專利名稱：雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化α “淀粉酶的方法。
背景技術(shù)：
真菌α -淀粉酶是由曲霉屬微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一種α _淀粉酶。與細(xì)菌α _淀粉酶不同的是，真菌α-淀粉酶的最適作用溫度為55°C左右，超過60°C開始失活；其水解淀粉的產(chǎn)物主要是高含量的麥芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而細(xì)菌α-淀粉酶最適作用溫度高(中溫α-淀粉酶70 80°C，耐高溫α-淀粉酶為95 105°C )，水解淀粉的主要產(chǎn)物是糊精。因此，細(xì)菌α-淀粉酶只能用于發(fā)酵工業(yè)，而真菌α-淀粉酶則廣泛地應(yīng)用于淀粉糖漿、低聚糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的生產(chǎn)，具有十分廣闊的市場前景。目前采用硫酸銨鹽析法、離心噴霧干燥法等分離淀粉酶的方法存在樣品回收率低、分離材料或設(shè)備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題；而且經(jīng)硫酸銨鹽析法分離方法得到的α-淀粉酶含有較多雜質(zhì)，效價低，且不能直接應(yīng)用于食品工業(yè)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前采用硫酸銨鹽析法、離心噴霧干燥法等分離淀粉酶的方法存在樣品回收率低、分離材料或設(shè)備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題，以及經(jīng)硫酸銨鹽析法分離方法得到的α-淀粉酶含有較多雜質(zhì)，效價低，且不能直接應(yīng)用于食品工業(yè)中的缺陷，而提供的一種雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法。雙水相萃取分離α -淀粉酶按以下步驟進(jìn)行一、制備真菌α -淀粉酶粗酶液；二、配制PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500、24%的(NH4)2SCV20%的NaCl和余量的去離子水組成；三、按真菌α-淀粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調(diào)節(jié)PH值為6. 5，然后室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4)2S04雙水相的上層液相與質(zhì)量濃度為35%的(NH4)2S04水溶液構(gòu)成雙水相純化體系，進(jìn)行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液透析濃縮，即得到 α-淀粉酶。本發(fā)明方法能夠更高效的分離純化α-淀粉酶，α-淀粉酶的酶回收率達(dá)85%以上；而且成本低廉、可適用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明方法所獲得的α-淀粉酶純度高達(dá)98%以上、雜質(zhì)少，所以可用于食品工業(yè)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式雙水相萃取分離α -淀粉酶按以下步驟進(jìn)行一、制備真菌α -淀粉酶粗酶液；二、配制PEG/(NH 4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500(PEG1500)、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和余量的去離子水組成；三、按真菌α-淀粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調(diào)節(jié)PH值為6. 5，然后室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4)2S04雙水相的上層液相與質(zhì)量濃度為35%的(NH4)2S04水溶液構(gòu)成雙水相純化體系，進(jìn)行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液透析濃縮，即得到 α-淀粉酶。本實(shí)施方式方法可適用于不同發(fā)酵α -淀粉酶的真菌，具有適用性廣的特點(diǎn)。通過正交試驗(yàn)證明各種因素對試驗(yàn)影響的主次順序?yàn)榫垡叶?500(PEG1500) 的濃度> (NH4)2SO4的濃度> !1值> NaCl的濃度。雖然固定(NH4)2SO4濃度不變、再調(diào)節(jié) PH值為7.0的條件下，隨著PEG1500濃度的增加，上層液相中α -淀粉酶的含量逐漸升高， 當(dāng)PEG/(NH4)2SO4I水相中PEG1500濃度達(dá)到70% (W/W)時上層液相中α -淀粉酶的含量為83.371%。但是，由于PEG的濃度過高，其疏水性增加，α -淀粉酶有向下層液相分配的趨勢，對下一步驟的純化造成不利，影響α-淀粉酶的實(shí)際回收率。本實(shí)施方式降低了 PEG1500的濃度，卻通過合理的控制(NH4)2SO4的濃度、ρΗ值及 NaCl的濃度提高了 α -淀粉酶的酶回收率。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中用米曲霉 2197、米曲霉ZLA16、米曲霉ZLB35、米曲霉ZLC06、米曲霉ZLD14、米曲霉ZLE09或米曲霉 ZLF13發(fā)酵真菌α-淀粉酶粗酶液。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二的不同點(diǎn)是步驟四中取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用PEG6000透析濃縮。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式雙水相萃取分離α -淀粉酶按以下步驟進(jìn)行一、制備真菌α -淀粉酶粗酶液將28°C察式培養(yǎng)基培養(yǎng)4天的米曲霉ZLE09菌體用生理鹽水洗脫兩次，合并洗脫液；再將洗脫液放置于28°C、300r/min的搖床中進(jìn)行孢子打散30min，制成單孢子懸液，調(diào)整單孢子濃度為108(^11/!^，然后將經(jīng)過單孢子濃度調(diào)整的單孢子懸液以2.5% (V/V)的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基按蛋白胨2g、NaCl lg、牛肉膏l(xiāng)g、可溶性淀粉0.4g和蒸餾水200mL的比例組成，發(fā)酵培養(yǎng)基ρΗ值為7. 0)中，再置于28°C、180r/min環(huán)境中培養(yǎng) 4天，之后在8000r/min的離心條件下，離心20min、棄去菌體，即得到真菌α -淀粉酶粗酶液；二、配制PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500(PEG1500)、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和余量的去離子水組成；三、按真菌α-淀粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調(diào)節(jié)PH值為6. 5，然后室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4) 2S04雙水相的上層液相與質(zhì)量濃度為35 %的(NH4) 2S04 水溶液構(gòu)成雙水相純化體系，進(jìn)行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用PEG6000透析濃縮，即得到α-淀粉酶。α -淀粉酶酶活力的測定方法在IOmL的試管中加入2. 5mL pH6. 0的NaH2PO4-檸檬酸緩沖液和ImL質(zhì)量濃度為 0.5%的可溶性淀粉溶液，60°C水浴預(yù)熱IOmin后，加入η倍稀釋的真菌α -淀粉酶粗酶液 5mL，60°C水浴保溫5min后，加入ImL 0. lmol/L的H2SO4終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。吸取2mL反應(yīng)液與0.5mL 0.5%稀碘液顯色，測定OD62tl值。與淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得反應(yīng)液淀粉濃度后計算酶活力。酶活力單位定義(U/mL)在pH6.0、溫度60°C，5min水解可溶性淀粉Img 所需的酶量為1個酶活力單位。酶活力的計算公式(0· 1% -C&) XnXlOOO0.1%:底物濃度 Cfi 反應(yīng)液淀粉濃度η 稀釋倍數(shù)1000 置換系數(shù)α -淀粉酶的酶回收率的測定方法步驟三分相后讀取上下液相的體積(Vt——上層液相體積和Vb——下層液相體積，mL)，用吸管吸取上層液相和下層液相液體各2mL于IOmL試管中，根據(jù)α -淀粉酶酶活力的測定方法進(jìn)行酶活的測定(Ut——上層液相中α-淀粉酶酶活力和Ub——下層液相中 α -淀粉酶酶活力，U/mL)。相比R = Vt/Vb，分配系數(shù)Ka = Ut/Ub，α -淀粉酶的酶回收率 Yt = RXKa/(1+R) X 100%經(jīng)檢測本實(shí)施方式的α -淀粉酶的酶回收率為85. 315%，所獲得的α -淀粉酶純度高達(dá)98% [RZ(酶的純度)=A360A420 = 3. 2]以上、雜質(zhì)少。本實(shí)施方式PEG/(NH4)2SO4I水相中PEG1500的濃度為34%，降低了 PEG1500的使用量，并大幅提高了 α-淀粉酶的酶回收率。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式雙水相萃取分離α -淀粉酶按以下步驟進(jìn)行一、制備真菌α -淀粉酶粗酶液將28°C察式培養(yǎng)基培養(yǎng)4天的米曲霉ZLF13菌體用生理鹽水洗脫兩次，合并洗脫液；再將洗脫液放置于28°C、300r/min的搖床中進(jìn)行孢子打散30min，制成單孢子懸液，調(diào)整單孢子濃度為108(^11/!^，然后將經(jīng)過單孢子濃度調(diào)整的單孢子懸液以2.5% (V/V)的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基按蛋白胨2g、NaCl lg、牛肉膏l(xiāng)g、可溶性淀粉0.4g和蒸餾水200mL的比例組成，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為7. 0)中，再置于28°C、180r/min環(huán)境中培養(yǎng) 4天，之后在8000r/min的離心條件下，離心20min、棄去菌體，即得到真菌α -淀粉酶粗酶液；二、配制PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500(PEG1500)、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和余量的去離子水組成；三、按真菌α-淀粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調(diào)節(jié)PH值為6. 5，然后室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4) 2S04雙水相的上層液相與質(zhì)量濃度為35 %的(NH4) 2S04 水溶液構(gòu)成雙水相純化體系，進(jìn)行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用 PEG6000透析濃縮，即得到α-淀粉酶。
α -淀粉酶酶活力的測定方法在IOmL的試 管中加入2. 5mL pH6. 0的NaH2PO4-檸檬酸緩沖液和ImL質(zhì)量濃度為 0.5%的可溶性淀粉溶液，60°C水浴預(yù)熱IOmin后，加入η倍稀釋的真菌α -淀粉酶粗酶液 5mL，60°C水浴保溫5min后，加入ImL 0. lmol/L的H2SO4終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。吸取2mL反應(yīng)液與0.5mL 0.5%稀碘液顯色，測定OD62tl值。與淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得反應(yīng)液淀粉濃度后計算酶活力。酶活力單位定義(U/mL)在pH6.0、溫度60°C，5min水解可溶性淀粉Img 所需的酶量為1個酶活力單位。酶活力的計算公式(0· 1% -C&) XnXlOOO0.1%:底物濃度Cfi 反應(yīng)液淀粉濃度η:稀釋倍數(shù)1000 置換系數(shù)α -淀粉酶的酶回收率的測定方法步驟三分相后讀取上下液相的體積(Vt——上層液相體積和Vb——下層液相體積，mL)，用吸管吸取上層液相和下層液相液體各2mL于IOmL試管中，根據(jù)α -淀粉酶酶活力的測定方法進(jìn)行酶活的測定(Ut——上層液相中α-淀粉酶酶活力和Ub——下層液相中 α -淀粉酶酶活力，U/mL)。相比R = Vt/Vb，分配系數(shù)Ka = Ut/Ub，α -淀粉酶的酶回收率 Yt = RXKa/(1+R) X 100%經(jīng)檢測本實(shí)施方式的α -淀粉酶的酶回收率為85. 124%，所獲得的α -淀粉酶純度高達(dá)98% [RZ(酶的純度)=A360A420 = 3. 2]以上、雜質(zhì)少。本實(shí)施方式PEG/(NH4)2SO4I水相中PEG1500的濃度為34%，降低了 PEG1500的使用量，并大幅提高了 α-淀粉酶的酶回收率。
權(quán)利要求
1.雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法，其特征在于雙水相萃取分離α-淀粉酶按以下步驟進(jìn)行一、制備真菌α-淀粉酶粗酶液；二、配制PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2SO4雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇 1500、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和余量的去離子水組成；三、按真菌α-淀粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合，再調(diào)節(jié)PH值為6. 5，然后室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/(NH4)2SO4雙水相的上層液相與質(zhì)量濃度為35%的(NH4)2SO4水溶液構(gòu)成雙水相純化體系，進(jìn)行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液透析濃縮，即得到α “淀粉酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法，其特征在于步驟一中用米曲霉2197、米曲霉ZLA16、米曲霉ZLB35、米曲霉ZLC06、米曲霉ZLD14、米曲霉ZLE09 或米曲霉ZLF13發(fā)酵真菌α -淀粉酶粗酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法，其特征在于步驟四中取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用PEG6000透析濃縮。
全文摘要
雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法，它涉及一種分離純化α-淀粉酶的方法。它解決了目前采用硫酸銨鹽析法、離心噴霧干燥法等分離淀粉酶的方法存在樣品回收率低、分離材料或設(shè)備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題，以及經(jīng)硫酸銨鹽析法分離方法得到的α-淀粉酶含有較多雜質(zhì)，效價低，且不能直接應(yīng)用于食品工業(yè)中的缺陷。雙水相萃取分離純化α-淀粉酶的方法一、制備真菌α-淀粉酶粗酶液；二、配制PEG/(NH4)2SO4雙水相；三、萃取；四、純化。本發(fā)明方法用于分離純化α-淀粉酶。
文檔編號C12N9/30GK102220300SQ20111015549
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者凌宏志, 宋剛, 平文祥, 葛菁萍, 董海麗 申請人:黑龍江大學(xué)