專利名稱：一種檢測豬瘟病毒的診斷方法和專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域的快速診斷技術(shù)，具體是一種檢測豬瘟病毒的診斷方法和專用試劑盒。
背景技術(shù)：
豬瘟病，又名“爛腸瘟”，美國稱豬霍亂，英國稱豬熱病，是由豬瘟病毒(classicalswine fever virus, CSFV)引起的一種豬的傳染病,其典型特征為高熱稽留和小血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等病變。豬瘟每年給養(yǎng)豬業(yè)都會造成巨大的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類動物疫病。我國將其列為一類動物疫病。到目前為止，豬瘟已經(jīng)存在了近2個世紀，雖然世紀各國對該病的防治都做了巨大努力，而且在北美、歐洲和北歐的一些地區(qū)還成功地消滅了豬瘟，但豬瘟在世界許多地區(qū) 仍廣泛傳播，并且其流行和發(fā)病的特點已發(fā)生了很大變化，許多病例屬于溫和型和隱性感染、持續(xù)感染，癥狀不典型，這給豬瘟的快速準確臨床診斷及有效地預防控制帶來了難度，不能及時將病豬進行隔離或淘汰。實驗室診斷方面，國內(nèi)外已建立了一些常規(guī)的檢測方法，如病毒的分離與鑒定、間接ELISA、IPMA、IFA及Dot-ELISA等血清學方法用于該病診斷。在這些診斷方法中，特異性、敏感性、操作節(jié)航速等方面存在各種各樣的問題，不能滿足生產(chǎn)需要。由于該病的癥狀多樣性及我國養(yǎng)豬業(yè)的實際情況，豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)的威脅將長期存在，因此，淘汰病原學陽性豬是該病防疫中主要措施，建立病原學快速檢測檢測技術(shù)非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)豬瘟病毒(CSFV)的基因組序列，設(shè)計I對豬瘟病毒的特異性擴增引物，結(jié)合高效RT-PCR商品試劑和市售的快速RNA提取試劑(TRIZOL)，經(jīng)實驗條件優(yōu)化，組合而成的一種成熟的一步法RT-PCR檢測試劑盒。該試劑盒能對檢組織樣品進行直接檢測，檢測過程簡單，交叉污染幾率小。從病料處理到獲得結(jié)果只需3. 5小時，結(jié)果準確且靈敏度高、特異性好，是目前豬瘟病毒檢測方法非常好的一種替代方法。本發(fā)明的主要技術(shù)方案有I.引物設(shè)計根據(jù)豬瘟病毒(CSFV)的序列，設(shè)計一對豬瘟病毒特異性擴增引物，引物詳細序列為CSFV 上游引物 5 ’ -GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3 ’CSFV 下游引物 5’ -TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3，其中CSFV上游引物/下游引物對在豬瘟病毒核酸中特異性擴增出510bp的產(chǎn)物。2.待檢病料的核酸提取采用市售RNA快速提取試劑(TRIZOL)提取待檢組織樣品的RNA核酸。3. RT-PCR 體系2 X I step Buffer 12. 5 μ L, PrimeScript I Step Enzyme MixI μ L，IOuM CSFV 上游引物 I μ L，IOuM CSFV 下游引物 I μ L，待檢 RNA 摸板 9· 5 μ L。4. RT-PCR 程序50°C逆轉(zhuǎn)錄 40min ;94°C 預變性 2min ;94°C變性 30s、59°C 退火45s、72°C延伸45s，30個循環(huán)；最后72°C延伸6min。4°C保存。本發(fā)明試劑盒組成及保存
RNA提取試劑(TRIZOL) 8mLXl瓶4°C保存
75%無水乙醇14mLXl瓶4°C保存
2X1 step Buffer250 μ LX I 管-2(TC保存
PrimeSc"ipt 1 SteP 20 μ I^X I 管_2(TC保存
bnzyme Mix
IOuM CSFV上游引物20 μ LX I管_20°C保存
IOuM CSFV上游引物20 μ LX I管_20°C保存
RNase Free H20500 μ LX I 管-20O保存
DL2000 Marker60 μ LX I 管-20°C保存
上樣緩沖液25 μ LX I管4°c保存
溴化已錠30 μ LX I管4°C保存
陽性對照500 μ L X I管-20 V保存本發(fā)明試劑盒有效期12個月。本發(fā)明的優(yōu)點I.操作簡便，省時省力。本發(fā)明采用市售的RNA快速提取試劑(TRIZOL)提取待檢樣品RNA，經(jīng)過條件優(yōu)化，在30min，即可完成總RNA提取過程。結(jié)合商品化的一步法RT-PCR試劑，在一次反應(yīng)中，完成反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增，比常用的二步法RT-PCR操作簡便，省時省力。2.交叉污染幾率低。由于反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)在同一個過程中進行，避免了二步法RT-PCR過程中加樣所造成的PCR污染。3.特異性強、重復性好、靈敏度高。本試劑盒僅對豬瘟病毒的核酸有擴增產(chǎn)物，對豬偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒、藍耳病毒、乙腦病毒牛病毒性腹瀉病毒及未接種病毒的牛睪丸細胞及ST細胞培養(yǎng)液的核酸無擴增產(chǎn)物；對豬瘟病毒疫苗毒及豬瘟病毒陽性病料檢測結(jié)果重復性100% ;對經(jīng)過1000倍稀釋的臨床陽性病料的核酸提取液有穩(wěn)定的檢測結(jié)果。


圖I本發(fā)明試劑盒的電泳檢測結(jié)果圖。其中豬瘟疫苗毒(I泳道)、豬偽狂犬病毒(2泳道)、圓環(huán)病毒(3泳道)、藍耳病毒(4泳道)、乙腦病毒(5泳道)、豬細小病毒出泳道)、牛病毒性腹瀉病毒(7泳道)及未接種病毒的牛睪丸細胞(8泳道)及ST細胞培養(yǎng)液(9泳道)、滅菌水(10泳道)M泳道為DNA DL2000Marker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)。圖2本發(fā)明試劑盒對部分樣品的檢測結(jié)果圖。I泳道、4泳道、5泳道為檢測樣品陽性，其余泳道為檢測樣品陰性。
具體實施例方式I.樣品制備I. I組織樣品取疑似豬瘟的病料(腎臟、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體)I 4g于無菌研缽，研磨并用Hanks液或PBS稀釋成I : 4乳劑，分裝I. 5ml滅菌Ep管，反復凍融2 3次，8000r/min離心5分鐘，取上清200 μ L進行核酸提取。I. 2陽性對照直接去200 μ L進行核酸提取。I. 3陰性對照直接去200 μ L RNase Free H2O進行核酸提取。2.操作步驟
2. I取200 μ L處理好的待檢樣品，移入新的I. 5mL滅菌EP管中，加入400 μ L RNA提取試劑，反復顛倒幾次混勻，室溫放置5 10分鐘。2. 2加入200 μ L氯仿，漩渦振蕩15秒混勻。室溫下放置2 3分鐘。2. 3 12000r/min離心10分鐘，取上層水相(注意切勿吸取到里兩相之間的雜質(zhì))，轉(zhuǎn)移到一個新的Ep管中，再加入等體積異丙醇混勻，室溫放置10分鐘。2. 4 12000r/min離心10分鐘，棄去上清，加入75%無水乙醇700 μ L，充分洗滌沉淀RNA后，12000r/min離心5分鐘，小心吸去上清(注意嚴格防止RNA丟失)。2. 5用潔凈吸水紙吸干管壁的75%無水乙醇，室溫放置2 3分鐘。用20 μ LRNaseFree H2O溶解，即為模板，即用或_70°C凍存?zhèn)溆谩?. 6去9. 5 μ L模板，加入只RT-PCR體系中，混勻。2. 7置于PCR儀中，進行如下程序50°C逆轉(zhuǎn)錄40min ;94°C預變性2min ;94°C變性308、591退火458、721延伸45s，30個循環(huán)；最后72°C延伸6min。4°C保存。2. 8取5 μ L PCR產(chǎn)物，混合I μ L上樣緩沖液，I %的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以DNA分子量標準DL2000為參考。2. 9在陰性對照無產(chǎn)物、陽性對照有明顯510bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)510bp大小條帶定為CSFV核酸陽性。
權(quán)利要求
1.一對用于擴增豬瘟病毒特異性檢測引物，其序列為CSFV上游和CSFV下游 CSFV 上游引物5’ -GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3’ ； CSFV 下游引物5’ -TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3’ ； 在豬瘟病毒核酸中特異性擴增目的片段大小為510bp。2. 一種豬瘟病毒一步法RT-PCR檢測試劑盒，其特征為 采用市售的RNA提取試劑(TRIZOL)對待檢樣品進行RNA提取，按如下的RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，用權(quán)利要求I所述的CSFV上游/CSFV下游引物進行豬瘟病毒的一步法RT-PCR擴增檢測，RT-PCR體系2X1 st印 Buffer 12. 5 μ L,PrimeScript I St印 Enzyme Mixl μ L, IOuMCSFV上游引物I μ L，IOuM CSFV下游引物I μ L，待檢RNA摸板9. 5 μ L ; RT-PCR 程序50°C逆轉(zhuǎn)錄 40min ;94°C預變性 2min ;94°C變性 30s、59°C退火 45s、72°C延伸45s，30個循環(huán)；最后72°C延伸6min。4°C保存； 核酸電泳檢測取5 μ L PCR產(chǎn)物，混合I μ L上樣緩沖液，I %的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以DNA分子量標準DL2000為參考； 結(jié)果判定在陰性對照無產(chǎn)物、陽性對照有明顯510bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)510bp大小條帶定為CSFV核酸陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)GenBank上的豬瘟病毒(CSFV)的基因組核酸序列，設(shè)計一對豬瘟病毒的特異性檢測引物，結(jié)合市售的病毒RNA提取試劑盒(TRIZOL)高效的RT-PCR商品化試劑，經(jīng)過條件優(yōu)化，組合而成的一種一步法RT-PCR檢測試劑盒。該試劑盒能對待檢樣品進行直接檢測，檢測過程簡單，省時省力。從病料處理到獲得結(jié)果需要3.5小時，本方法具有靈敏度高，檢測結(jié)果準確、特異等優(yōu)點，是目前豬瘟病毒病進行快速檢測的一種好方法。
文檔編號C12Q1/70GK102816864SQ20111015268
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者王金良, 沈志強, 祖立闖, 曲光剛, 唐娜, 管宇 申請人:山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院