例如人二倍體細(xì)胞，如2BS細(xì)胞、KMB-17、MRC-5 細(xì)胞等。能夠以利用本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的生物制品，均可利用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)體系來(lái)生產(chǎn)。例如可用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的人用狂犬病純化疫苗、脊髓灰質(zhì)炎滅活純化疫苗、腎綜合征出血熱純化疫苗、乙型腦炎純化疫苗、甲型肝炎疫苗，以及獸用狂犬疫苗和小反芻獸疫疫苗等，可用BHK21細(xì)胞生產(chǎn)的口蹄疫病毒疫苗、狂犬疫苗，可用Marcl45細(xì)胞或MA104細(xì)胞生產(chǎn)的豬藍(lán)耳病疫苗，可用PK細(xì)胞或ST細(xì)胞生產(chǎn)的豬瘟疫苗，可用ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞生產(chǎn)的豬細(xì)小病毒疫苗，可用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的乙肝疫苗，如分別使用2BS、KMB-17、MRC-5細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的甲型肝炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、風(fēng)疹減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗等。能夠用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器均可用于本發(fā)明的生物制品生產(chǎn)方法中，包括但不限于攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、固定床和流化床生物反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器、一次性生物反應(yīng)器等。本發(fā)明中所述動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或兼性貼壁細(xì)胞，其合適的生長(zhǎng)和/或增殖需要附著于培養(yǎng)基質(zhì)之上，所述培養(yǎng)基質(zhì)指用于吸附細(xì)胞的任何物質(zhì)。在方瓶、轉(zhuǎn)瓶等細(xì)胞培養(yǎng)瓶中或細(xì)胞工廠中所述培養(yǎng)基質(zhì)可以為細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞工廠用于細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)表面，在攪拌瓶或生物反應(yīng)器中，所述培養(yǎng)基質(zhì)可以為微載體、FibraCeI Disks載體或多孔載體等載體介質(zhì)。 本發(fā)明中所述載體沒(méi)有特別限定，可為所有能用于細(xì)胞培養(yǎng)的常用微載體，很多微載體都已經(jīng)是商業(yè)化產(chǎn)品，可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得。優(yōu)選所述微載體為Cytodex系列微載體、Cytopore系列微載體、Cytoline系列微載體和/或FibmCel Disks微載體。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明使用的各種試劑均可以商購(gòu)，也可以采用本領(lǐng)域常用的方法制備。用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑，不僅純度要求高，優(yōu)選分析純，而且不能存在任何影響細(xì)胞正常生理活動(dòng)的物質(zhì)，因此還需要符合醫(yī)藥制品的要求，優(yōu)選注射級(jí)原料藥。實(shí)施例實(shí)施例I細(xì)胞工廠-120L生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞生產(chǎn)藍(lán)耳病疫苗首先，復(fù)蘇液氮中凍存的Marcl45細(xì)胞，經(jīng)方瓶、轉(zhuǎn)瓶依次擴(kuò)增培養(yǎng)，最終擴(kuò)增至4個(gè)培養(yǎng)面積為850cm2的轉(zhuǎn)瓶中，消化獲得游離細(xì)胞懸液，其中，所用細(xì)胞培養(yǎng)液為適用于Marc 145細(xì)胞培養(yǎng)的改良DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(CatNo. MD210,北京清大天一科技有限公司)。將上述獲得細(xì)胞懸液分為等量的兩份，一份用于下述實(shí)驗(yàn)，另一份用于比較例I。然后，按照以下步驟在細(xì)胞工廠中進(jìn)行培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞的放大培養(yǎng)。I)在10層細(xì)胞工廠中培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞將I個(gè)10層細(xì)胞工廠(I個(gè)CF10，Coming公司生命科學(xué)部制造)在溫室中預(yù)熱I個(gè)小時(shí)，使細(xì)胞工廠各層溫度均達(dá)到37°C。將上述轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)消化所獲得的細(xì)胞懸液添加到預(yù)熱至37°C的細(xì)胞培養(yǎng)液中并混合均勻，然后用無(wú)菌的500mL Schott-Duran試劑瓶將混合液通過(guò)加樣口直接倒入細(xì)胞工廠培養(yǎng)室中。將培養(yǎng)室稍微傾斜減少泡沫產(chǎn)生，然后將培養(yǎng)室側(cè)放，使每個(gè)培養(yǎng)室液面達(dá)到平衡；將細(xì)胞工廠放入溫室培養(yǎng)細(xì)胞，其中細(xì)胞接種密度為4X104個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37°C，細(xì)胞培養(yǎng)液pH7. 2，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量為 200mL/層。2)消化在10層細(xì)胞工廠中培養(yǎng)的Marcl45細(xì)胞2-1)當(dāng)細(xì)胞工廠中細(xì)胞匯合度大于80%，細(xì)胞生長(zhǎng)為單層時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞消化。在超凈工作臺(tái)下擰開(kāi)并移除過(guò)濾蓋，倒出細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入50mL預(yù)熱至37°C的洗滌液，洗滌液均勻流至每層后輕輕前后晃動(dòng)lmin，棄去后再次加入洗滌液進(jìn)行洗滌，其中洗滌液為pH7. 6的含O. 02% (w/v)EDTA的無(wú)Ca離子且無(wú)Mg離子的磷酸緩沖液(PBS)。2-2)棄去洗滌液后加入40mL預(yù)熱至37°C的消化液，輕輕前后搖晃細(xì)胞工廠使消化液完全浸到細(xì)胞，在37°C進(jìn)行細(xì)胞消化。在約60%細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，棄去部分消化液,剩余30體積％消化液繼續(xù)進(jìn)行消化,其中消化液為pH 7. 6的含O. 2 %(w/v)胰蛋白酶的磷酸緩沖液(PBS)。2-3)繼續(xù)消化3min后約85%的細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，向細(xì)胞工廠中泵入含有5體積％小牛血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。將10層細(xì)胞工廠先側(cè)放使加入的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液均勻流至每層，然后使細(xì)胞工廠豎立并輕輕搖動(dòng)以重懸細(xì)胞。將所得細(xì)胞懸液泵入IOL滅菌桶中。按如上步驟再次加入含有5體積％小牛血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞重懸，并將所得細(xì)胞懸液同樣泵入上述IOL滅菌桶中，收集兩次所得的細(xì)胞懸液。利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)所得細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，所得結(jié)果除以消化前細(xì)胞數(shù)量估算結(jié)果，計(jì)算得到細(xì)胞回收率為99%。利用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)測(cè)得細(xì)胞活力為98%。
3) 120L生物反應(yīng)器微載體大規(guī)模培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞預(yù)先水化微載體，并對(duì)承載水化微載體的120L生物反應(yīng)器(北京清大天一科技有限公司)進(jìn)行在位清洗和滅菌。將步驟2)所得細(xì)胞懸液接種至所述120L生物反應(yīng)器中，其中，生物反應(yīng)器中添加有未貼附細(xì)胞的空微載體和新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)體積為70L，微載體Cytodex-I，微載體終濃度為5g/L，細(xì)胞的接種密度為2 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL ；在37°C、pH7. 2、溶氧50%的條件下，在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為2 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，利用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)測(cè)得所得細(xì)胞活力為98%。將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為維持培養(yǎng)液，按病毒感染復(fù)數(shù)MOI為O. 015的量接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株。病毒培養(yǎng)條件在37°C、pH7. 6、溶氧50%的條件下培養(yǎng)病毒。培養(yǎng)4天后收獲所得疫苗，檢測(cè)病毒滴度TCID5tl為8. O(IgTCID5tlAiL)。實(shí)施例2-4按照表I記載的條件，按照與實(shí)施例I相同的操作，進(jìn)行了實(shí)施例2-4，得到可用于下游生物制品生產(chǎn)的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。表I
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的方法，其包括以下步驟 1)在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞； 2)對(duì)步驟I)中在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化，其包括以下步驟 2-1)洗滌去除細(xì)胞工廠中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH7. 4-8. O的洗滌液洗滌所培養(yǎng)的細(xì)胞； 2-2)消化去除步驟2-1)所述洗滌液，向細(xì)胞工廠中加入pH7. 4-8. O的消化液，輕輕前后晃動(dòng)細(xì)胞工廠確保消化液均勻流至每層，在36°C _38°C進(jìn)行細(xì)胞消化，其中，所使用消化液用量為20mL/層-80mL/層，當(dāng)大于60%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10體積％ -35體積％消化液繼續(xù)消化。
2-3)收獲當(dāng)大于85%的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，向細(xì)胞工廠內(nèi)加入含血清的或含消化液抑制劑的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并重懸細(xì)胞，重復(fù)加入1-3次所述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液并收集所得細(xì)胞懸液； 3)將步驟2)中所獲得的細(xì)胞懸液接種至生物反應(yīng)器中，進(jìn)行生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟I)為將細(xì)胞工廠預(yù)熱至少I(mǎi)小時(shí)，使細(xì)胞工廠各層溫度均達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)溫度，添加細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞懸液至細(xì)胞工廠，細(xì)胞接種密度為5 X IO3-I X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為360C _38°C，細(xì)胞培養(yǎng)液pH 7. 0-7. 8，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量為125mL/層 325mL/層。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，步驟I)中，細(xì)胞接種密度為IX IO4-I X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37°C，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液用量為125mL/層 300mL/層。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟2-1)中，所述的洗滌為向細(xì)胞工廠中加入洗滌液，洗滌液均勻流至每層后輕輕前后晃動(dòng)至少lmin，共洗滌1-5次，其中，所使用洗滌液用量為40mL/層-150mL/層。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟2-2)中，消化溫度為37°C，所使用消化液用量為20mL/層_70mL/層，當(dāng)大于60 %的動(dòng)物細(xì)胞從細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10體積％ -30體積％消化液繼續(xù)消化。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，細(xì)胞培養(yǎng)液、洗滌液、消化液在使用前預(yù)熱至37 °C。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟3)中的所述生物反應(yīng)器中添加有未貼附細(xì)胞的空微載體和新鮮培養(yǎng)液，接種后所述生物反應(yīng)器中微載體的終濃度為2-20g/L,所述細(xì)胞的接種密度為I X IO5至I X IO6個(gè)細(xì)胞/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的洗滌液為無(wú)鈣離子且無(wú)鎂離子的平衡鹽溶液；所述的消化液為含0. 1-0. 5% (w/v)胰蛋白酶的無(wú)鈣離子且無(wú)鎂離子的平衡鹽溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的洗滌液中還包含0.01-0. 03% (w/v)的 EDTA ;所述的消化液中還包含 0. 01-0. 03% (w/v)的 EDTA0
10.根據(jù)權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟I)和2)重復(fù)進(jìn)行，直至獲得步驟3)所需的細(xì)胞數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明為一種動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的方法。該方法包括以下步驟1)在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞；2)對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化，包括2-1)去除培養(yǎng)液，用pH7.4-8.0的洗滌液洗滌所培養(yǎng)的細(xì)胞；2-2)去除該洗滌液，加入pH7.4-8.0的消化液，使消化液均勻流至每層，在36-38℃進(jìn)行細(xì)胞消化，消化液用量為20-80mL/層，當(dāng)大于60％的細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，去除部分消化液，剩余10-35體積％消化液繼續(xù)消化；2-3)當(dāng)大于85％的細(xì)胞從培養(yǎng)表面上脫落時(shí)，加入含血清或消化液抑制劑的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并重懸細(xì)胞，重復(fù)加入1-3次該培養(yǎng)液；3)將所得細(xì)胞懸液接種至生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102807964SQ20111014919
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者王建超, 高飛, 陳文慶, 張韌 申請(qǐng)人:北京清大天一科技有限公司